DE2823353A1

DE2823353A1 - Verfahren zum reinigen von urokinase

Info

Publication number: DE2823353A1
Application number: DE19782823353
Authority: DE
Inventors: Yasuo Bai; Shigeo Ogino; Hideki Yanagi; Junichi Yoshikawa
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1977-06-03
Filing date: 1978-05-29
Publication date: 1978-12-21
Also published as: FR2393006B1; DK248678A; US4189350A; JPS5935B2; CA1102263A; JPS542396A; FR2393006A1; DK147266C; GB1556652A; IT7849692A0; DK147266B

Description

- 2 Beschreibung

Verfahren zum Reinigen von Urokinase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen von Urokinase, insbesondere ein Verfahren zur Rückgewinnung hochreiner Urokinase in hoher Ausbeute (unabhängig von der Reinheit der verwendeten Rohurokinase) aus einer Roh-

urokinase enthaltenden Lösung, der vorher so viel Harnmolare stoff zugesetzt wurde, daß die Endharnstoffkonzentration in der Lösung 3 - 8 m beträgt. Bei diesem Verfahren wird die Rohurokinase (und Harnstoff) enthaltende Lösung mit einem auf die NH. - Type eingestellten, stark sauren Kationenaustauscher mit Sulfonsäuregruppen zur spezifischen Adsorption der Urokinase an den Austauscher in Berührung gebracht, worauf die adsorbierte Urokinase aus dem Austauscher eluiert wird.

Urokinase ist ein Enzym, daß das fibrinolytische Enzym Plasmin aus Plasminogen entstehen lassen kann. Bekanntlich eignet sich diese Substanz nicht nur zur Behandlung der verschiedensten Arten von Thrombosen, sondern auch bei gemeinsamer Verwendung mit karzinostatischen Mitteln zu einer beträchtlichen Verstärkung der Wirksamkeit letzterer Mittel. Aus Humanurin isolierte Urokinase ist frei von schädlichen Nebenwirkungen, z.B. einer Antigen/Antikörper-Reaktion, und gelangt ganz allgemein mit großem Erfolg zum Einsatz.

Zur Reinigung von Rohurokinase wurden bereits die verschiedensten Verfahren durchgeführt. Bei diesen Verfahren

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gelangten beispielsweise die verschiedensten Arten schwach saurer Kationenaustauscher oder schwach basischer Anionenaustauscher oder Gelfiltrationsmittel, zum Beispiel vernetztes Dextran, zum Einsatz. Keines der bekannten Verfahren genügt jedoch hinsichtlich Ausbeute und Reinheit des Urokinase-Produktes den gestellten Anforderungen, so daß ein stetiger Bedarf nach besseren Verfahren besteht.

Erfindungsgemäß hat es sich nun überraschenderweise gezeigt, daß sich Rohurokinase dann besser in größerer Ausbeute reinigen läßt, wenn man einer Rohurokinase enthaltenden Lösung so viel Harnstoff zusetzt, daß es in°Encifeonzentration in der Lösung 3-8 m beträgt, wenn man die derart modifizierte Lösung in einem stark sauren Kationenaustauscher, der Sulfonsäuregruppen aufweist und auf die NH₄ ⁺ - Type eingestellt ist, zur spezifischen Adsorption der Urokinase an dem Ionenaustauscher in Berührung bringt (wobei eine beträchtliche Abnahme der Menge an nicht adsorbierter Urokinase im Vergleich zu einem Fall, in dem der Rohurokinase enthaltenden Lösung kein Harnstoff zugesetzt wurde, zu verzeichnen ist) und wenn man schließlich die an den Ionenaustauscher adsorbierte Urokinase mit einer alkalischen Lösung oder einer sonstigen Salzlösung aus dem Austauscher eluiert. Hierbei erhält man eine gereinigte Urokinase praktisch konstanter und höherer spezifischer Aktivität in größerer Ausbeute, und zwar unabhängig von der Reinheit der Rohurokinase.

Die erfindungsgemäß verwendeten stark sauren Kationenaustauscher mit Sulfonsäuregruppen erhält man durch Einführen von Sulfonsäuregruppen in Kunstharze mit dreidimensionaler Netzstruktur, zum Beispiel Polystyrolharze oder Phenol/Formalinharze (z.B. die Handelsprodukte Dowex 5OW der Fa. Dow Chemical Company, Amberlite IR-120B, CG-120 und dergl. der Firma Rohm & Haas Company, und Duolite C-20 der Firma Diamond Shamrock Company) oder durch Einführen von Sulfoäthyl- oder Sulfopropylgruppen

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in Cellulose oder vernetztes Dextran (beispielsweise SE-Cellulose der Firma Serva Entwicklungslabor oder SP-Sephadex der Firma Pharmacia Fine Chemicals).

Die erfindungsgemäße Reinigung der Urokinase läuft wie folgt ab:

Eine auf einen pH-Wert von 4-9, vorzugsweise von 6-8 eingestellte, Rohurokinase enthaltende Lösung wird vorher

molare mit so viel Harnstoff versetzt, daß dessen Endkonzentration in der Lösung 3 - 8 m beträgt. Danach wird die Harnstoff haltige Lösung zur spezifischen Adsorption der Urokinase an dem Kationenaustauscher mit einem auf die NH₄ ⁺ - Type eingestellten, stark sauren Kationenaustauscher mit Sulfonsäuregruppen in Berührung gebracht. Ein derartiges Inberührungbringen läßt sich entweder chargenweise oder in einer Säule durchführen. Die Einstellung des Kationenaustauschers auf die NH₄ ⁺ - Type erreicht man in üblicher bekannter Weise, d.h. eine Ammoniumchloridlösung wird mit dem Kationenaustauscher in Form der H⁺ - Type in Berührung gebracht. Nachdem durch pH-Messung sichergestellt ist, daß sämtliche H⁺ - Ionen durch NH. - Ionen ersetzt sind, wird der Austauscher mit destilliertem Wasser gewaschen. Die erforderliche pH-Einstellung der Rohurokinase enthaltenden Lösung erreicht man mit Hilfe einer Pufferlösung, z.B. einer Phosphatpufferlösung. Der die Urokinase adsorbiert enthaltende Kationenaustauscher wird mit Wasser oder einer schwach konzentrierten Salzlösung gewaschen, um - abgesehen von der Urokinase - den Hauptteil der Verunreinigungen, einschließlich von Harnstoff, zu entfernen. Danach läßt sich die an dem Ionenaustauscher adsorbierte Urokinase ohne Schwierigkeiten eluieren. Zu diesem Zweck kann als alkalische Lösung verdünntes wässriges Ammoniak oder eine Pufferlösung eines pH-Werts von 10 - 12 verwendet werden. Als Salzlösung eignet sich beispielsweise eine Ammoniumchloridlösung.

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Es ist ferner möglich, eine ein Salz, z.B. Ammoniumchlorid, enthaltende alkalische Lösung eines pH-Werts von 8 - 12 zu verwenden.

Ein Vergleich zwischen einem Fall, in dem der Rohurokinase enthaltenden Lösung erfindungsgemäß Harnstoff zugesetzt ist, und einem Fall, in dem der Rohurokinase enthaltenden Lösung kein Harnstoff zugesetzt wurde, ergibt sich aus dem folgenden Vergleichsbeispiel. Hierbei wird als stark saurer Kationenaustauscher mit SuIfonsäuregruppen das Handelsprodukt Dowex 5OW χ 8 verwendet. Die Urokinaseaktivität wird mittels der Ploug¹sehen Fibrinplatten-Methode ermittelt (Ploug und Mitarbeiter "Biochim. Biophys. Acta" Band 24, Seite 278 (1957)).

Vergleichsbeispiel

4 ml einer Lösung mit 11900 IU (internationalen Einheiten) Rohurokinase einer spezifischen Aktivität von 820 IU/mg Protein, die vorher in eine 0,1 m Phosphatpufferlösung eines pH-Werts von 6,5 mit 0,1 m Natriumchlorid dialysiert worden war, wird mit 1,2 g bzw. 2,0 g Harnstoff versetzt. Ferner wird die gleiche Lösung ohne Harnstoffzusatz zubereitet. Jede der erhaltenen Lösungen wird zur Adsorption der Urokinase durch eine Säule, die mit 5 ml des auf die NH. Type eingestellten Handelsprodukts Dowex 5OW χ 8 beschickt war, laufengelassen. Danach wird die Säule mit 25 ml destilliertem Wasser gewaschen. Schließlich wird die Urokinase mit 3 ml 4%igem wässrigem Ammoniak gewaschen. Die Eigenschaften der erhaltenen Urokinase ergeben sich aus der folgenden Tabelle.

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- 6 Tabelle

Zugesetzte Harnstoffmenge

Nicht-adsorbierte Urokinase

Eluierte Urokinase

• -Spezifische
Aktivität
IU/mg

³rozentuale iückgewinnung

1,2

2,0

20,3 6,1 4,6

8 990
15 500
17 100

66,0 81,0 74,3

Die Ergebnisse des Vergleichsbeispiels zeigen, daß der erfindungsgemäße Harnstoffzusatz zu der Rohurokinase enthaltenden Lösung deutlich die Menge an nicht-adsorbierter Urokinase sinken läßt und die spezifische Aktivität und die prozentuale Rückgewinnung an eluierter Urokinase erhöht.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

26,3 g Harnstoff werden nach und nach in 54 ml einer Lösung mit 314.000 IU Rohurokinase mit einer spezifischen Aktivität von 1.080 IU/mg Protein, die vorher gegen eine Phosphatpufferlösung eines pH-Werts von 6,5 mit 0,1 m Natriumchlorid dialysiert worden war, eingetragen. Die erhaltene Lösung wird durch eine Säule (2,8 Durchmesser χ 25 cm), die mit dem auf die NH₄ ⁺- Type eingestellten Handelsprodukt Dowex 5OW χ 8 (200 - 400 Mesh) beschickt war, laufengelassen, um die Urokinase zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit 900 ml destilliertem Wasser werden zur Eluierung der Urokinase durch die Säule 160 ml 4%igen wässrigen Ammoniaks fließen gelassen. Die Fraktion mit Urokinaseaktivität wird aufgefangen. Die erhaltene Urokinase besitzt eine Gesamtaktivität von 235.000 IU und eine spezifische

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Aktivität von 18.200 IU/mg Protein. Gegenüber Rohurokinase beträgt ihre Reinheit das 16,9-fache. Die Rückgewinnung an Aktivität beträgt 74,8 %.

Beispiel 2

87,8 g Harnstoff werden in 180 ml einer Lösung mit 298.000 IU Rohurokinase einer spezifischen Aktivität von 560 IU/mg Protein, die entsprechend Beispiel 1 dialysiert worden war, eingetragen. Die erhaltene Lösung wird durch eine Säule (2,8 Durchmesser χ 25 cm), die mit dem auf die NH₄ ⁺ - Type eingestellten Handelsprodukt Dowex 5OW χ 8 (200 - 400 Mesh) beschickt war, laufengelassen, um die Urokinase zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit 900 ml destilliertem Wasser wird die Urokinase mit 160 ml 4%igem wässrigem Ammoniak eluiert. Die Fraktion mit Urokinaseaktivität wird aufgefangen. Die erhaltene Urokinase besitzt eine Gesamtaktivität von 239.000 IU und eine spezifische Aktivität von 17.000 IU/mg Protein. Ihre Reinheit beträgt, bezogen auf die Rohurokinase, das 30,4-fache. Die Rückgewinnung an Aktivität beträgt 80,2 %.

Die Ergebnisse zeigen, daß selbst bei Verwendung einer Rohurokinase der etwa halben spezifischen Aktivität der Rohurokinase des Beispiels 1 eine gereinigte Urokinase gewonnen werden kann, die praktisch die gleiche hohe spezifische Aktivität aufweist wie die gereinigte Urokinase des Beispiels 1.

Beispiel 3

53,6 g Harnstoff werden in 110 ml einer Lösung mit 140.000 IU Rohurokinase einer spezifischen Aktivität von 660 IU/mg Protein, die vorher entsprechend Beispiel 1 dialysiert worden war, eingetragen. Die erhaltene Lösung wird durch

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eine Säule (2,8 Durchmesser χ 25 cm), die mit dem auf die NH.⁺-Type eingestellten Handelsprodukt Duolite C-20 beschickt war, fließengelassen, um die Urokinase zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit 750 ml destilliertem Wasser wird die Urokinase mit 150 ml 4%igem wässrigem Ammoniak eluiert. Die Fraktion mit Urokinaseaktivität wird aufgefangen. Die erhaltene Urokinase besitzt eine Gesamtaktivität von 96.600 IU und eine spezifische Aktivität von 13.600 IU/mg Protein. Ihre Reinheit beträgt, bezogen auf Rohurokinase, das 20,6-fache. Die Rückgewinnung an Aktivität beträgt 69,0 %.

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Claims

Henkel, Kern, Feiler & HSnzeE Patentanwälte Möhlstraße 37 D-8000 München 80 Tel.: 089/982085-87 σ .. ην. ■ ι η τ- -4. j Telex: 0529802 hnkld Sumitomo Chemical Company, Limited Telegramme:ellipsoid Osaka, Japan A 3078-04 Dr. F/Ho 29. Hai 19FB Patentansprüche

1. Verfahren zum Reinigen von Urokinase durch Inberührungbringen einer Rohurokinase enthaltenden Lösung mit einem auf die NH. - Type eingestellten, stark sauren Kationenaustauscher mit Sulfonsäuregruppen zur Adsorption der Urokinase und anschließendes Eluieren der adsorbierten Urokinase aus dem Austauscher, dadurch gekennzeichnet, daß man der Rohurokinase enthaltenden Lösung vorher

molare

so viel Harnstoff zusetzt, daß die Endharnstoffkonzentration in der Lösung 3 - 8 m beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Rohurokinase enthaltenden Lösung im Bereich von 4-9 hält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kationenaustauscher ein Sulfonsäuregruppen enthaltendes Polystyrol- oder Phenol/Formaldehyd-Harz oder eine Cellulose oder vernetztes Dextran mit Sulfoäthylgruppen oder Sulfopropylgruppen verwendet.

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