DE2616761C3

DE2616761C3 - Verfahren zur Gewinnung von Urokinase

Info

Publication number: DE2616761C3
Application number: DE2616761A
Authority: DE
Inventors: Sumiyama Hiroshi; Masaharu Urakawa
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co ltd
Priority date: 1975-04-18
Filing date: 1976-04-15
Publication date: 1978-11-02
Also published as: JPS5315155B2; JPS51123885A; FR2307818B1; GB1492922A; DE2616761B2; DE2616761A1; US4025390A; FR2307818A1

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Urokinase aus Urokinase enthaltenden Lösungen.

Urokinase ist ein Plasminogen-Aktivator, der in Spurenmengen im menschlichen Urin vorkommt Sie ist ein potentes Auflösemittel für Blutpfropfen bzw. Blutgerinnsel, und hochgereinigte Urokinase wurde klinisch für die Behandlung von thromboembolischen Störungen bzw. Zuständen verwendet

Zur Gewinnung von Urokinase aus einer Urokinase enthaltenden Lösung, wie Urin, werden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, wie die Ultrafiltration, das Präzipitationsverfahren mit einer Schwermetallverbindung (US-PS 29 61 382), das Adsorptionsverfahren mit Silikagel, mit Ionenaustauschern (US-PS 29 83 647) usw. Diese Verfahren ergeben jedoch keine Urokinase hoher &o Reinheit in hohen Ausbeuten.

Die DE-OS 21 43 816 beschreibt ein Verfahren zum Extrahieren von Urokinase, in dem Urokinase enthaltende Lösungen mit synthetischen Acrylnitrilfasern in Kontakt gebracht und dann die adsorbierte Urokinase von diesen Fasern durch Eluieren abgetrennt wird. Die nach dem Verfahren der genannten DE-OS gewonnene Urokinase konnte jedoch gemäß den japanischen Patentanmeldungen Sho-50-70583/1975 und Sho-50-160473/1975 hinsichtlich spezifischer Aktivität und Ausbeute nicht befriedigen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung von Urokinase zur Verfugung zu stellen, bei dem eine Urokinase von hobei spezifischer Aktivität und großer Ausbeute erhalten wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst daß man eine Urokinase enthaltende Lösung bei einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 7,5 in Kontakt mil mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Cyanoalkyl-polysaccharid, Cyanoalkyl-modifiziertes-polysaccharid und Cyanoalkyl-polyvinylalkohol zur Adsorption der Urokinase bringt und dann die Urokinase aus dem Adsorptionsmittel eluiert

Wie die Anmelderin überraschenderweise gefunder hat, kann Urokinase selektiv durch Cyanoalkyl-polysaccharid, Cyanoalkyl-modifiziertes-polysacchariilidie beide im folgenden als CAS abgekürzt werden) odei Cyanoalkyl-polyvinylalkohol (der im folgenden als CAF abgekürzt wird) adsorbiert werden.

In der vorliegenden Erfindung ist eine Urokinase enthaltende Lösung beispielsweise Urin oder eine teilweise gereinigte, unreine Lösung ais Urokinase, wie eine Lösung, die man bei bekannten Reinigungsverfahren, wie oben beschrieben, erhält

Die Adsorptionsmittel, die erfindungsgemäß für die Gewinnung der Urokinase verwendet werden, sind Cyanoalkylpolysaccharide, wie Cyanoalkyl-cellulose Cyanoalkyl-dextran usw, Cyanoalkyl-modifizierte-polysaccharide, wie Cyanoalkyl-dextran, vernetzt mil Epichlorhydrin usw, und Cyanoalkylpolyvinylalkohol Cyanoalkyl-polysaccharid oder modifiziertes Polysaccharid oder Cyanoalkyl-polyvinylalkohol leitet sich vor Polysaccharide modifiziertem Polysaccharid bzw. Polyvinylalkohol ab und können in an sich bekannter Weise z. B. durch Cyanoäthylierung dieser Verbindungen mil Acrylnitril oder Methacrylnitril in Anwesenheit eines Alkalis als Katalysator, hergestellt werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten CAS und CAP sind beide wasserunlöslich. Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet eine Cyanoalkylgruppe, eine Cyanoniedrig-alkylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen einschließlich dem Kohlenstoffatom der Cyanogruppe Beispiele solcher Gruppen sind eine Cyano-methylgruppe (-CH₂CN), eine Cyanoäthylgruppe (-CH₂CH₂CN) eine 2-CyanopropyIgruppe

CH,\

-CH₂-CH

CN/

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Urokinase enthaltende Lösung in Kontakt mit CAS oder CAP gebracht, so daß Urokinase selektiv adsorbiert wird. Zu diesem Zeitpunkt wird der pH-Weri der Lösung auf 43 bis 73, bevorzugt 5,0 bis 63 eingestellt. Zur besseren Gewinnung der Urokinase au: Urin kann man den Urin vorbehandeln, indem man der pH-Wert auf 73 bis 93 einstellt und den entstehenden Niederschlag vor der Behandlung des Urins mit CAS oder CAP entfernt

Zur Eluierung der an dem Adsorptionsmittel adsorbierten Urokinase wird eine wäßrige Lösung eine;

Alkalis oder einer basischen Verbindung verwendet. Beispiele von Alkali- oder basischen Verbindungen sind Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniak. Bevorzugt wird das Absorptionsmittel einem Hutionsverfahren unterworfen, wobei das Elutionsmittel eine wäßrige Lösung mit solchem pH-Wert ist, daß das entstehende Eluat einen pH-Wert zwischen 9 und 11,5 besitzt Da eine wäßrige Lösung aus Ammoniak Urokinase stabilisiert, ist sie als Eluierungsmittel geeignet Es ist bevorzugt sie in einer Konzentration von etwa 4 Gew.-% zu verwenden. Nach bekannten Verfahren wird das Eluat neutralisiert mit Natriumsulfat Ammoniumsulfat, Natriumchlorid usw. ausgesalzt (oder der isoelektrischen Präzipitation unterworfen), damit Urokinase ausfällt dialysiert und gefriergetrocknet wobei man Urokinase in fester Form erhält

Wie oben beschrieben und wie im folgenden näher erläutert wird, wird erfindungsgemäß ein neues Verfahren geschaffen, mit dem Urokinase in hoher Ausbeute und Reinigt mit einer geringen Menge eines neuen Adsorptionsmittels, CAS oder CAP₁ erhalten wird. Die erfindungsgemäßen Adsorptionsmittel können wiederholt verwendet werden, und sie sind somit wirtschaftlich. Die vorliegende Erfindung kann zur Gewinnung von Urokinase nicht nur aus Urin selbst sondern ebenfalls aus irgendeiner anderen Urokinase enthaltenden Lösung verwendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

Zu 1001 frischem menschlichem Urin, erhalten von normalen Personen, gibt man eine 40%ige Lösung aus Natriumhydroxid zur Einstellung des pH-Wertes des Urins auf 8,5. Der entstehende Niederschlag wird entfernt und der pH-Wert der überstet snden Lösung wird mit 6 N-Chlorwasserstoffsäure auf 6,0 eingestellt Zu der Lösung gibt man 200 g Cyanoäthyl-cellulose. Diese wird erhalten, indem man cyanoäthyliertes Papier in Wasser eintaucht dieses in einer Mischvorrichtung vermischt bis es zu Pulpe zerkleinert wird, ausreichend mit Wasser wäscht und entwässert Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt und dann wird die Cyanoäthyl-cellulose durch Zetrifugieren abgetrennt Die so erhaltene Cyanoäthylcellulose wird dann in 31 einer 4%igen wäßrigen Ammoniaklösung zur Elution der adsorbierten Urokinase gegeben. Das Eluat wird mit 6 N-Schwefelsäure neutralisiert und Ammoniumsulfat wird bis zur 60%igen Sättigung zugegeben. Nach dem Stehen über Nacht bei 4° C wird der Niederschlag gesammelt in destilliertem Wasser gelöst und gegenüber Wasser bei 4° C fiber Nacht dialysiert Die dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet und man erhält 1 · 10⁴ I. E Urokinase/! Ausgangsurin insgesamt; dies entspricht einer 90%igen Ausbeute, bezogen auf die Menge an Urokinase in dem Ausgangsurin (berechnet entsprechend dem in der Literatur angegebenen Urokinase-Gehalt); die spezifische Aktivität beträgt 3000 I. E/mg (LE ist die Abkürzung Für Internationale Einheit).

Beispiel 2

Der pH-Wert von 1001 frischem menschlichem Urin, wie er in Beispiel I verwendet wurde, wird mit einer 40%igen Lösung aus Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt Der entstehende Niederschlag wird entfernt und der pH-Weit der restlichen Lösung wird mit 6 N-Chlorwasserstoffsäure auf 6,0 eingestellt Anschließend gibt man dazu 200 g Cyanoäthylpolyvinylalkohol,

ίο der durch Cyanoäthylierung von Polyvinylalkohol mit Acrylnitril in Anwesenheit von Natriumhydroxid als Katalysator erhalten wird. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt Der Cyanoäthylpolyvinylalkohol, der Urokinase adsorbiert, wird gesammelt und in 31 einer 4%igen wäßrigen Ammoniaklösung zur Elution der adsorbierten Urokinase gegeben. Das Eluat wird mit 6 N-Schwefelsäure neutralisiert und Ammoniumsulfat wird bis zur 6C%igen Sättigung zugegeben. Nach dem Stehenlassen über Nacht bei 4° C wird der Niederschlag gesammelt in 50 ecm destilliertem Wasser gelöst und gegenüber Wasser bei 4° C über Nacht dialysiert Die dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet und man erhält 9,4 · 10³ LE Urokinase/1 Ausgangsurin; dies entspricht einer 85%igen Ausbeute; die spezifische

Aktivität beträgt 35001. E/mg. Vergleichsbeispiel A

Der pH-Wert von 21 otenschlichem Urin, wie er in Beispiel 1 verwendet wurde, wird mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt Nach Entfernung des entstehenden Niederschlags wird der pH-Wert der restlichen Lösung auf 6,0 eingestellt Die Lösung wird dann mit 20 ml Silikagel zur Gewinnung der Urokinase behandelt Das Silikagel wird ausreichend mit Wasser gewaschen, und dann wird die adsorbierte Urokinase eluiert und gewonnen. Die gewonnene Menge an Urokinase beträgt 83 · 10³LE/! Ausgangsurin; dies entspricht einer 80%igen Ausbeute. Die spezifische Aktivität beträgt 12001. E/mg.

Vergleichsbeispiel B

Zu 21 menschlichem Urin, wie er in Beispiel 1 verwendet wurde, gibt man 100 ml 50%ige wäßrige Zinkchloridlösung, und dann wird der entstehende Niederschlag durch Zentrifugieren gesammelt Zu dem Niederschlag gibt man 200 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung aus Natriumphosphat (monobasisch), und das Gemisch wird dann gerührt; man erhält einen Niederschlag aus Zinkphosphat Das Zinkphosphat wird

so abfiltriert und das Firtrat wird konzentriert und gefriergetrocknet; man erhält Urokinase in fester Form. Die Menge an gewonnener Urokinase beträgt 1,06 ■ 10⁴ I. E/l Ausgangsurin; dies entspricht einer 95°/oigen Ausbeute. Die spezifische Aktivität beträgt 3,51. E/mg.

Aus den obigen Ergebnissen ist erkennbar, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Urokinase eine extrem hohe spezifische Aktivität besitzt, verglichen mit der, die man bei den bekannten Verfahren erhält. Die Gewinnung an Urokinase ist ebenfalls sehr hoch.

Claims

Patentansprüche:

t. Verfahren zur Gewinnung von Urokinase, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Urokinase enthaltende Lösung bei einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 7,5 in Kontakt mit mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Cyanoalkyl-polysaccharid, Cyanoalkyl-modifiziertes-polysaccharid und Cyanoalkyl-polyvinylalkohol zur Adsorption der Urokinase bringt und dann die Urokinase aus dem Adsorptionsmittel eluiert
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Cyanoalkyl-polysaccharid und Cyanoalkyl-modiffadertes-polysaccharid Cyanoalkyl-cellulose, Cyanoalkyl-dextran und Cyanoalkyldextran, vernetzt mit Epichlorhydrin, verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Cyanoalkylgruppe eine Cyano-niedrig-alkylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen einschließlich des Kohlenstoffatoms der Cyanogruppe ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Cyano-niedrig-alkylgruppe eine 2s Cyanoäthylgruppe ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert 5,0 bis 6,5 beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Elutionsvorgang unter Verwendung einer wäßrigen Alkalilösung als Elutionsmittel mit einem solchen pH-Wert daß das entstehende Eluat einen pH-Wert von 9 bis 11,5 besitzt durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet daß man als Alkalilösung eine ungefähr 4 gew.-%ige wäßrige Ammoniaklösung verwendet.