DE2143816C3 - Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Urokinase - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von menschlicher UrokinaseInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Urokinase aus Urokinase
enthaltenden Flüssigkeiten durch Bindung der Urokinase an ein Adsorbens und durch Elution der
Urokinase von dem Adsorbens.
Urokinase ist bekanntlich ein Enzym, das in kleinen Mengen in menschlichem Harn vorkommt und
sich als wirksam zur Behandlung verschiedener Formen von Thrombosen erwiesen hat, da es, wenn es
intravenös injiziert wird, pathologisch gebildetes Fibrin oder fibrinöse Koagulationen, die die Blutgefäße
verstopfen, lösen kann.
Zur Gewinnung von Urokinase aus menschlichem Harn nach dem Verfahren der eingangs genannten
Art sind verschiedene absorbierende Materialien bekannt, wie beispielsweise Schwermetalle, Bariumsulfat,
Kieselsäure und deren Salze und verschiedene Ionenaustauscher. So ist die Verwendung von Bariumsulfat
aus J. Lab. & CHn. Med. 44, S. 944 (1954) und der japanischen Patentpublikation Sho 44-8064
(1969) bekannt. Die Verwendung von Silicagel ist aus Biochim. Biophys. Acta, 24, S. 278 (1957), der
britischen Patentschrift 802 326 und der japanischen Patentpublikation Sho 34-547 (1959) bekannt. Die
Verwendung von Cellulosephosphat ist aus Vox Sang., 7, S. 739 (1962) und der japanischen PatentpubliUation
Sho 42-8911 bekamt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens, das wirksamer als die bisherigen
ist. Es wurde nun ein Verfahren gefunden, das wirksamer als alle bekannten Verfahren und einfach
durchzuführen ist und sich zur Gewinnung von gereinigter Urokinase in industriellem Maßstab eignet.
Das Verfahren der eingangs genannten Art ist nun erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man
bei einem pH-Wert der Flüssigkeit zwischen 4,8 bis 7,5, vorzugsweise zwischen 5,5 bis 6,5, als Adsorbens
ein synchronisches Acrylnitrilfaserm enthaltendes Material einsetzt.
In vorteilhafter Weise kann die Elution der adsorbierten
Urokinase mit einer alkalischen Lösung vorgenommen werden.
Dem erfindungsgemäß verwendeten Adsorbens 6;
sind aber auch Acrylnitrilfasern und Stoffe aus diesen Fasern äquivalent. Acrylnitritrilfasern oder Stoffe
daraus sind ebenfalls im Handel erhältlich.
Das erfindungsgemäß zu verwendende synthetische Acrylnitrilfasern enthaltende Material ist so billig
und so leicht zugänglich, daß es nach dem Gebrauch weggeworfen werden kann, und es erfordert keine
Vorbehandlung vor der Verwendung. Wenn es jedoch erwünscht ist, kleine Flecken von der Faser zu
entfernen, so kann dieser Zweck einfach durch vorhergehendes Eintauchen der Faser in Wasser und
Bewegen in diesem erreicht werden. Wenn Luftblasen, die zwischen den Fasern eingeschlossen sind,
vor dem Inkontaktbringen der Fasern mit dem Harn entfernt werden sollen, so kann dies mit einer ähnlichen
Behandlung erreicht werden.
Da die Fn^ern in kleinen Mengen ausreichend
wirksam sind und die an diesen Fasern adsorbierte Urokinase leicht abgetrennt werden kanr, ist das erfindungsgemäße
Verfahren wirtschaftlich jedem der bekannten Verfahren überlegen.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß der Arbeitsaufwand für das
Sammeln von Harn herabgesetzt wird oder wegfallen kann.
So kann insbesondere die große Arbeit, die zum Sammeln von Harn erforderlich ist, durch das einfache
Sammeln kleiner leichter Acrylnitrilfasern, die in den Urinalen liegen oder einen Teil der Abflußleitung,
die mit dem Boden des Urinals verbunden ist, füllen, ersetzt werden. Das erfindungsgemäße
Verfahren eignet sich somit außerordentlich gut für die industrielle Extraktion von Urokinase.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist im wesentlichen das folgende: Menschlicher Harn wird in Kontakt
mit synthetischer Acrylnitrilfasern gebracht, um Urokinase aus dem Harn an den Fasern zu adsorbieren,
die herausgenommen werden, um zur Entfernung des restlichen Harns mit Wasser gewaschen
zu werden. Die Elution erfolgt dann unter Verwendung einer alkalischen Lösung. Da die Harnzusammensetzung
durch die Aufnahme von Nahrung oder Wasser, die Bewegung, die Zeit oder klimatische
Einflüsse stark beeinflußt wird, ist es schwierig, einen normalen pH-Wert für den Harn festzulegen, doch
kann angenommen werden, daß dieser im allgemeinen zwischen 4,8 und 7,5 liegt (Hidenobu Majima,
»Physiology«, Bunkodo, 1968). In diesem pH-Bereich von 4,8 bis 7,5 kann Urokinase an synthetische
Acrylnitrilfasern adsorbiert werden, doch ist für höhere Ausbeuten ein pH-Bereich von 5,5 bis 6,5
zu bevorzugen. Wenn beispielsweise zur Elution der adsorbierten Urokinase eine wäßrige 4°/oige Ammoniaklösung
verwendet wird, so wird eine Elutionsrate von 940O erreicht.
Der Kontakt des Harns mit den synthetischen Acrylnitrilfasern wird wirksamer gemacht, indem das
obige Verfahren nach Behandlung des Harns bei Zimmertemperatur durch Einstellung seines pH-Wertes
auf 7,5 bis 9,5 oder vorzugsweise auf 8,5 und somit Entfernung der gebildeten Sedimente durchgeführt
wird.
Die erhaltene Urokinase enthaltende Lösung wird dann zu einem für medizinische Zwecke geeigneten
Präparat konzentriert oder gereinigt. Es ist bekannt, daß zur Konzentrierung die folgenden Methoden zur
Verfügung stehen: Aussalzen mittels Ammoniumsulfat, Sedimentation mittels eines organischen Lösungsmittels,
Verwendung eines Ultrafilters. Zur Reinigung können verschiedene Ionenaustauscher verwendet
werden, doch wird eine Urokinase hoher Reinheit
durch einen weiteren Kontakt mit synthetischen Acrylnitrilfasern erhalten.
Im folgenden soll die selektive Adsorption von Urokinase an synthetische Acrylnitrilfasern im einzelnen
gezeigt werden. Die nachfolgende Tabelle I zeigt die Ausbeuten an Urokinase aus verschiedenen
Fasern, die durch Inkontaktbringen von 2 g Fasern mit 3 I Harn mit einem pH-Wert von 6,0 erhalten
wurden. Die Fasern wurden mit Wasser gewaschen, und die Urokinase wurde dann unter Verwendung
einer wäßrigen 4°/oigen Ammoniaklösung eluiert.
.... | Hauptbeslandteil | Ausbeute (0O) |
|
Tabelle 1 | |||
Ausbeuten an Urokinase | Cellulose | 8 | |
Fasern | |||
Adsorbierende | Vinylchlorid | 15 | |
Baumwolle .... | |||
Synthetische | Acrylnitril | 89 | |
Vinylchloridfaser | |||
Synthetische | |||
Acrylnitrilfaser . | |||
Die Tabelle I zeigt die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens bezüglich der Ausbeute
an Urokinase.
Die folgende Tabelle II zei6t einen Vergleich zwischen
üblichen Verfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Vergleich zwischen üblichen Verfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren
Adsorptionsmedium | Ausheute | Spezifisch: Aktivität |
(Eng) | ||
Bariumsulfat | 70 | 800 |
Silicagel | 54 | 525 |
Cellulosephosphat | 79 | 310 |
Carboxymethylcellulose .. | 35 | 297 |
Schwach saures Kationen | ||
austauscherharz | 88 | 508 |
Synthetische | ||
Acrylnitrilfaser | 91 | 3800 |
Aus Tabelle II ist klar ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine höhere Ausbeute an
Urokinase als die üblichen Verfahren ergibt. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die bisher bekannten
sogenannten Adsorbentien nicht nur Urokinase sondern auch große Mengen von Verunreinigungen
adsorbieren, so daß die Reinheit des Elutionsproduktes gering ist, und die Bedeutung dieser Adsorbentien
lediglich in dem Herausholen der Urokinase aus dem Harn zu sehen ist.
Aus den Tabellen I und II ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren ein ausgezeichnetes
Verfahren ist, das sich nicht nur durch die Möglichkeit der Gewinnung in hohen Ausbeuten, sondern
auch durch eine hohe Selektive bezüglich der Urokinaseadsorption auszeichnet.
Die Urokinaseeinheiten wurden durch die Fibrinplattenmethode
nach Pioug und Mitarb. (J. Ploug,
Biochem. Biophys. Acta, Bd. 24, S. 278 [1957] bestimmt.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.
ίο Ein gesammeltes großes Volumen von frischem
Harn von vielen gesunden Personen wurde unter Rühren unter Verwendung einer 10", «igen Natriumhydroxydlösung
auf pH 8,5 eingestellt. Das erhaltene Sediment wurde abfiltriert oder durch Abzentrifugieren
entfernt. Dann wurde unter kräftigem Rühren 6n-SaIzsäure allmählich zur Einstellung auf pH
5,5 zugegeben. Unmittelbar anschließend wurden in einer Menge von 70 g 100 1 Harn unter kräftigem
Rühren synthetische Acrylnitrilfasern eingebracht.
Diese Fasern, die so in Kontakt mit dem Harn gebracht wurden, wurden in einen großen Trichter
überführt un.d mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser
farblos und klar war. Dann wurde das Waschwasser durch Abpressen entfernt. Anschließend
wurde die an den Fasern adsorbierte Urokinase unter Verwendung von 2 1 einer wäßrigen 4°/oigen Ammoniaklösung
durch Elution abgetrennt. Ammoniumsulfat wurde zu dem Eluat unter Rühren bis zu einer
Sättigung von 60% zugegeben. Nach Fortsetzung des Rührens für eine weitere Stunde wurde der Niederschlag
durch 30minütiges Abzentrifugieren bH 20 000 g abgetrennt, in 500 ml Wasser gelöst und
dann über Nacht einer r ialyse unter Verwendung der 100 fachen Menge Wasser unterzogen. Die so erhaltene
Lösung enthielt etwa 85" η der Uiokinase in
dem ursprünglichen Harn. Ihre spezifische Aktivität betrug etwa 24 000 E mg.
Unter kräftigem Rühren wurde 6n-Salzsäure allmählich zu einer rohen Urokinaselösung, die wie im
Beispiel I erhalten war, zur Einstellung auf pH 5,5 zugegeben. Unmittelbar danach wurden synthetische
Acrylnitrilfasern in die rohe Urokinaselösung in einer Menge von 100 g/l Lösung eingebracht, und es
wurde kräftig gerührt. Die anschließende Behandlung war die gleiche wie im Beispiel 1, und die Elution
wurde unter Verwendung von I 1 einer wäßrigen 4°/oigen Ammoniaklösung durchgeführt. Anschließend
wurde wie im Beispiel 1 aufgearbeitet.
Die schließlich erhaltene Lösung enthielt etwa 80% der Urokinase in der rohen Urokinaselösung.
Ihre spezifische Aktivität betrug über 13 000 E/mg.
100 g Kaolin wurden zu 100 1 frischem Harn, aus dem das Sediment durch Filtrieren abgetrennt worden
war, zugegeben, und das Gemisch wurde dann gründlich gerührt. Das Kaolin wurde durch Abzentrifugieren
gewonnen und gewaschen, bis die Waschflüssigkeit farblos und klar war. Anschließend wurde
die an dem Kaolin absorbierte Urokinase durch EIution unter Verwendung von 31 einer wäßrigen
4% igen Ammoniaklösung abgetrennt und dann über Nacht einer Dialyse unterzogen. Die so erhaltene
rohe Urokinaselösung wurde mit Gn-Salzsüuie auf
pH 5.5 eingestellt. 45 g Textilstückc aus synthetischen
Acrylnitrilfasern wurden dann unter gutem Rühren zugegeben. Anschließend wurde die gleiche
Arbeitsweise wie im Beispiel I durchgeführt. Die EIution wurde unter Verwendung von 1 1 einer wäßrigen
4"'»iaen Ammoniaklösung vorgenommen. Die anschließende
Behandlung war die gleiche wie im Beispiel 1.
Die so erhaltene Lösung enthielt etwa 75" ο der Urokinase in der rohen Lösung oder etwa 40"/o der
Urokinase in dem ursprünglichen Harn, wobei ihre spezifische Aktivität über 10 000 E/mg betrug.
Claims (2)
1. Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Urokinase aus Urokinase enthaltenden Flüssigkeiten
durch Bindung der Urokinase an ein Adsorbens und durch Elution der Urokinase von
dem Adsorbens, dadurch gekennzeichnet,
daß man bei einem pH-Wert der Flüssigkeit zwischen 4,8 und 7,5, vorzugsweise zwischen 5,5
und 6,5, als Adsorbens ein synthetische Acrylnitrilfasern enthaltendes Material einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution der adsorbierten
Urokinase mit einer alkalischen Lösung vornimmt.
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