AT264709B - Verfahren zur Herstellung von Urokinase für Injektionszwecke - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung von Urokinase für Injektionszwecke 
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur industriellen Gewinnung und Reinigung von Uro- kinase, welche so weitgehend gereinigt ist, dass sie aseptisch und frei von urokinetischenStoffen ist, so dass sie für Injektionszwecke völlig geeignet ist. 



   Urokinase ist ein Protein mit spezifischer enzymatischer Wirksamkeit und aktiviert als solches im Blut vorhandenes Plasminogen und besitzt die Eigenschaft, Plasmin zu bilden. Da Plasmin in der Lage ist, Fibringerinnsel aufzulösen und zu verflüssigen, können durch Injektion von Urokinase in den menschlichen Blutkreislauf im Zuge von Verletzungen in den Blutgefässen gebildete Fibringerinnsel oder fibrinartige Gerinnsel aufgelöst werden. Urokinase ist damit zur Behandlung verschiedener Arten von Thrombosen geeignet. Da erfindungsgemäss erhältliche Urokinase keine fremdartigen Proteine enthält, besteht auch nicht die Gefahr, dass im Blut durch Urokinase aus Plasminogen erzeugtes Plasmin fremdartige Eiweissstoffe enthält, so dass erfindungsgemäss erhältliche Urokinase ohne Gefahr irgendwelcher schädlicher Nebeneffekte klinisch verwendet werden kann. 



    Ploug J. und Kieldgaard, Biochem. & Biophys. Acta. Vol. 24, 278 [1957] berichteten bereits ilber die    Gewinnung von Urokinase aus menschlichem Harn. Im Rahmen dieses Verfahrens zur Herstellung von Urokinase wird der Urin unter Druck über eine mit Silicagel gefüllte Chromatographiersäule geleitet, worauf die Urokinase aus dem Silicagel mit wässerigem Ammoniak eluiert wurde. 



   Dieses bekannte Verfahren zur Herstellung von Urokinase ist nicht nur bei seiner industriellen Anwendung wegen der im Hinblick auf die geringen Strömungsgeschwindigkeiten erforderlichen extrem langen Kolonnen unwirtschaftlich, sondern führt auch wegen der langen Behandlungsdauer zu einer beträchtlichen Anreicherung des Urins an Bakterien und zur Bildung von pyrogenetischen Substanzen, womit die erhaltene Urokinase für Injektionszwecke ungeeignet wird. 



   Es wurde auch vorgeschlagen, Urokinase aus menschlichem Urin durchAusfrierenbei einem pH-Wert von 4,5 auszuscheiden, wie im "Symposium on Fibrinolysin" von Celander und Guest im Am. J. Card. 



  6,409 [1960] angegeben ist, jedoch wird hiebei eine nur in schwieriger Weise zu reinigende Urokinase erhalten. 



   Es ist auch vorgeschlagen worden, die im Urin enthaltene Urokinase durch Behandlung des Urins mit einem Adsorptionsmittel, anschliessendes Eluieren des Adsorbates, nochmaliges Adsorbieren der Urokinase aus der erhaltenen Lösung an einem synthetischen Kationenaustauscherharz und anschliessendes Eluieren des Kationenaustauscherharzes herzustellen, jedoch wird auch so keine, völlig von Nebenwirkungen freie Urokinase erhalten. 



   Die Erfindung bezweckt nun die Beseitigung der Nachteile der erwähnten bekannten Verfahren. Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Urokinase für Injektionszwecke, bei welchem unter Verwendung von   Anion- und Kationaustauschern   gearbeitet wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass in menschlichem Urin Sulfomethylzellulose verteilt, der pH-Wert des Urins auf 2,   5 bis 6, 0 eingestellt wird   und der sich nach Rühren absetzende Niederschlag an Sulfomethylzellulose, an welcher die Urokinase absorbiert ist, isoliert wird, worauf die Urokinase nach dem Waschen des Niederschlages aus diesem mittels einer wässerigen alkalischen Lösung eluiert wird und aus dem erhaltenen Eluatnach Ansäuern 

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 eine konzentrierte Lösung von Urokinase hergestellt wird,

   welche durch Entfernen färbender Bestandteile mittels einer Anionenaustauschzellulose und anschliessende Behandlung mit einer Kationenaustauschzellulose   zum Entfernen fremdartiger Eiweissstoffe gereinigt und sodann   dialysiert, filtriert und lyophilisiert wird. 



   Die im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens verwendete Sulfomethylzellulose besitzt die Fähigkeit, basische Proteine, beispielsweise Urokinase, leicht zu binden und kann darüber hinaus im Urin verteilt werden, wodurch es möglich wird, 500   l   Urin in etwa 3 h aufzuarbeiten. Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird somit, verglichen mit bekannten Verfahren zur Herstellung von Urokinase, beispielsweise dem in der oben angegebenen Literaturstelle beschriebenen Verfahren, die Arbeitszeit beträchtlich verkürzt, so dass die Gefahr des Entstehens pyrogenetischer Stoffe während der Behandlung des Urins weitgehend vermindert ist und dementsprechend die erhaltene Urokinase keine pyrogenetischen Stoffe enthält.

   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Reinigung der Urokinase ist besonders zuverlässig, da färbende Stoffe durch Anionenaustauschzellulose und fremdartige Eiweissstoffe durch Kationenaustauschzellulose entfernt werden. 



   Bei Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird der pH-Wert des mit Sulfomethylzellulose versetzten Urins zweckmässig bei Temperaturen von 2 bis 100C auf einen pH-Wert von 2,5 bis 6,0 gebracht. Das Eluieren der mit Urokinase beladenen Sulfomethylzellulose erfolgt zweckmässig mit einer verdünnten alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 8,0 bis 11,0, worauf aus der so erhaltenen Lösung nach dem Ansäuern die Urokinase durch Aussalzen mit Ammonsulfat oder einem andern neutralen Salz oder durch Zugabe organischer Lösungsmittel wie Äthanol, Aceton usw. ausgefällt wird. Der erhaltene Niederschlag an Urokinase wird sodann zweckmässig in einer alkalischen Lösung   mit einem PH- Wert   von 8,0 bis 11,0 aufgelöst und zwecks Entfernen färbender Bestandteile und fremdartiger Eiweissstoffe weiter aufgearbeitet. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren wird im folgenden an Hand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert. 
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 Urin gegeben, worauf der im Urin gut verteilten Sulfomethylzellulose bei einer Temperatur von 5 bis   120C   5n Salzsäure unter ausreichendem Rühren allmählich zugegeben wurden, bis sich ein pH-Wert von 2,0 bis 3,0 einstellte. Nach weiterem Rühren während 60 min wurde die erhaltene Mischung stehengelassen. 



   Nach dem Stehenlassen wurde der durchscheinende Urin dekantiert und der braun gefärbte Niederschlag abfiltriert oder zentrifugiert, worauf dieser Niederschlag mit einem 0,025 m Phosphatpuffer von einem pH-Wert 7,2 so lange gewaschen wurde, bis das Waschwasser farblos ablief. Der nach dem Waschen vorliegende Niederschlag war nahezu weiss. Der so behandelte Niederschlag wurde in 3% igem wässerigem Ammoniak suspendiert und filtriert, womit etwa 5   l   einer Urokinase enthaltenden Lösung als Filtrat erhalten wurden. 



   Durch allmähliche Zugabe von etwa 500 ml 5n Salzsäure zum Filtrat wurde der pH-Wert desselben auf 3,5 gebracht, worauf der nunmehr vorliegenden Lösung feinkörniges Ammonsulfat unter Rühren allmählich zugegeben wurde, bis die Konzentration der Lösung an Ammonsulfat 40   Gel.-%   betrug. Nach Zugabe des Ammonsulfat wurde weiters 2 h gerührt und der sich absetzende Niederschlag wurde abfiltriert oder abzentrifugiert und nochmals in   1% gem   wässerigem Ammoniak gelöst, worauf die erhaltene Lösung in einem 0, 005 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7, 0 dialysiert wurde.

   Nach abgeschlossener Dialyse wurde die nunmehr eingeengte Lösung der Urokinase über eine einen Innendurchmesser von 35 cm und eine Länge von 3,00 m besitzende Kolonne geleitet, welche mit Diäthylaminoäthylzellulose gefüllt war, die vorher mit einem 0, 005 m Phosphatpuffer mit einem PH-Wert von 7,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Es wurde so eine Lösung der Urokinase erhalten, welche frei von färbenden Bestandsteilen war. 



   Die nunmehr vorliegende Lösung von Urokinase wurde nach Dialyse gegen   0,005 m Acetatpuffer   mit einem pH-Wert von 3, 15 auf eine mit Carboxymethylzellulose, welche vorher mit einem 0, 005 m Acetatpuffer von einem pH-Wert von 3, 15 ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgegeben, worauf fremdartige Eiweissstoffe mit einem 0, 025m Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,7 und weiters mit einem an Natriumchlorid 0, 075m Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,0 eluiert wurden. 



   Die nach dem Eluieren der Urokinase aus der Kolonne erhaltene Lösung derselben wurde ausreichend gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert, zwecks Entfernung von Keimen filtriert und schliesslich lyophilisiert. Es wurden so etwa 100 mg einer aseptischen, von pyrogenetischen Stoffen freien Urokina- 

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 se erhalten. Entsprechend Kjeldgaardls Bestimmungsmethode (s. die oben genannte Literaturstelle) war die spezifische Aktivität der erhaltenen Urokinase etwa   1000 Jl/mg.  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung von Urokinase für Injektionszwecke unter Verwendung von Anionen- und Kationenaustauschern, dadurch gekennzeichnet, dass in menschlichem Urin Sulfomethylzellulose verteilt, der pH-Wert des Urins auf 2,5 bis 6,0 eingestellt wird und der sich nach Rühren absetzende Niederschlag an Sulfomethylzellulose, an welcher die Urokinase absorbiert ist, isoliert wird, worauf die Urokinase nach dem Waschen des Niederschlages aus diesem mittels einer wässerigen alkalischen Lösung eluiert wird und aus dem erhaltenen Eluat nach Ansäuern eine konzentrierte Lösung von Urokinase hergestellt wird, welche durch Entfernen färbender Bestandteile mittels einer Anionenaustauschzellulose und anschliessende Behandlung mit einer Kationenaustauschzellulose (zum Bitfernen fremd- artiger Eiweissstoffe) gereinigt und sodann dialysiert,

   filtriert und lyophilisiert wird.