DE1932527B2

DE1932527B2 - Verfahren zur Herstellung eines blut stillenden Präparates

Info

Publication number: DE1932527B2
Application number: DE19691932527
Authority: DE
Inventors: Yoshito Tokio Koyama Kenjiro Saitama. Takeda Yasuko Kashiwa Matsumoto, (Japan)
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1968-06-26
Filing date: 1969-06-26
Publication date: 1971-07-08
Also published as: FR2011689A1; DE1932527A1; US3761586A; DE1932527C3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines blutstillenden Präparates aus dem Gift einer Schlange der Gattung Trimeresurus.

Die sogenannte »Habu«-Schlange ist eine Giftschlange, die zu der Gattung Trimeresurus der Familie Crotalidae gehört. Als Beispiele für diese Gattung seien genannt: Trimeresurus flavoviridis, Trimeresurus okinavensis, Trimeresurus elegans, Trimeresurus tokarensis, Trimeresurus tinkami, Trimeresurus mucrosquamatus und Trimeresurus stejnegeri. Wenn nicht besonders angegeben, so sind unter dem Ausdruck »Habu« diese Schlangen gemeint.

Die Schlange »Habu« ist für ihre große Giftigkeit bekannt und ist auf den Tokarainseln und südlich davon beheimatet. Ihr Gift ist gefürchtet, da es bei Menschen und Tieren durch seine hämorrhagische und gewebenekrotische Wirkung tödlich wirkt.

Bei der Untersuchung der Giftwirkung des Gifts der »Habu«-Schlange wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine durch eine bestimmte Behandlung des Giftes erhaltene Substanz eine stark blutstillende Wirkung aufweist, die klinisch mit zufriedenstellendem Erfolg verwendet werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines blutstillenden Präparates, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ..'ine wäßrige, neutrale Lösung des Giftes einer Schlange der Gattung Trimeresurus mit einem organischen Lösungsmittel in an sich bekannter Weise extrahiert, die wäßrige Phase gegen destilliertes Wasser dialysiert, die dialy⁴·

ro sierte Lösung lyophilisiert, das erhaltene Produkt in Phosphatpuffer pH 7,4 löst, die Lösung auf ein Dextrangel mit einem Molgewicht-Fraktionierungsbereich von 1000 bis 50 000 gibt, die aktive Substanz mit Phosphatpuffer pH 7,4 fraktioniert eluiert, die Fraktionen sammelt, welche im Recalcinierungstest stark wirksam sind, lyophilisiert, das Produkt in Natriumacetatpuffer pH 7,1 löst, die Lösung auf einen basischen Ionenaustauscher gibt, die aktive Substanz mit Natriumacetatpuffer eluiert und die Fraktion mit der Wirkung im Recalcinierungstest gewinnt und gegebenenfalls lyophilisiert.

Das Verfahren der Erfindung ist in folgender Tabelle schematisch dargelegt.

Tabelle I

Wäßrige Lösung des rohen Giftes

Entfernung der Lipide

Zentrifugieren

F-I-A 1 wäßrige Phase |
F-I-B

Dialyse

I dialysierte Lösung!
Sephadex-Säulenchromatographie

organische Phase und Niederschlag

Waschen mit Wasser

Zentrifugieren

P-II

^P"^m

^P"^IV
±

—■{ wäßrige Phase |

blutkoagulierende Wirkung hämorrhagische Wirkung

Niederschlag
F-II

organische Phase F-III

DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie

	I D-II	I	I D-IV	! D-V	I D-VI	blutkoagulierende Wirkung
D-I	±	D-III	4-4-	±	—	hämorrhagische Wirkung
±	_	4-4-4-	4-4-4-	4- 4-	—
—	±

Das rohe Gift wird zuerst in destilliertem Wasser gelöst, dessen pH-Wert vorher auf 7,0 mit Alkali eingestellt wurde, und die Lösung wird mehrere Male mit dem gleichen Volumen eines organischen Lösungsmittels, z. B. Chloroform, Äther oder Äthylacetat, extrahiert und dann zentrifugiert.

Da bei dieser Extraktion Lipide des Giftes in die organische Phase gehen, wird nur die wäßrige Phase (F-I-A) verwendet und gegen destilliertes Wasser dialysiert. wodurch man die dialysierte Lösung (F-I-B) erhält. Bei dieser Stufe kann ein Verlust an aktiver Substanz wirkungsvoll verhindert werden, wenn man die wäßrige Phase F-I-A mit der wäßrigen Phase dialysiert, die man beim Waschen der organischen Phase F-III und des Niederschlages F-II mit wenig Wasser erhält.
Die wäßrige Lösung des rohen Giftes und die wäßrige Phase nach Entfernen der Lipide, F-I-A und F-I-B absorbieren bei 280 πΐμ fast gleich stark, was zeigt, daß der Großteil des Proteins in die wäßrige Phase gegangen ist. Die Tatsache, daß die dialysierte Lösung eine etwas geringere Absorption aufweist, läßt sich dadurch erklären, daß durch die Dialyse niedermolekulare Substanzen entfernt worden sind.

Bei der Untersuchung der Plasmagerinnungszeit

des rohen Schlangengiftes in F-I-A, F-I-B, F-II und

F-IIl nach dem Recalcinierungstest an Kaninchenplasma zeigt sich, daß die koagulierende Wirkung des rohen Giftes, F-I-A und F-I-B, fast gleich stark ist und in F-II und F-III kaum Aktivität beobachtet wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Großteil der aktiven Substanz in der dialysierten Lösung enthalten ist.

Die so erhaltene Lösung enthält noch verschiedene schädliche Bestandteile, einschließlich des hämorrhagischen Faktors. Die Lösung wird deshalb auf ein Dextrangel mit einem Molgewicht-Fraktionierungsbereich von 1000 bis 50 000 gegeben. Bei Elution mit Phosphatpuffer erhält man die Fraktionen P-I bis P-IV. Die Fraktion P-I mit den hochmolekularen Bestandteilen enthält viel Substanz, die im Recalcinierungstest wirksam ist, aber sie enthält ebenso noch viel hämorrhagischen Faktor. Deshalb wird der hämorrhagische Faktor säulenchromatographisch an einem basischen Ionenaustauscherharz, z. B. Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose), Triäthylaminoäthylcellulose (TEAE-Cellulose) und Diäthylaminoäthylcellulose-Sephadex (DEAE-Sephadex) entfernt, wobei man die Fraktionen D-I bis D-VI erhält, von denen die Fraktion D-III eine stark blutgerinnende Wirkung aufweist, aber wenig hämorrhagischen Faktor enthält.

Die so erhaltene aktive Substanz ist ein ausgezeichnetes Hämostatikum mit thrombinähnlicher Wirkung. Seine blutgerinnende Wirkung ist ungefähr mehrere Male bis lOmal so hoch wie die von bekannten, handelsüblichen blutstillenden Agenzien.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

500 mg des lyophilisierten rohen Giftes von Trimeresurus okinavensis wurden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst, dessen pH-Wert vorher mit Alkali auf 7,0 eingestellt wurde. Die Lösung wurde mit 10 ml Chloroform ausgeschüttelt und anschließend zentrifugiert. Diese Maßnahme wurde 5mal wiederholt, und die wäßrige Phase wurde gesammelt. Die Chloroformphasen und die Niederschläge wurden noch 2mal mit destilliertem Wasser ausgeschüttelt und zentrifugiert, wobei die wäßrigen Phasen gesammelt wurden. Diese wäßrigen Phasen wurden mit der obengenannten wäßrigen Phase vereinigt, und das Gemisch wurde über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde lyophilisiert.

170 mg des Produkts wurden in 1 ml eines 1/70-m-Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,4 gelöst. Die Lösung wurde auf ein Dextrangel mit einem Molgewicht-Fraktionierungsbereich von 1000 bis 50000 (Sephadex-G-75), Säule (2 χ 46 cm) zur Adsorption der im Recalcinierungstest wirksamen Substanz gegeben. Die Säule wurde bei 21⁰C mit 1/70-m-Phosphatpuffer mit einer Tropfgeschwindigkeit von 6 ml/Stunde eluiert. Die Fraktionen 25 bis 40 mit starker Wirkung im Recalcinierungstest wurden in einem Fraktionensammler in Reagenzröhrchen (2-ml-Röhrchen) gesammelt und lyophilisiert. Zur Bestimmung der koagulierenden Aktivität wurden 0,1 ml Kaninchenplasma. das etwas Citronensäure enthielt, mit jeweils 0,1 ml Eluat sowie 0,1 ml l/40molarer CaCl₂-Lösung versetzt, und bei 37° C wurde die Gerinnungszeit bestimmt.

55 mg des Produktes wurden in 1 ml 0,005molarem Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 7,1 gelöst, und die Lösung wurde auf eine DEAE-Cellulose-Säule (0,9 χ 35 cm) zur Adsorption der im Recalcinierungstest wirksamen Substanz gegeben. Die Säule werde mit einem Natriumacetatpuffergradienten von 0,005-bis 0,5molar eluiert. Die mit 0,04- bis 0,1 molarem Natriumacetatpuffer eluierte Fraktion mit der stärksten Wirkung im Recalcinierungstest wurde gesammelt (3,5-mi-Röhrchen) und lyophilisiert. Die koagulierende Aktivität wurde auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt.

Zum Vergleich wurde das erfindungsgemäß hergestellte Präparat mit dem Handelsprodukt Reptilase verglichen, da dieses eine thrombinähnliche Wirkung besitzt und aus dem Gift der Schlange Bothrope jararaca gewonnen wird. 0,1 ml Plasma von Menschenblut, das etwas Citronensäure enthielt, wurden mit 0,1 ml des zu untersuchenden Präparates und 0,1 ml l/40molarer CaCI₂-Lösung versetzt und auf 37° C erwärmt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten. Für die Blindprobe wurde an Stelle des Hämostatikums 0,1 ml physiologische Kochsalzlösung verwendet.

Probe 25	Gerinnungszeit Sekunden
Blindversuch Reptilase Präparat der Erfindung ³⁰ 0,1 mg/ml 0,05 mg/ml 0,02 mg/ml 0,01 mg/ml	261 102 13 19 28 55

Zur Bestimmung der thrombinähnlichen Wirkung wurden folgende Versuche durchgeführt: 0,2 ml einer 1 %igen Fibrinogenlösung wurden mit 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung und 0,1 ml des zu untersuchenden Präparates gemischt und auf 37⁰C erwärmt.

Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Probe	Gerinnungszeit Sekunden
Reptilase Präparat der Erfindung 0,1 mg/ml 0,05 mg/ml 0,02 mg/ml 0,01 mg/ml	150 37 63 138 253

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines blutstillenden Präparates, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige, neutrale Lösung des Giftes einer Schlange der Gattung Trimeresurus mit einem organischen Lösungsmittel in an sich bekannter Weise extrahiert, die wäßrige Phase gegen destilliertes Wasser dialysiert, die dialysierte Lösung lyophilisiert, das erhaltene Produkt in Phosphatpuffer pH 7,4 löst, die Lösung auf ein Dextrangel mit einem Molgewicht-Fraktionierungsbereich

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von 1000 bis 50 000 gibt, die aktive Substanz mit auf einen basischen Ionenaustauscher gibt, die

Phosphatpuffer pH 7,4 fraktioniert eluiert, die aktive Substanz mit Natriumacetatpuffer eluiert

Fraktionen sammelt, welche im Recalcinierungs- und die Fraktion mit der stärksten Wirkung im

test stark wirksam sind, lyophilisiert, das Produkt Recalcinierungstest gewinnt und gegebenenfalls

in Natriumacetatpuffer pH 7,1 löst, die Lösung 5 lyophilisiert.