DE69005251T2

DE69005251T2 - Sulfatierte Glykosaminoglykuronane mit antithrombotischer Wirkung.

Info

Publication number: DE69005251T2
Application number: DE90202449T
Authority: DE
Inventors: Dirk Gerrit Meuleman; Huibert Cornelis Theus Moelker; Adrianus Lambertus Mar Sanders; Dedem Gijsbert Willem Kare Van; Houdenhoven Francois Egber Van
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1989-10-04
Filing date: 1990-09-17
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2010-09-18
Also published as: IE64121B1; EP0421508B1; CA2026036A1; ES2062307T3; PT95511A; ATE98656T1; KR910007532A; JP2655746B2; PT95511B; KR0184260B1; AU637143B2; ZA907495B; EP0421508A3; CA2026036C; MX9203786A; FI101152B; DK0421508T3; EP0421508A2; FI904828A0; DE69005251D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf sulfatiertes Glycosamin-glycuronan mit antithrombotischer Wirksamkeit, auf das Verfahren zu seiner Herstellung und auf pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese enthalten.
Sulfatierte Glycosamin-glycuronane mit antithrombotischer Wirksamkeit sind aus dem U.S. Patent 4.438.108 bekannt. Die gegenwärtig beanspruchten Produkte dieses Patentes sollen minimale hämorrhagische Wirksamkeit aufweisen, was von grösster Wichtigkeit ist, weil hämorrhagische Wirksamkeit solche Produkte für die Verwendung bei Menschen ungeeignet machen.
Die hämorrhagische Wirksamkeit dieser Produkte wurde mit Hilfe des Muskelblut-Testes und des Capillarblut- Testes bei Ratten bestimmt.
Wir haben jedoch festgestellt, dass diese Tests zu empfindlich sind, um hämorrhagische Wirksamkeit bei Menschen vorauszusagen, und tatsächlich haben in klinischen Sicherheitsuntersuchungen die meisten der Produkte aus U.S. Patent 4.438.108 die Blutung verstärkt, insbesondere wiesen sie verlängerte Blutungszeiten auf, was ernst genug ist, um für weitere klinische Entwicklungen prohibitiv zu sein. Wir haben nun gefunden, dass ein neues Verfahren für die Herstellung von sulfatiertem Glycosamin-glucuronan, welches eine vorgängige Trennung von Heparin und dem Produkt der vorliegenden Erfindung mittels Ultrafiltration umfasst, gefolgt von weiterer Reinigung des letztgenannten durch fraktionierte Eluierung aus einem Ionenaustauscher und Methanolfraktionierung ein neues Produkt ergibt, welches eine andere chemische Zusammensetzung besitzt und ein beträchtlich verbessertes pharmakologisches und klinisches Profil aufweist, insbesondere inbezug auf die blutungsverstärkenden Eigenschaften.
Der wichtigste physikalisch-chemische Unterschied dieses neuen Produktes im Vergleich mit dem Produkt des Standes der Technik ist der Schwefelgehalt zwischen 7,5 und 9,5% und vorzugsweise zwischen 8,0 und 8,5 %, welcher wesentlich höher ist als in dem Produkt des Standes der Technik.
Ueberraschenderweise ist der höhere Schwefelgehalt von einem herabgesetzten Blutungsrisiko begleitet, im Gegensatz zu dem, was erwartet werden könnte. Im allgemeinen wurde angenommen, dass ein höherer Schwefelgehalt die Blutungsrisiken für diese Art von Verbindungen erhöht (siehe zum Beispiel J. Van Ryn-McKenna et al., Antithrombotic and bleeding effects of glycosaminoglycans with different degrees of sulphatation, Br. J. Haem., (1989), 71, 265-269). Ferner weist das neue Produkt weniger systemische Nebenwirkungen auf als die Verbindung des Standes der Technik.
Die Erfindung umfasst sulfatierte Glycosaminglycuronane mit antithrombotischer Wirksamkeit, welche im wesentlichen aus Salzen, mit einer Bevorzugung der Natriumsalze, von Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Heparansulfat bestehen, gekennzeichnet durch
a) ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 4000 und 8000 Dalton;
b) einen Stickstoffgehalt zwischen 2,4 und 3,0 %;
c) einen Schwefelgehalt zwischen 7,5 und 9,5 %;
d) einen Natriumgehalt zwischen 9 und 11 %;
e) einen Dermatansulfatgehalt zwischen 5 und 25 %;
f) einen Chondroitinsulfatgehalt von weniger als 9 %;
g) eine Anti-Xa-Wirksamkeit zwischen 11 und 20 u/mg und
h) eine von Antithrombin II abhängige Antithrombin-Wirksamkeit von weniger als 1 u/mg.
Die Heparansulfatkomponente des Produktes kann Heparansulfat mit oder ohne Affinität zu Antithrombin III sein, wie auch Gemische von Heparansulfaten mit niederer und höherer Affinität. Kleine Mengen von sulfatierten Glycosamin-glycuronanen mit einem Molekulargewicht von über 10'000 Dalton können zugegen sein. Das Blutungsrisiko des neuen Produktes wurde mit demjenigen der Verbindung des Standes der Technik in verschiedenen Untersuchungen nach intravenösen Bolus-Injektionen einzelner Dosen bei gesunden jungen männlichen Freiwilligen verglichen. Der wichtigste untersuchte Sicherheitsparameter war die Erhöhung der Blutungszeit ( ΔBT), durchgeführt unter Verwendung der Simplate II -Vorrichtung aber unter Verwendung einer leicht modifizierten Technik, welche das Anpressen der Vorrichtung auf den Vorderarm umfasste, um den maximalen Haut/Schneidklingen-Kontakt zu erzielen. Das Resultat, welches in Tabelle I dargestellt ist, erlaubt die Differenzierung zwischen Ansätzen des Produktes des Standes der Technik und Ansätzen des neuen Produktes, welche auf parallele Aenderungen in verwandten Glycosamin glycuronan-Zusammensetzungen als Folge von Aenderungen im Isolierverfahren hinweisen. TABELLE I Prozent an Freiwillilgen mit ΔBT Behandlung I.V Anzahl Freiwillige Dosis Anti-Xa u durchschnittliche Anti-Xa-Wirksamkeit Heparin Stand der Technik (US-Patent 4.438.108) (3 Ansätze) diese Erfindung (6 Ansätze)
Die klinischen Unterschiede, wie aus Tabelle I ersichtlich, können auch pharmakologisch mittels dem empfindlichen subdermalen Blutungstest nachgewiesen werden. Die Blutung wird gemessen durch Evaluierung der Hämoglobinkonzentration unter Verwendung der Analyse für eine willkürliche Blockzeichnung und ausgedrückt als Prozentsatz der geometrischen durchschnittlichen Konzentration der Hämoglobinkonzentration nach Verabreichung der Verbindung: geometrische durchschnittliche Konzentration der Hämoglobinkonzentration nach Verabreichung des Vehikels x 100. Die Hämoglobinkonzentration ist ein Mass für den Blutverlust und sie wird nach i.v.-Verabreichung an Ratten von 100, 200, 400 und 800 u/kg der Verbindung bestimmt. Die Resultate wurden als eine Kurve dieses Prozentsatzes gegen die Dosis ausgedrückt, worauf das Gebiet unter der Kurve (AUC) berechnet werden kann. Die AUC-Werte sind in Tabelle II dargestellt für Heparin USP (als Referenz), 5 Ansätze (A-E) des Produktes des Standes der Technik und für 4 Ansätze (I-IV) des neuen Produktes (siehe Beispiele). TABELLE II Ansatz Durchschnitt Heparin USP Stand der Technik (USP 4.438.108) diese Erfindung
Infolge der stark herabgesetzten Blutungsrisiken ist das neue Produkt hervorragend geeignet für die Prophylaxe und die Behandlung venöser Thrombose, Thrombo-Embolien und Thrombosen tiefer Venen. Ausserdem weist das Produkt antiallergische, entzündungswidrige und antiatherosclerotische Wirksamkeit auf.
Das neue Produkt kann erhalten werden durch Autolyse oder Proteolyse (z.B. Enzyme aus Schweinepankreas oder bakterielle Enzyme, wie Proteasen aus Bacillus subtilis) von Säugetiergewebe, wie Lungen, Pankrease, Leber oder Gedärme. Besonders nützlich ist die Darmschleimhaut von Schweinen, welche nach Proteolyse mit Ionenaustauscher behandelt wird, worauf- der Ionenaustauscher mit wässerigen Salzlösungen eluiert wird, welche vorzugsweise Natriumchloridlösungen sind. Um eine vorgängige Trennung des Produktes von Heparin zu erzielen,wird das Eluat gegen wässerige Salzlösungen in einer Vorrichtung mit einem Abschnitt einer relativen Molekularmasse von 10'000 und vorzugsweise von etwa 5500 Dalton diafiltriert, worauf das erhaltene Produkt an Ionenaustauscher gebunden wird, der Ionenaustauscher wird mit wässerigen Salzlösungen eluiert und mit organischen Lösungsmitteln ausgefällt, üblicherweise mit Hilfe von Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind, wie Alkoholen und vorzugsweise Methanol, und falls erforderlich weiter von Nucleinsäuren gereinigt, zum Beispiel durch Bleichen, Behandlung mit Natriumhydroxid, Behandlung mit RNAse, Behandlung mit Mangandichlorid und/oder Ausfällung, gegebenenfalls gefolgt von der Behandlung und einer Lösung von Kaliumpermanganat. Die Ausfällung erfolgt vorzugsweise in fraktionierter Weise mit Hilfe von graduell steigenden Mengen an Methanol in Wasser.
Das neue Produkt kann, obwohl es kein Heparin oder Heparinfraktionen enthält, in üblicher Weise, wie sie für Heparin verwendet wird, zu einer pharmazeutischen Dosierungsform verarbeitet werden,zum Beispiel durch Auflösen in Wasser, das für Injektionszwecke geeignet ist, zu welchem falls erforderlich, weitere pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe zugesetzt werden.
Die klinische Anwendung erfolgt mittels subcutaner oder intravenöser Injektion oder durch Infusion. Aendere Methoden der Dosierung sind ebenfalls möglich, wie intrapulmonäre Verabreichung via Sprühinhalation oder Verabreichung mit Hilfe eines Suppositoriums.
Die folgenden Beispiele dienen der Illustrierung der Erfindung.

Beispiel I

Herstellung von Ansatz I

1. Isolieerung des rohen Produktes

Stabilisierte Schleimhaut wird durch ein proteolytisches Enzym bei erhöhter Temperatur und bei einem alkalischen pH digeriert. Das digerierte Gemisch wird während 12 bis 16 Stunden mit einem Anionenaustauscher behandelt, an welchen das aktive Material gebunden wird. Der mit aktivem Material gebundere Ionenaustauscher wird mit einer NaCl-Lösung in Leitungswasser eluiert.
Das Eluat wird etwa 10 mal konzentriert und gegen 5 Volumina NaCl (etwa 2 %) in Leitungswasser in einem Ultrafiltrationsapparat, welcher mit Membranen mit einem nominalen Gewichtabschnitt von einer relativen Molekularmasse von etwa 5500 D ausgerüstet ist, diafiltriert.
Dieses Permeat und Diafiltrat enthält das Endprodukt und bildet das Ausgangsmaterial für das Isolierungsverfahren.
Das Permeat und Diafiltrat werden vermischt und anschliessend mit Leitungswasser verdünnt, um eine Wiederadsorption des Produktes an einen Ionenaustauscher zu ermöglichen. Der Ionenaustauscher mit gebundenem aktiven Material wird mit Leitungswasser gewaschen. Der Ionenaustauscher wird mit einer 11 %igen NaCl-Lösung eluiert.
Das gewünschte Produkt wird durch fraktionierte Ausfällung mit Methanol erhalten, und fällt zwischen 60 und 75 % Methanol aus.
Der gewaschene Rückstand wird unter vermindertem Druck bei 40 ± 5ºC getrocknet.
Nucleinsäuren werden entfernt durch Bleichen des rohen Produktes, gefolgt von fraktionierter Ausfällung zwischen 60 und 75 % Methanol.

2. KMnO&sub4;-Reinigung

Das erhaltene teilweise gereinigte Produkt wird in destilliertem Wasser gelöst. Die gesammelte wässerige Lösung wird rasch auf 60ºC erhitzt, und der pH wird auf 9,5 eingestellt. Eine Natriumpermanganatlösung (40 %, Gewicht/Volumen) wird zu der heissen Lösung zugesetzt, worauf die Lösung während 1 Stunde auf 60ºC gehalten wird. Die Lösung wird sodann auf 90ºC gekühlt. Das gebildete Mangandioxid wird durch Filtrieren durch ein sterilisiertes Filter entfernt, und das Filtrat wird auf pH 6,0 gebracht. Das Produkt wird mit 2 % (Gewicht/Gewicht) NaCl und aufeinanderfolgend mit 75 und 90 % Methanol ausgefällt.
Das Material wird in dicht verschlossenen Aluminiumbehältern aufbewahrt.
Spezifikationen:
durchschnittliches Molekulargewicht 5270
Stickstoff 2,6 %
Schwefel 8,3 %
Natrium 9,8 %
Dermatansulfat 11,6 %
Chondroitinsulfat 4,6 %
Anti-Xa-Wirksamkeit u/mg 16,7
Antithrombin-Wirksamkeit u/mg 0,13

Beispiel II

Darmschleimhaut vom Schwein wird mit proteolytischen Enzymen aus Schweinepankreas behandelt. Nach 15 Stunden bei pH 8,5 wird die Lösung filtriert und in Berührung mit einem stark alkalischen Ionenaustauscher während 15 Stunden gebracht. Als nächstes wird der Ionenaustauscher von der Flüssigkeit getrennt und adsorbierte Glycosamin-glycane werden mit einer wässerigen Lösung von Natriumchlorid (200 g/l) eluiert.
Das Eluat wird konzentriert und unter Verwendung eines Ultrafiltrationsfilters mit einem nominalen Molekulargewichtsabschnitt von 5500 Dalton diafiltriert.
Die Permeat-Diafiltrat-Fraktionen werden vereint, und das rohe Glycosaminoglycangemisch wird auf einen stark basischen Ionenaustauscher readsorbiert. Nach dem Waschen des Harzes werden Glycosamin-glycane mit 11 % Natriumchlorid eluiert, und das rohe Produkt wird durch fraktionierte Ausfällung mit Methanol bei 50 % und 75 % erhalten. Weitere Reinigung wird erzielt durch wiederholte fraktionierte Ausfällung mit Methanol, gefolgt von einer Oxidationsstufe mit 1 % Wasserstoffperoxid bei pH 10 und Ausfällung mit 75 % Methanol.

Beispiel III

Darmschleimhaut vom Schwein wird mit proteolytischen Enzymen aus Bacillus subtilis bei 35ºC und pH 8,2 während 24 Stunden digeriert. Nach Filtration wurde ein rohes Pulver erhalten durch Adsorption an einem basischen Ionenaustauscher, Eluierung einer wässerigen Lösung von 20 % Natriumchlorid und fraktionierte Ausfällung mit Methanol zwischen 50 und 75 %.
Das Material wird in Wasser, welches 2 % Natriumchlorid enthält, wieder aufgelöst, ultrafiltriert und diafiltriert durch einen Filter mit einem Molekulargewichtsabschnitt von nominal 5500 Dalton. Permeat und Diafiltrat werden vereint, und die Glycosamin-glycane an einem Anionenaustauscher adsorbiert. Nach dem Waschen wird das Harz mit 11 % Natriumchlorid eluiert. Die Glycosamin-glycanfraktion von diesem Eluat wird mit 75 % Methanol ausgefällt und weiter verarbeitet, wie in Beispiel I beschrieben.

Beispiel IV

Auf eine analoge Weise wie in Beispiel I beschrieben, wurden die Ansätze II-IV aus verschiedenen Quellen von Darmschleimhaut von Schweinen hergestellt. Spezifikationen Ansatz durchschnittliches Molekulargewicht Stickstoff Schwefel Natrium Dermatansulfat Chondroitinsulfat Anti-Xa-Wirksamkeit u/mg Antithrombin-Aktivität u/mg

Claims

1. Sulfatiertes Glycosaminoglycuronan mit antibiothrombotischer Wirksamkeit, bestehend im wesentlichen aus Salzen von Dermatansulfat, Chrondroitinsulfat und Heparansulfat, gekennzeichnet durch

a) ein mittleres Molekulargewicht zwischen 4000 und 8000 Daltons;

b) einen Stickstoffgehalt zwischen 2,4 und 3,0 %

c) einen Schwefelgehalt zwischen 7,5 und 9,5 %

d) ein Natriumgehalt zwischen 9 und 11 % ;

e) einen Dermatansulfatgehalt zwischen 5 und 25 %

f) einen Chondroitinsulfatgehalt von weniger als 9 %

g) eine Anti-Xa-Wirksamkeit zwischen 11 und 20 u/mg ; und

h) eine von Antithrombin III abhängige Antithrombinaktivität von weniger als 1 u/mg.

2. Verfahren für die Herstellung von sulfatiertem Glycosaminoglucuronan gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Säugetiergewebe der Autolyse oder der Einwirkung protelytischer Enzyme unterwirft, mit Ionenaustauscher behandelt wird, welcher mit wässerigen Salzlösungen eluiert wird, worauf das Eluat gegen wässerige Salzlösungen diafiltriert wird, worauf das erhaltene Produkt an Ionenaustauscher gebunden wird, mit wässerigen Salzlösungen eluiert wird und mit organischen Lösungen ausgefällt wird, und falls erforderlich weiter von Nucleinsäuren gereinigt wird, gegebenenfalls gefolgt von einer Behandlung mit einer Lösung von Kaliumpermanganat.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Schweinedarm-Schleimhaut durch proteolytische Enzyme digeriert wird, die wässerigen Salzlösungen Lösungen von Natriumchlorid sind, die Diafiltration in einer Vorrichtung mit einer nominalen Abtrennung einer relativen Molekularmasse von etwa 5500 Daltons durchgeführt wird und die Ausfällung mit allmählich steigenden Mengen Methanol in Wasser durchgeführt wird.

4. Pharmazeutisches Präparat bestehend aus pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen und sulfatiertem Glycosaminoglycuronan gemäss Anspruch 1.