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Verfahren zur Herstellung eines biologisch
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aktiven Mucoprotids Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren
zur Herstellung biologisch aktiver Derivate durch Behandlung von tierischen Geweben,
insbesondere Leber und Plazenta oder anderen Organen von Säugetieren, Hefe oder
anderen ähnlichen organischen Stoffen.
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Diese Derivate sind Mucoprotide und sind biologisch wirksam, wie beispielsweise
beim Entgiften von Vergiftungen, bei der Behandlung allergischer Zustände, Behandlung
narkotischer
Neigungen und dergleichen. Sie können durch ihr Infrarot-Transparenzspektrum
identifiziert werden.
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Die erfindungsgemässen Stoffe sind insbesondere eiweissartige bzw.
eiweisshaltige Derivate der Leber von Säugetieren (oder anderen Quellen), die eine
Eiweisskomponente als Hauptbestandteil enthalten, die aber auch einen wesentlichen
Kohlehydratanteil aufweisen, der hierin als Mucoid bezeichnet wird. Die biologischen
und therapeutischen Eigenschaften dieser Derivate hängen von den chemischen Kombinationen
von Protid und Mucoid ab.
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Unter dem Begriff "Protid" wird nicht nur Protein verstanden, sondern
auch Aminosäuren und Oligopolypeptide. Unter "Mucoid" werden bestimmte niedrigmolekulare
Kohlehydrate und Derivate, wie Hexosen (beispielsweise Glukose, Galaktose, Mannose),
Sialsäuren (Sialinsäure), Hexoseamine, wie Glukoseamin und Galaktoseimin, Fucose
und dergleichen.
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Seit den 40-iger Jahren wurde von mehreren Fachleuten Säugetierleber
behandelt, wobei im allgemeinen ähnliche Verfahren angewandt wurden. Ausgegangen
wurde von mazerierten Leber-Organgewebe, d.h. Lebergewebe, das von Fasermaterial,
Fett und Blutgefässen befreit war. Bei diesem Verfahren wurden durch systematische
Anwendung von wässrigen Lösungen anorganischer Salze als selektive Fällungsmittel
für unerwünschte (verworfene) Bestandteile, stufenweise Behandlung mit Aceton und
weitere Verarbeitung von einer oder mehrerer (aber nicht aller) der von der Acetonbehandlung
herrührenden Phasen sowie entsprechende Reinigung der gewählten Phase oder Phasen
(beispielsweise durch Dialyse) biologisch aktive Bestandteile der Leber isoliert.
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So haben beispielsweise Mohamed und Greenberg 1945 in Archives of
Biochemistry", Band 8, Seite 549 ein Verfahren beschrieben, das die Genesis aller
späteren Verfahren ist und zur Isolierung
der Enzymarginase führt.
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Aus der US-PS 3 701 768 (Fortini, Blair und Grodsky) ist ein Verfahren
bekannt, das bis auf gewisse Unterschiede dem Verfahren nach Mohamed und Greenberg
sehr ähnlich ist. So wird beispielsweise die Acetonstufe so durchgeführt, dass drei
Phasen gebildet werden, von denen nur die obere Schicht oder Phase abgetrennt und
verarbeitet wird, während die mittlere und untere Schicht oder Phase verworfen wird.
Aus der abgetrennten oberen Phase wird zunächst eine Proteinkomponente gefällt,
dann der Dialyse unterworfen, anschliessend erwärmt, um Antigene zu zerstören und
schliesslich wird die Proteinkomponente fraktioniert, beispielsweise durch Chromatographie,
um eine sehr reine Proteinfraktion zu bilden.
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Andere Fachleute auf diesem Gebiet sind Huber (Herstellung von Orgotein,
US-PS 5 624 251) und Wesley Irons (britische Patentanmeldung 5242/57).
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Diese Produkte bereiten aber Schwierigkeiten, wenn sie für therapeutische
Zwecke verwendet werden (Fortini u.a., Huber und Irons), da die Einheitlichkeit
fehlt, weil verschiedene Chargen grosse Unterschiede in der biologischen Aktivität
zeigen und ausserdem instabil sind.
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Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur
Gewinnung eines biologisch aktiven, medizinisch sowohl zur Behandlung von Tieren
als auch von Menschen brauchbaren Produktes zu schaffen, das in seiner ausgeprägten
biologischen Wirksamkeit konsistenter und stabiler ist als die bekannten Präparate.
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Das erfindungsgemässe Verfahren dient dazu, ein biologisch wirksames
Mucoprotid-Präparat aus Organgeweben, wie Säugetierleber oder dergleichen oder anderen
organischen Stoffen zu gewinnen, bei dem höhere Ausbeuten als bei den herkömmlichen
Verfahren
erzielt werden, wobei gleichzeitig die bakterielle Verunreinigung
auf ein Minimum gesenkt wird, die zu Pyrogenität führt, welche ein unbrauchbares
klinisches Produkt ergibt.
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Die Erfindung wird anhand der folgenden Beschreibung und einiger Ausführungsbeispiele
näher erläutert.
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Zu den Ausgangsstoffen gehören Leber, Plazenta, Milz, Niere, Pankreas
und schleimabsondernde Drüsen von Säugetieren, die zu den zweckmässigen Quellen
der erfindungsgemäss hergestellten biologisch-aktiven Mucoprotide gehören. Besonders
bevorzugt werden Leber und Plazenta. Versuche haben aber gezeigt, dass die genannten
Mucoprotide in erheblichen Mengen in allen Arten von Geweben der Säugetiere vorhanden
sind. Das Ausgangsmaterial soll von gesunden Tieren stammen und soll mechanisch
behandelt werden, um äusserliches Fett, Fasermaterial und dergleichen zu entfernen,
so dass im wesentlichen nur das für das Organ charakteristische Gewebe, beispielsweise
das Parenchym im Falle der Leber, zurückbleibt.
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I. Autolyse Entfaserte, entkapselte und entfettete junge Stierleber
wurde von gesunden Tieren unter sauberen Bedingungen genommen. Das beschriebene
Verfahren wurde mit 7 kg präparierter Leber (Parenchym) durchgeführt. Diese Leberparenchym
wurde in Würfel geschnitten und in einem Waring-Mischer mazeriert oder homogenisiert
und zwar mit 600 ccm einer Lösung aus 50 g/l Natriumacetat und 15,4 g/l Mangansulfat.
Diese homogene Masse wurde bei Zimmertemperatur (20 bis 22 C) 24 Stunden heftig
gerührt-. Dieses Homogenat-Autolysat wurde durch eine Schicht eines 80-iger Siebes
geseiht.
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II. Entferung von äusserlichem Protein und diesem anhaftenden Stoffen
Dieses geseihte flüssige Autolysat wurde mit 3000 ccm eines
4,575%-igen
Bleiacetats behandelt, 35 bis 40 Minuten heftig gerührt und mindestens 1 Stunde
bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Flüssigkeit wurde dann zentrifugiert und
die obenschwimmende Flüssigkeit mit 2,5 1 einer 0,2n-NaOH (oder einer je nach Erfordernis
entsprechenden Menge) auf einen pH-Wert von 8,3 bis 8,4 eingestellt. Anschliessend
wurde die Flüssigkeit mindestens 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen
und dann durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren geklärt. Zu der obenschwimmenden
Flüssigkeit wurde 1/3 Volumen gesättigtes Ainmoniumsulfat (780 g/l) zugegeben und
die Masse 7 bis 4 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Zum Schluss wurde
sorgfältig filtriert und zentrifugiert. Es wurde auf Abwesenheit von Blei geprüft
und eine klare obenschwimmende Flüssigkeit gewonnen.
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III. Aceton-Behandlung und Dialyse der gewählten Phase Zu der bleifreien
obenschwimmenden Flüssigkeit aus Stufe II wurden 35 Vol.-% Aceton zugegeben und
dann 4 bis 6 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anschliessend wurde filtriert
und zentrifugiert und erneut Aceton zugegeben, um ein Acetonvolumen von 60% zu erhalten.
Nach 6-stündigem Stehen bei Zimmertemperatur waren drei Schichten gebildet, wobei
die Hauptmasse der Arginase oder der Arginase anhaftendes Protein in der mittleren
Schicht war. Die beiden oberen Schichten wurden abgehebert und die unterste Schicht
wurde verworfen. Zu den beiden oberen Schichten wurde eine gleiche Volummenge Aceton
zugegeben.
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Es bildete sich ein gummiartiger Niederschlag, der 4 bis 6 Stunden
bei Zimmertemperatur stehen gelassen und dann isoliert wurde.
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Der Niederschlag wurde gelöst, mit 0,1 molarer K2HPO4 auf einen pH-Wert
8,5 eingestellt, wobei 750 bis 1000 ccm eingestellter Puffer zum Auflösen verwendet
wurden. Diese Lösung wurde in Dialyse-Taschen gegeben und gegen reines'Wasser dialysiert,
wobei das Wasser häufig gewechselt und kontinuierlich bewegt wurde, um die Dialyse
zu beschleunigen, bis die Reaktionsmasse in den
Dialyse-Taschen
frei von Mineralien war. Diese wurde beispiebsweise durch einen Leitfähigkeitstest
von nicht mehr als 1 Teil/ Mill. ermittelt. Die für die Dialyse erforderliche Zeit
hängt von den physikalischen Parametern des Dialysesystems ab, sollte aber innerhalb
von 48 Stunden beendet sein, um die Möglichkeit wesentlicher Verluste aufgrund langsamer
Zersetzung des Produktes in diesem Stadium des Isoliervorganges auf ein Minimum
zu senken. Nach Beendigung der Dialyse wurde die Lösung aus den Dialyse-Taschen
entfernt und die obenschwimmende Masse gewonnen.
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Die beiden von der unteren Schicht abgetrennten oberen Schichten können
vor der zweiten Aceton-Zugabe anstelle der oben beschriebenen Behandlung ohne weitere
Reinigungsverfahren als geniessbarer Leberextrakt verwendet werden, wobei die Schichten
lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet und das dabei erhaltene trockene Pulver mundgerecht
in Form von Waffeln oder dünnen Tabletten mit einem inerten Träger verpackt wird.
Eine Dosis des Zehnfachen der parenteralen Form wird zur Zeit empfohlen.
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Entsprechende Träger sind Lactose, Stärke -And Cellulose und zweckmässige
Anteilmengen des lyophilisierten Produktes sind 5 bis 25%, bezogen auf das gesamte
essbare Produkt.
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IV. Entantigenisieren und Stabilisieren Die obenschwimmende Masse,
also das parenterale Material wurde in ein Wasserbad gebraucht, das bei 470 bis
490 C gehalten wurde, bis alle äusserlichen, instabilen und antigenen Stoffe gefällt
waren (grosse Flocken). Dieser Vorgang ist üblicherweise in einem Zeitraum von 3
bis 5 Stunden beendet. Es wurde mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, bis die
Masse klar war. Anhand eines aliquoten Teiles dieser Masse wurde die Konzentration
der aktiven Komponente ermittelt und standartisiert. Bei manchen Präparaten, und
zwar abhängig vom Gewebe und der Art des Ausgangsmaterials, kann diese Stufe der
Entantigenisierung weggelassen werden. Dies gilt insbesondere für Plazentalpräparate
von Rind und Mensch. In der Praxis ist es jedoch zweckmässig, diese Behandlung
routinemässig
immer durchzuführen' es sei denn> ein aliquoter Anteil der Masse wird zuerst
einem Sicherheitstest unterzogen, um sicher zu gehen, dass keine antigenen eiweissartigen
oder eiweisshaltigen Stoffe vorliegen.
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Die klare, durch das Zentrifugieren erhaltene Masse aus den obenschwimmenden
Schichten wird in einem sterilisierenden Membranfiltersystem steril filtriert und
in einem Gefrierapparat aufbewahrt oder unter sterilen Bedingungen lyophilisiert.
Die Ausbeute an Konzentrat variiert, bewegt sich aber üblicherweise im Bereich von
2 Liter einer 1 bis 2%-igen Lösung oder 20 bis 40 g. Die Dosierung eines typischen
Präparates bei parenteraler Anwendung für Menschen liegt im Bereich von 0,5 mg bis
1,5 mg pro 75 kg eines Erwachsenen und ist abhängig von der biologischen Wirksamkeit
einer bestimmten Serie. Die übliche parenterale (I.V.) Dosis-Form ist eine 5 ccm
Ampulle.
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V. Letzte Reinigung Die endgültige Reinigung des Produktes wird in
einer neuartigen Verfahrensstufe unmittelbar vor dem Füllen der Ampullen zur klinischen
Verwendung durchgeführt. Das Konzentrat wurde auf die Endkonzentration mit pyrogenfreiem,
sterilem Wasser entsprechend verdünnt und bei Zimmertemperatur (180 bis 240 C) mindestens
8 Tages oder so lange bis sich kein weiterer rötlicher Niederschlag bildete, stehen
gelassen. Diese Lösungsmasse wurde steril filtriert, um den Niederschlag zu entfernen,
wieder getestet und standartisiert und in die entsprechende Form für den klinischen
Gebrauch gebracht.
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Wegen der komplizierten, vielgestaltigen strukturellen Beziehungen
der Gruppe von als Mucoprotide bekannten Substanzen, mussten mehrere verschiedene
Vorstösse unternommen werden, um diese komplexen Moleküle auseinander zu "zupfent'
um die Verluste während ihrer Hydrolyse oder Zerstörung in ihre einfachen Untereinheiten
auf ein Minimum zu senken und/oder zu erklären. Die
sehr sorgfältige
Verarbeitung und das Erfordernis einer milden "Vorbehandlung" der Mucoprotide zur
weitmöglichen Verringerungen des Verlustes an Untereinheiten verdeutlichen die Unterschiede
zwischen dem erfindungsgemäss hergestellten Produkt und dem einfachen "reinen" Protein
des Fortini-Grodsky-Blair-Patents und dem einfachen Metallo-Protein der Huber-Schlute-Patente.
Insbesondere ist eine sehr viel mildere und genau differenzierte hydrolytische Technik
für den Mucoid- oder Kohlehydrat-Anteil erforderlich als dies bei der herkömmlichen
heftigen Hydrolyse eines reinen oder einfachen Proteins der Fall ist. Die allgemeinen
Verfahrensschritte zur qualitativen und halbquantitativen Vorbehandlung und Analyse
des Mucoid- oder Kohlehydrat-Anteils dieser Mucoprotide sind ähnlich dem Grundverfahren,
das von Richard J. Winzler in der "Ciba Foundation" Zusammenstellung ??The Chemistry
and Biology of Mucopolysaccharides" Seiten 258-261, Little Brwon & Co.> Boston,
1958 beschrieben ist.
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Für quantitative Ergebnisse werden für die Mucoid-Untereinheiten rigorosere
analytische Methoden verwendet, wie in der folgenden Beschreibung ausgeführt ist.
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Die analytische Arbeitsweise für den Mucoidanteil der Mucoprotide
ist folgende: Eine 20 mg Probe des Mucoprotids in seiner endgültigen Form (d.h.
die aktive Komponente aus Stufe V der bevorzugten Verfahrensschritte) wird mit 20
ml 1,0 ° molarer Salzsäure gemischt und das Gemisch 15 Minuten auf 100 C erwärmt.
Dabei werden maximale Mengen Sialsäure(n) und Fucose frei, mit nur etwa 5% Hydrolyse
des Protid-Anteils. Gleichzeitig wird eine weitere 20 ml Probe Mucoprotid wie die
erste Probe behandelt, aber die Hydrolyse wird noch 1 Stunde fortgesetzt, wobei
eine maximale Menge Hexose und Hexoseamine frei wird, mit nur etwa 15 bis 20% Hydrolyse
des Protid-Anteils. Aliquote Mengen dieser behandelten Proben werden sofort der
Dialyse (oder Ultrafiltration) unterworfen und die Dialysate (oder Ultrafil--trate)
werden bis zur Trockene eingedampft und chromatographiert, wobei ein absteigendes
Lösungsmittelsystem von
Äthylacetat : Pyridin : Wasser im Verhältnis
von 10 : 4 : 3 Volumteilen verwendet wird. Das erhaltene Ch imatogramm wird luftgetrocknet
und mit einer Lösung aus Anilinexalat gebeizt bzw. gefärbt. Die Flecken werden durch
Standardverfahren in ihrer Lage ermittelt und ihre Menge durch Analyse des Chromatogramms
durch einen quantitativen analytischen Vergleicher und/oder durch Analyse des Eluats
(eluate) der einzelnen Verbindungen quantitativ bestimmt. Die spezifischen analytischen
Methoden sind in den folgenden Literaturstellen näher beschrieben: R. J. Winzler,
Determination of Serum Glycoproteins in Methods of Biochemical Analysis, Band II,
Seiten 279-311, Interscience Publishers, N.Y. 1955; Leonard Warren, "The Thiobarbituric
Acid Assay of Sialic Acids", in Journal of Biological Chemistry, Band 234, Seiten
1971-1975 (1959); C. J.
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M. Rondle und W. T. J. Morgan, "The Determination of Glucosamine and
Galactoseamine", in Biochemical Journal, Band 61, Seiten 586-589 (1955).
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Das analytische Verfahren für den Protid-Anteil der Mucoprotide verläuft
wie folgt: Wegen der Anwesenheit von Kohlehydrat oder Mucoid müssen übermässig rauhe
und scharfe oder lange Hydrolysemethoden vermieden werden, um Verluste an Aminosäure-Komponenten
weitgehend zu verringern, die durch die sogenannte "BrUnier-Reaktion auftreten.
Bei dieser kondensieren freigewordene Mucoid-und Protid-Untereinheiten und ergeben
dunkle Nebenprodukte.
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Mucoprotide mit niedrigerem Kohlehydratgehalt (0.1% bis 10%) wie jene,
die aus der Leber einiger Säugetierarten erhalten werden, können gewöhnlich direkt
durch die folgenden Verfahrensschritte hydrolysiert werden. Mucoprotide mit höherem
Kohlehydratgehalt (10% bis 40%), wie jene, die von der Plazenta einiger Säugetierarten
erhalten werden, müssen zunächst einer vorläufigen milden Hydrolyse unterworden
werden, beispielsweise einer Hydrolyse, wie sie weiter oben zum Freisetzen von Kohlehydrateinheiten
beschrieben ist (d.h. 1 Stunde bei 1000 C in 1 molarer Salzsäure). Anschliessend
wird durch Dialyse oder Ultrafiltration
die Masse der freigewordenen
Kohlehydrat- oder Mucoid-Anteile entfernt. Durch eine solche vorläufige Hydrolysestufe
wird die Masse der störenden Kohlehydrate entfernt, wodurch die Verluste an Aminosäuren
durch Reaktion mit den überschüssigen Kohlehydraten auf ein Minimum gesenkt werden.
Die Hydrolyse des Protid-Anteils zu den freien Aminosäuren (constituent free amino
acids) erfolgt dann durch Behandlung von 20 mg Protid oder Protid-Äquivalent (berechnetdurch
Abzug des Prozent-Äquivalents von Kohlehydrat, falls der Kohlehydratgehalt grösser
ist als 10% des intakten Mucoprotids) mit 20 ml einer dreimal destillierten, 6-molaren
Salzsäure in dicht ver-° schlossenen Pyrex-Glas-Röhrchen, und zwar 20 Stunden bei
105 C.
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Tryptophan bC-Amino-B-Indolpropionsäure), das während der sauren Hydrolyse
zerstört wird, kann durch alkalische Hydrolyse ermittelt werden, wobei mit 20 mg
Protid-Äquivalent in 20 ml 4-n Bariumhydroxyd bei 1100 C während 60 Stunden gearbeitet
wird.
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Wenn einmal die Hydrolyse beendet ist, werden die Aminosäure-Gemische
einer herkömmlichen Ionenaustausch-Analyse unterworfen (G. R. Tristram und R. H.
Smith, "Advances in Protein Chemistry", Band 18, Seiten 227-235, Academic Press,
N.Y. 1963).
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Typische Analysen sind folgende:
Aminosäure-Analyse
Rinderleber Menschliche Plazenta Mucoprotid Mucoprotid Gewichts-% Gewicht Alanin
5.3 2.8 Arginin 5.7 7.0 Asparaginsäure 7.4 6.o Cystin 0.6 6.2 Glutaminsäure 5.4
7.1 Glycin 6.5 2.4 Histidin 3.2 1.6 Isoleuzin 4.0 2.0 Lin 9.7 5.0 Lysin 8.6 3.9
Methionin 1.8 1.6 Phenylalanin 3.4 2.5 Prolin 8.8 8.6 Serin 5.5 6.o Threonin 5.0
5.3 Tryptophan 2.0 0.7 Tyrosin 1.2 2.9 Valin 7.2 5.5 Amid-NH2 nicht bestimmt-NH3
2.9
Mucoid-Analyse Diese Analyse ist sehr variabel, und zwar sowohl
hinsichtlich des gesamten Mucoid-Gehalts als auch hinsichtlich der Mengenanteile
der verschiedenen Mucoid-Arten. Der gesamte Mucoid-Anteil (bezogen auf das gesamte
Trockengewicht der Feststoffe) kann nur 0,1 aber auch bis zu 40 betragen. Bedingungen,
die den gesamten Mucoid-Gehalt beeinflussen, sind die Arten der Tiere, die als Quellen
für das Gewebe dienen, die Art des verwendeten Organs oder Gewebes sowie die Methode
der Zubereitung.
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So können beispielsweise aktive Mucoprotid-Präparate aus Säugetier-Plazenta
einen weit höheren Mucoid-Gehalt ergeben als entsprechende Mucoprotide aus der Leber,
der Milz oder dem Blut.
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Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Mucoprotide ergeben
Präparate mit einem wesentlich höheren Mucoid-Gehalt als die nach herkömmlichen
Methoden gewonnen Zubereitungen. Die besondere Tierart sowie die Gesundheit des
Tieres bestimmen die endgültigen Ausbeuten. So wurde beispielsweise durch Versuche
festgestellt, dass menschliche Plazenta offenbar einen höheren Prozentanteil an
Mucoid ergibt als Rinderplazenta.
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Typische Mucoid-Komponenten in charakteristischen Mengenanteilen sind:
Sialsäure(n) 25% bis 30 Hexoseamine (vermutlich acetyliert) 25% bis 30% Glukoseamin
15% Galaktoseamin 10% Hexosen 30 bis 25% Glukose 10% Galaktose 12% Mannose 8% Fucose
1% bis 5%
Das Produkt hergestellt nach dem erfindungsgemässen Verfahren
ist auch durch sein Infrarot-Transparenz-Spektrum gekennzeichnet. Die Figuren 1,
2, 3 und 4 sind Segmente von Kurven, die die Infrarot-durchlässigkeit dieses Materials
zeigen. Die Ordinaten geben die Prozente der Durchlässigkeit und die Abszissen die
Wellenzahlen an. Diese Spektraldaten beziehen sich auf ein Präparat aus Rinderleber
(Fig. 1); Kuh-Plazenta (Fig. 2); Hefeextrakt (Fig. 3) und handelsüblichem Trypsin
(Fig. 4). Die Leber- und Plazenta-Präparate wurden nach den oben beschriebenen erfindungsgemässen
Verfahrensschritten für Rinderleber hergestellt. Als Trypsin wurde das handelsübliche
kristalline Material verwendet, das nach dem Verfahren hergestellt wurde, das in
Hawk's Physiological Chemistry, 14. Ausgabe, Seite 441 (McGraw Hill Verlag) beschrieben
ist. Der Hefeextrakt war das Ribonukleinsäure-Präparat, das in Hawk, Seiten 208
und 209 beschrieben ist. Uberraschenderweise enthielten die Hefe und die Ribonukleinsäureprodukte
Mucoprotid-Material gemäss der Erfindung. Diese Produkte können in einer Lösung
aufgenommen werden, wie sie für klinische Zwecke verwendet wird. In Lösung werden
sie entantigenisiert und stabilisiert (Stufe IV) und vorzugsweise auch der endgültigen
Reinigung (Stufe V) unterworfen.
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Jedes der Präparate hat eine deutliche Einsattelung in seinem Infrarotspektrum
bei einer Frequenz nahe 1100 und in allen Fällen zwischen 1000 und 1200. Der Rest
des Spektrums rechts und links des 1000 - 1200 Segments, einschliesslich des Spektrums
ausserhalb des in den Figuren gezeigten Bereiches ist typisch für die Extrakte,
die durch die obengenannten Fachleute Mohamed und Greenberg; Fortini, Blair und
Grodsky und Irons hergestellt wurden. Es ist die einmalige Eigenschaft des erfindungsgemäss
hergestellten Materials, dass es das charakteristische Transparenz-Spektrum bei
1000 - 1200 aufweist, wie es die Figuren zeigen.
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Die spektrophotometrischen Infrarot-Analysen der Mucoprotid-Präparate
wurden mit dem im Handel erhältlichen Standardgerät Perkin-Elmer 401 Spektrophotometer
durchgerührt. Das sorgfältig gemischte Mucoprotid-Pulver und Kaliumbromid wurden
in ein Standard-KBr-Kügelchen gepresst, wobei die Endkonzentration des Mucoprotids
1 betrug. Das Infrarot-Spektrophotometer wurde für jede Kurve gegen Polystyrol geeicht.
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Arten der Verabreichung und Dosierung: Das erfindungsgemäss hergestellte
Produkt kann durch alle parenteralen Wege (intravenös, intramuskulär, subkutan,
intraperitoneal) aber auch oral verabreicht werden. Die in Stufe V beschriebene
Lösung kann die Form sein, in der das Produkt verabreicht wird. Die Lösung kann
aber auch lyophilisiert und das trockene Produkt kann als solches zusammen mit einem
Träger, wie Laktose, Stärke oder Cellulose verabreicht werden.
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Für orale Anwendung kann das Präparat in Form von Pillen, Tabletten
oder Waffeln vorliegen. Eine besonders vorteilhafte Art des Einnehmens besteht darin,
dass eine Pille, Tablette, Waffel oder wässrige Lösung, die 10 bis 15 mg des aktiven
Präparates aus Stufe III enthält, im Mund zwischen dem Zahnfleisch und den Wangen
gehalten wird. Diese Art der Verabreichung vermeidet oder verringert zumindest weitgehend
einen Verdauungsangriff auf die aktiven Stoffe; verhindert oder verringert mögliche
allergische Reaktionen auf perenterale Verabreichung; sie ermöglicht es, dass der
Patient sich selbst behandelt; und sie bringt diese Mucoprotide eher in die Kategorie
eines nahrhaften Zusatzstoffes (beispielsweise Leber- oder Bauchspeicheldrüsen-Extrakt)
als einer reinen Droge oder eines reinen Arzneimittels.
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Empfohlene Dosierungen sind, wie oben erwähnt, etwa 0,5 mg bis 2,0
mg des aktiven Stoffes pro 50 kg Gewicht. Die Häufigkeit der Behandlung hängt von
verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise
der Krankheit, der Dauer
derselben (akut oder chronisch), gleichzeitige Behandlung mit anderen Mitteln, Alter
sowie Ernährungszustand des Patienten.
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Medizinische und veterinäre Brauchbarkeit Das erfindungsgemäss hergestellte
Produkt eignet sich zur Behandlung und/oder Verhütung allergischer und überempfindlicher
Zustände, toxischer Zustände, ungünstiger und unerwünschter Nebenwirkungen gewöhnlicher
Drogen und zur Behandlung von Drogenabhängigkeit und Alkoholismus. Das Präparat
ist besonders geeignet, wenn der krankhafte Zustand von einer Schädigung der Leberfunktion
begleitet wird oder von einer solchen herrührt, beispielsweise einer Verschlechterung
des Leberparenchyms. Beispiele von Zuständen, die bereits erfolgreich behandelt
wurden oder behandelt werden können, sind Drogenabhängigkeit, wie narkotische Analgetika
(z.B. Heroin und Kokain), Alkoholismus, und ungünstige Nebenwirkungen therapeutischer
Drogen, wie Penicillin und Chloromycetin.
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Obwohl verschiedene Zpezifische Dosierungen für solche klinische Anwendungen
festgelegt worden sind, werden die günstigsten Ergebniss da erhalten, wo die Verwendung
von Mucoprotiden gleichzeitig durch eine Ernährungsdiät unterstützt wird, die dazu
dient, die normale Leberfunktion schnellstens wiederherzustellen, und zwar durch
Wiederaufbau des Leberparenchyms. Infolgedessen werden in sehr fortgeschrittenen
oder ernsthaft geschwächten und angegriffenen Fällen die besten klinischen Reaktionen
dann erhalten, wenn eine entsprechende Mucoprotiddosis zusammen mit einer gut abgestimmten
Diät einschliesslich intensiver Zugabe von Vitaminen, Bioflavinoiden und vorverdautem
Protein (d.h. ein ausgewogenes Gemisch freier Aminosäuren) verwendet werden, um
eine schnelle Wiederherstellung des angegriffenen Lebergewebes zu sichern. Ein solches
raches Ansprechen auf die Behandlung und eine rasche Genesung sind besonders wichtig
bei
Alkohol-/und Drogenabhängigkeit, wo ein plötzlicher Entzug
der Droge zu ernsthaften Problemen und einer hohen Rückfälligkeitsrate führen kann.
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Als Beispiel wird eine Behandlung angeführt, die bei einem von Heroin
abhängigen Patienten durchgeführt wurde, der unter so qualvollen Entziehungssymptomen
litt, dass er sich weigerte, eine neue Entziehungskur zu machen.
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Dieser Patient wurde durch intravenöse Injektion behandelt, wobei
zunächst zweimal täglich 1 ccm des Präparats injiziert wurde. Dann wurden die Intervalle
grösser. Die Behandlung wurde durch eine entsprechende Diät unterstützt, die mit
Vitaminen, Bioflavinoiden und Aminosäuren stark angereichert war. Zu Beginn und
dann wieder nach vier Wochen der Behandlung wurde Bromosulfothalein verabreicht.
Eine normale Leber beseitigt bzw. verarbeitet Bromosulfothalein (BSP) schnell, während
eine angegriffene Leber eine längere Verweilzeit des BSP gestattet.
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Bei diesem Patienten wurden zu Beginn der Behandlung nach 45 Minuten
28 des Bromosulfothaleins zurückbehalten, während diese Menge nach 4-wöchiger Behandlung
auf 1,9% in 45 Minuten zurückging. Nach weiteren 4 Wochen hatte dieser Patient kein
Verlangen nach harten Drogen, wie Heroin.
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Bedeutung der Mucoid-Komponenten usw.
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Es wurde gefunden, dass hochgereinigte Proteinderivate der Säugetierleber,
beispielsweise das 97%-ig reine, von Fortini in der US-PS 3 701 768 vorgeschlagene
Material, weniger wirksam und weniger stabil sind als das erfindungsgemäss hergestellte
Mucoprotid. Dieses Produkt ist ein Gemisch aus mucoprotidischen, eiweisshaltigen
Stoffen und nicht ein einziges oder einfaches Protein, wie Orgotein (beispielsweise
US-PS 3 624 251) oder Acutalyn (US-PS 3 701 768). Ausserdem enthält das erfindungsgemässe
Produkt eine bedeutende Mucoid-Komponente, die chemisch
in der
einen oder anderen Weise an der protidischen Komponente gebunden ist. In gewisser
Weise, die zur Zeit nicht erklärt werden kann, ist diese Mucoid-Komponente wichtig
für die biologische und therapeutische Wirksamkeit, trägt zur Stabilität bei und
bewirkt eine grössere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse von einer Charge zur anderen.
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Es wird wiederholt, dass die oberen beiden Phasen in Stufe III erfindungsgemäss
verwendet und die mittlere Phase verworfen wird, und zwar entsprechend der Lehre
in der US-PS 3 701 768 (Fortini). Ferner wurden in früheren Verfahren (beispielsweise
bei Fortini) niedrige Temperaturen und daraus resultierende lange Behandlungszeiten
benötigt, beispielsweise 50 C und viele Wochen. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren
wird in den meisten Verfahrensstufen bei Zimmertemperatur gearbeitet, wobei die
Behandlungszeit stark verkürzt wird und die Ausbeuten grösser werden. Auch die Reaktionsgeschwindigkeit
des Verfahrens ist sehr viel schneller als bei den bekannten Verfahren, so dass
die Gefahr von bakteriellen Verunreinigungen (Pyrogenesität) weitgehend verringert
ist.
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Eine rohere Form des Produktes ist diejenige, die in Stufe III erhalten
wird. Sie kann mit gewissen Vorteilen eher oral als parenteral oder durch Injektion
verabreicht werden. Das durch den Mund eingenommene Präparat besteht aus den beiden
oberen Schichten in Stufe III. Es ist halbgereinigt und enthält gewöhnlich erhebliche
Mengen äusserlicher eiweisshaltiger Verunreinigungen, die häufig ernsthafte anaphylaktische
Reaktionen hervorrufen, wenn sie parenteral verabreicht werden. Daher ist dieses
Rohprodukt für Injektionen nicht geeignet. Diese Rohform des Produktes kann jedoch
wirksam oral eingenommen werden, da diese anaphylactoiden eiweisshaltigen Substanzen
(Verunreinigungen) als solche durch die Mundschleimhaut nicht absorbiert aber gegebenenfalls
durch die Enzyme des Magendarmkanals verdaut
werden. Dagegen werden
therapeutisch bedeutende Mengen des Mucoprotids durch die Mundschleimhäute in den
Körper absorbiert.
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Erprobung am lebenden Tier Die Fachwelt war bei den bisherigen Arbeiten
zur Herstellung bzw. Isolierung von medizinisch brauchbaren eiweisshaltigen Stoffen
aus Leberparenchym oder Lebergewebe oder anderen Organgeweben bemüht, ein reines
Protein zu erhalten, da angenommen wurde, dass dieses eine wirksamere Komponente
sei als die roheren Produkte. Erfindungsgemäss wurde jedoch ein Derivat eines solchen
Gewebes hergestellt (beispielsweise wie es oben beschrieben ist), das lückenlos
eine bedeutende und messbare in vivo Wirkung zeigt. Diese Wirksamkeit wurde bei
Leberschädigung nachgewiesen, die durch einen oder mehrere klar definierte Gründe
hervorgerufen werden und sie ist messbar. Die Gründe sind akute Allylalkoholvergiftung
und Tetrachlorkohlenstoff-Vergiftung der Leber. Untersucht wurden Ratten. Der Test
für die Wirkung auf Leberfunktionen war die Beseitigung bzw. der Abbau von Bromosulfothalein
(BSP) oder Leberschädigung getöteter Tiere.
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BSP-Abbau ist ein anerkanntes Kriterium der Leberfunktion.
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(Varley, "Practical Clinic S Ciochemistry", Seiten 293-294, Interscience
Publishers, N.Y. 1958). BSP intravenös verabreicht, wird im Blutkreislauf leicht
festgestellt. Es wird durch die Leber abgebaut. Eine normale Leber tut dies rasch,
während eine geschädigte Leber viel langsamer arbeitet. Die Zeit> die erforderlich
ist, um einen BSP-Gehalt bis zu einem vorbestimmten Grad abzubauen ist ein entsprechendes
quantitatives Maß für die Leberfunktion. Die Untersuchung der Leber getöteter Tiere,
denen das toxische Mittel verabreicht wurde, gibt eine halb-quantitative Kontrolle.
Einzelheiten der Untersuchungen werden nun näher erläutert.
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(1) Leberschädigung aufgrund einer Allylalkoholvergiftung Männliche
Wistar-Ratten, Gewicht 180 bis 200 g, wurden in Gruppen von je 20 mit Allylalkohol
behandelt, der in Mengen von 0>4 ml einer 1%-igen wässrigen Lösung Allylalkohol
pro 100 g Tiergewicht per os verabreicht wurde. Eine Gruppe der Tiere wurde vor
Behandlung mit Allylalkohol preventiv mit einer Mucoprotid-Lösung behandelt, wobei
subkutan Dosierungen von 1 m1/100 g Tiergewicht jeweils 48, 24 und 1 Stunde(n) vor
der Allylalkoholzugabe verabreicht wurden. Eine andere Gruppe der Tiere wurde einer
Heilbehandlung unterzogen, wobei jeweils 1, 6, 24 und 30 Stunde(n) nach Verabreichung
des Allylalkohols die gleichen Dosierungen der Mucoprotid-Lösung verwendet wurden.
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Alle Gruppen wurden 48 Stunden nach der Allylalkoholeinnahme getötet.
Eine letzte Mucoprotid-Injektion wurde 30 Stunden nach der Vergiftung vorgenommen,
da nach 36 Stunden eine Lebernekrose deutlich sichtbar wird.
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Die Ergebnisse von drei aufeinanderfolgenden Experimenten sind in
der folgendenen Tabelle zusammengefasst.
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Tabelle I Akute Allylalkohol-Vergiftung, Gramm geschädigtes Lebergewebes
Versuch Nr. Kontrolle Vorbeugend Heilend I 7.10 0.59 1.30 II 8.00 0.62 1.65 III
8.34 0.72 1.33 70-80 <10% 420% Die Untersuchung der Leber der toten Tiere zeigte
deutlich eine ausgedehnte perilobuläre Lebernekrose. Die Behandlung mit Mucoprotid
verringerte die Nekrose erheblich oder beseitigte sie
ganz, gleichgültig
ob die Behandlung vorbeugend oder heilend erfolgte. Diese die Leber schützende Wirkung
des Mucoprotids ist deutlich aus der obigen Tabelle ersichtlich.
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(2) BSP-Abbau nach Verabreichung von Tetrachlorkohlenstoff Tetrachlorkohlenstoff
wurde drei Wochen lang und zweimal wöchentlich in Dosierungen von 0,1 ml/100 g Tiergewicht
männlichen Wistar-Ratten (Gewicht 150 bis 200 g) subkutan zugeführt.
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Die Ratten waren in Gruppen von je 20 eingeteilt. Nach der Tetrachlorkohlenstoffbehandlung
wurde einer Guppe Mucoprotid in einer Dosierung von 0,5 ml/100 g Tiergewicht täglich
5 Tage lang subkutan verabreicht. 24 Stunden nach Beendigung der Mucoprotid-Behandlung
wurde beiden Gruppen (eine behandelt und eine nicht behandelt) eine Lösung aus 1%
BSP in einer Menge von 0,5 mg BSP pro 100 g Tiergewicht intravenös verabreicht.
Blutproben wurden nach 1 Minute und nach 10 Minuten entnommen. Die Menge des BSP
im Serum wurde durch Modifizieren der klinischen Methode, beschrieben in Varley,
ermittelt und die Werte des zurückgehaltenen BSP wurden durch die Formel Konzentration
BSP bei 10 Minuten BSP-Verbleib = Konzentration BSP bei 1 Minute x errechnet.
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Die Ergebnisse dreier aufeinanderfolgender Versuche sind in der folgenden
Tabelle zusammengefasst: Tabelle II BSP-Verweilzeit (Minuten) Versuch Nr. Kontolle
CCl4 CCl4 & Mucoprotid I 15 t 4 35 + 4 18 t 4 II 18 +- 4 28 t 5 19 + 2 III 17
+ 3 28 + 6 17 + 4 100% Ansteigen kein Ansteigen der BSP-Verweil- der BSP-Verweilzeit
zeit
Die Daten dieser Tabelle zeigen, dass innerhalb der Versuchsfehler
die mit Mocuprotid behandelten Tiere wieder eine normale Leberfunktion zeigten,
was durch die normalen Werte für den Abbau von BSP deutlich wird. Weitere Untersuchungen
der Rattenleber nach chronischer Vergiftung mit Tetrachlorkohlenstoff zeigten eine
bedeutende Verringerung der zentralen lobulären Nekrose von Hepatocyten bei den
Tieren, die mit Mucoprotid behandelt wurden, verglichen mit unbehandelten Tieren.
Der mikroskopische Beweis stimmt überein mit dem Rückgang der BSP-Werte zum Normalniveau
mit der Gesamtleberfunktion.
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Es wird bemerkt, dass die erste Methode die Erzeugung und Verhütung
perilobulärer Lebernekrose betrifft, während sich die zweite Methode auf die Erzeugung
und Verhütung zentraler lobulärer Lebernekrose bezieht. Da die Lebergewebeuntersuchung
gezeigt hat, dass beide Arten der Leberschädigung in klinischer und veterinärer
Praxis durchgeführt werden kann, wurden beide Versuchsmethoden beim Standartisieren
spezifischer Produktionschargen von Mucoprotid angewendet.
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Die biologische Wirksamkeit der Mucoprotid-Präparate wird durch eine
minimale Menge bestimmt, die zum Verhüten oder Korrigieren einer durch beide der
oben beschriebenen Versuchsreihen hervorgerufenen Leberschädigung erforderlich ist.
Obwohl sowohl der BSP-Verweiltest (Schädigung durch Tetrachlorkohlenstoff) als auch
der akute Alkoholvergiftungs-Test bei der letzten biologischen Auswertung (Versuch
am lebenden Tier) einer bestimmten Produktionscharge von Mucoprotid verwendet werden,
wird der BSP-Verweiltest als kritischer Test angesehen, da er eine quantitative
und objektive Methode ist. Dieser Test ist dem entsprechenden routinemässigen klinischen
Labortest unmittelbar verwandt, der zur Auswertung der Leberfunktion dient. Trotz
der halbquantitativen Natur des Alkoholverfigtungs-Testes scheint eine gute Korrelation
zwischen den beiden Testarten zu bestehen.
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Die Standartisierung der rohren, oral zu verabreichenden Form wird
so durchgeführt, dass ein Aliquot dieser halb-gereinigten Mucoprotidcharge entnommen
wird und durch sämtliche Verfahrensschritte als Laborversuch behandelt wird. Zum
Schluss werden die isolierten Mucoprotide durch zwei Tierversuche, wie oben beschrieben,
ausgewertet. Die endgültige Dosis der oral zu verabreichenden Form wird so vermittelt,
dass eine aliquote Probe, die das Zehnfache der entsprechenden parenteralen Dosis
an Mucoprotiden enthält, verwendet wird. Der Faktor "zehnfach" der parenteralen
Dosis wurde durch klinische Versuche bestimmt und ist ein brauchbarer Faktor hinsichtlich
des Rohzustandes des Produktes und der Unsicherheit der Absorption durch die orale
Verabreichung verglichen mit dem parenteralen Weg.
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