DE2806181C2

DE2806181C2 - Polysaccharid, Verfahren zu dessen Herstellung und Arzneimittel, das dieses Polysaccharid enthält

Info

Publication number: DE2806181C2
Application number: DE2806181A
Authority: DE
Inventors: Gianfranco Mailand/Milano Fedeli
Original assignee: MEDIOLANUM FARMACEUTICI Srl MAILAND/MILANO IT; Mediolanum Farmaceutici Mailand/milano Srl
Current assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA
Priority date: 1977-02-14
Filing date: 1978-02-14
Publication date: 1985-10-24
Also published as: LU79021A1; JPS6159291B2; DE2806181A1; JPS53118510A; NL188413B; FR2380301A1; NL188413C; GB1564592A; NL7801682A; IT1075117B; US4489066A; IE46326B1; DK64078A; IE780222L; FR2380301B1; SE443292B; DK161973B; DK161973C; BE873842Q; SE7801631L

Description

Z Verfahren zur Herstellung des Polysaccharids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man:

i) die Aorten von Schweinen oder Kälbern isoliert und unmittelbar nach dem Schlachten fein vermahlt, ii) die vermahlenen Gewebe homogenisiert und in Wasser oder Kochsalzlösung suspendiert, iii) auf die erhaltene Suspension proteolytische Enzyme, wie Trypsin, Chymotrypsin, Pankreatin, Papain. Ficin oder Bromelain unter den entsprechenden optimalen pH-Werten und Temperatur- und Zeitbedingungen einwirken läßt,

iV) die so behandelte Flüssigkeit abfiltriert und sammelt,

V) das Polysaccharid aus dieser Flüssigkeit durch mit Wasser mischbare Lösungsmittel und/oder durch Bildung unlöslicher Ammoniumsalze ausfällt und

Vi) das Polysaccharid reinigt, indem man mit Alkali- oder Erdalkalimetallbasen in ein Salz überführt, mit Penranganat entfärbt, bei 70° C mit Alkali behandelt, um die Endglieder der verbleibenden Peptidketten zu entfernen, und das gewünschte Salz (Natrium-, Kalium-, Calciumsalze) mit Hilfe von Lösungsmitteln abtrennt, nitriert, steriüiiert und lyophilisiert.

3. Therapeutisches Mittel,' .rthaltend als Wirkstoff das Polysaccharid gemäß Anspruch 1 in einem üblichen pharmazeutischen Träger.

Die Erfindung betrifft ein Polysaccharid, ein Verfahren zu dessen Herstellung und ein Arzneimittel, das dieses Polysaccharid enthält, gemäß den vorstehenden Patentansprüchen.

In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Medikamente entwickelt, welche verschiedene Lipidkomponenten im Serum auf normale Konzentration zurückführen sollen. Hyper- und Dislipidämie spielen insbesondere bei der Äthiopathogenese zahlreicher Erkrankungen eine große Rolle. Diese Medikamente kann man entspre chend ihrer Wirkungsweise wie folgt einteilen:

Medikamente, weiche

1) die intestinalen Cholesterinabsorption inhibieren,

so 2) die Gallensteinsäuresekretion beeinflussen,

3) die Cholesterinsynthese und die Mobilität der Fettsäuren des adipösen Gewebes inhibieren,

4) die Fibrinolyse und Thrombolyse aktivieren und

5) einen verstärkten Abbau von Lipoproteinen begünstigen.

Von den letztgenannten Arzneimitteln haben Heparin und analoge Substanzen, welche als Heparinoide bekannt sind, bei der Behandlung von Hyper- und Dislipidämien besondere Bedeutung gewonnen.

Unter den zahlreichen pharmakologischen Wirkungen von Heparin ist eine von besonderer Bedeutung, nämlich die sogenannte Klärungsaktivität, wodurch ein Auftreten von Lipoproteinlipase im Blut induziert wird. Es handelt sich dabei um ein physiologisches Enzym, das die Esterbindungen von Triglyceriden spaltet und diese in Monoglyceride und freie Fettsäuren überführt. Diese Wirkung besteht neben der antikoagulierenden Wirkung des Heparins. Diese antikoagulierende Wirkung ist nachteilig und begrenzt die Anwendbarkeit von Heparin bei dieser Art von Therapie.

Auf dem Gebiet der antiarteriosklerotischen Therapie wurde in Veröffentlichungen (Comi et aU BoII. Chim. Farmac. 106,309-21 (1967); FR-PS M 4 871, auch berichtet, daß bei Kaninchen, welche durch cholesterinreiche Ernährung hypercholesterinämisch gemacht wurden, die Verabreichung von Aorta-Gesamtauszügen eine starke Reduzierung der Atheromatosebildungen bewirkte. Andererseits wurde gezeigt (Dall'Occhi et al., Adv. Exi. Med. Biol. 1967, 468—83), daß die Verabreichung von Aorta-Gesamtextrakten zu Immunreaktionen führt, welche schädliche Nebenwirkungen auf die Lungenarterien haben.

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß man ein spezielles Polysaccharid mit anionischem Charakter aus den Aorten von Schweinen und Kälbern extrahieren kann, welches überraschende anti-arteriosklerotische Eigenschaften hat und keinerlei schädliche Nebenwirkungen hervorruft.

Dieses Polysaccharid, das in der weiteren Beschreibung der Einfachheit halber FAPA genannt wird (arterieller Antiarteriosklerose Polysaccharid-Faktor), wird durch die folgenden chemischen Eigenschaften eindeutig charakterisiert:

a) Bei der Hydrolyse werden Hexosamin, Uronsäuren und Sulfate in Molverhältnissen von etwa 1:1:1 mit variablen Mengen an Nukleosiden freigesetzt

Nach saurer Hydrolyse von FAPA ergibt eine Analyse die folgende durchschnittliche Zusammensetzung der Polysaccharidkomponenten.

Hexosamin (Glucosamin): spezifische colorimetrische Reaktion des Amins in Hexosen mit p-Dimethylaminobenzaldehyd = 30 ± 2^5% Uronsäure: spezifische colorimetrische Reaktion mit Carbazol = 30,5+5%

organisches SO4: In Obereinstimmung mit FU (pharmacopea ufficiale),

8. Auflage, Band !,Seite 106, Abs. B = 16,5±3%

Na: Bestimmt durch Atomabsorption (nicht routinemäßig) = 10±2%

Asche = 15 ±3%

b) Elektrophoretisch trennt es sich in drei anionische Banden, welche mit Alcian Blau und Toluidin Blau unterscheidbar sind.

Die nachstehende Tabelle zeigt die relative elektrophoretische Mobilität der drei anionischen Banden. Bande Anodische Mobilität mittlere densitometrische

Verhältnisse positiver Toluidin-Blau-Banden

1 U = 2,2±0,5 · 10-⁴cm²V-'sek.' 14±3%

2 L-'= 2,09±0,5 · lO-^cm^V-isek.¹ 9±2%

3 U= l,93±0,05· 10-⁴cm²V-'sek.· 77 ±8%

Der elektrophoretische Test wurde wie folgt durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid wurde in einer Konzentration von 2% in einer Pufferlösung gelöst, die aus Pyridin/Wasser/Essigsäure (1 :129 :10) bestand und einen pH von 4,5 besaß. Ein Cellulosestreifen (17 χ 25 cm) wurde 15 Minuten in diese Lösung getaucht und dann auf eine Brücke (11 cm) einer elektrophoretischen Zelle gelegt. 10 μΐ der Pufferlösung wurden auf den Streifen in der Nähe des negativen Pols getropft. Dann wurde 90 Minuten eine Spannung von 100 V angelegt. Anschließend wurde der Streifen 15 Minuten in eine Toluidin-Blau-Lösung getaucht und dann mehrere Male mit einer 1 :1-Mischung von Methanol und verdünnter Essigsäure (3%) gewaschen. Es wurden drei anionische Banden erhalten, die mit Toluidin-Blau klar voneinander unterscheidbar waren.

c) Es kann mit Alkali- und Erdalkalimetallen umgesetzt werden und bildet dabei Salze, welche in Wasser sehr gut löslich sind, wohingegen die Salze, die mit aliphatischen Ammoniumionen gebildet werden, unlöslich sind.

d) Das Natriumsalz ist zu 2% in 50%igem Äthylalkohol löslich, während die freie Säure zu 2% iii 7O°/oig2m Äthylalkohol löslich ist.

c) Das Polysaccharid reagiert mit Toluidin-Blau, wobei sich eine minimale metachromatische Reaktion ergibt (etwa 1/lOderjenigen von Heparin).

Es zeigt ein Drehvermögen [λ]? von — 11 ° bis - 22° (5°/oige wäßrige Lösung), g) Das IR-Spektrum der Substanz in KBr, welches in F i g. 1 dargestellt ist, ergibt die folgenden Funktionen:

-CGOH

-NHR

-COCH3

-OSO3H -CH₂OH

Das IR-Spektrum wurde wie folgt bestimmt.

g des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurden in 100 ml H2O gelöst and mit 30 g eines Ionenaustauscherharzes (Castel-C300 (Warenzeichen der Firma Montecatini), H+-Form) vermischt. Nach 15 Minuten wurde das Harz abgetrennt. Anschließend wurden Aceton und 1 g NaCI zu dem Filtrat gegeben. Das gebildete Präzipitat wurde abgetrennt, mit reinem Aceton von Wasser befreit und dann im Ofen im Vakuum getrocknet. Das gepulverte Produkt wurde mit wasserfreiem KBr vermischt und zu einer Pille verpreßt, mit der das IR-Spektrum aufgenommen wurde.

IO

25 30 35 40

Aus den Analysen ergibt sich, daß FAPA folgende Struktureinheiten aufweist:

Ov

\T\ R,O

CH₂OR₁

NHR₃

(D

COOH

NHiI₃

worin

Ri und R₂ für — H oder —SOjH stehen, und

COOH

H₃COR₁

NHR₃

Ri für -SO3H und R₃ für -CO-CH₃ stehen, und

m. η und ρ ganze Zahlen sind, welche in einem großen Bereich variieren können und Molekulargewichte von 10 000 bis 30 000 Dalton für die Polysaccharidketten bezeichnen.

Diese Eigenschaften und insbesondere die Molverhältnisse der Bestandteile, welche nach der Hydrolyse erhalten werden, zeigen, daß FAPA chemisch als ein Molekül bezeichnet werden kann, das Hexosaminglucanmonosulfate enthält und zwar Chondroitinsulfat B (Struktureinheit I), Chondroitinsulfat A oder C (Struktureinheit II) und Hrparitinsulfat (Struktureinheit HI) der Arterienwand.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von FAPA ist dadurch gekennzeichnet, daß man

i) die Aorten von Schweinen oder Kälbern isoliert und unmittelbar nach dem Schlachten fein vermahlt

ii) die vermahlenen Gewebe homogenisiert und in Wasser oder Kochsalzlösung suspendiert, iii) auf die erhaltene Suspension proteorytische Enzyme, wie Trypsin, Chymotrypsin, Pankreatin, Papain, Ficin oder Bromelain unter den entsprechenden optimalen pH-Werten und Temperatur- und Zeitbedingungen einwirken läßt

i V) die so behandelte Flüssigkeit abfiltriert und sammelt

V) das Polysaccharid aus dieser Flüssigkeit durch mit Wasser mischbare Lösungsmittel und/oder durch BiI-, 60 dung unlöslicher Ammoniumsalze ausfällt und

Vi) das Polysaccharid reinigt, indem man mit Alkali- oder Erdalkalimetallbasen in ein Salz überführt mit Permanganat entfärbt bei 70⁰C mit Alkali behandelt um die Endglieder der verbleibenden Peptidketten zu entfernen, und das gewünschte Salz (Natrium-, Kalium-, Calciumsalze) mit Hilfe von Lösungsmitteln abtrennt filtriert sterilisiert und lyophiüsiert

Hinsichtlich seiner pharmakologischen Eigenschaften wurde FAPA im Vergleich mit bestimmten antiartcriosklerotischen Präparaten der vorgenannten Arten, insbesondere im Vergleich mit Heparin, dem klärenden Arzneimittel bei Antonomasie, und mit Aorta-Gesamtextrakt untersucht

Die folgenden grundlegenden Eigenschaften wurdi ;i bei in vivo Experimenten bestimmt:
1. Wirkung auf experimentell herbeigeführte Arteriosklerose

Diese Untersuchung wurde an Kaninchen durchgeführt, welche in Gruppen von 5 Tieren eingeteilt und mit einer cholesterinreichen heterogenen Diät ernährt wurden.

Es wurde das Blut der Tiere untersucht, um die veresterten Fettsäuren (EFA), das Gesamtcholesterin, die beta-uipoproteine und die Koagulationszeit zu bestimmen. Ferner wurde der Cholesteringehalt des Aortagewebes und das Auftreten von Atheromen untersucht.

Tabelle I faßt die Ergebnisse zusammen, welche nach 4Otägiger Behandlung unter Verwendung von FAPA, Heparin und Aorta-Gesamtextrakt erzielt wurden.

Tabelle I

EPA

mg/100 ml Serum

Cholesterin mg/100 ml Serum

B-Lipoproteine mg/100 ml Serum

Koagulationszeit log. Min.

Aoria-Cho-

lesterinmg/IOOg

Trockensubstanz

Atherome 15

456	±	14	215	±	19	78	±	4	0./8	±	0,06	2,85	±	Ο.Ί2
180	±	5	90	±	15	40	±	2.5	0,81	±	0.04	1.98	±	0,08
162	±	8	76	±	13	35	±	13	0,9	±	0,04	1.7	±	0,04
171	±	11	78	±	13	38	±	1	1,9	+	0,4	2	±	0,05
138	±	8	76	±	15	30	±	2	2,3	±	0,8	1.8	±	0.03
430	±	14	190	±	14	79	±	3	0,75		0,1	2.9	±	0.2
218	±	4	97	±	1	36	₊	4	0,78	±	0,1	1,6	±	0,04

Kontrolle FAPA 1 mg/kg IAPA 10 mg/kg Heparin 1 mg/kg Heparin 10 mg/kg Aorta-Gesamtcxlrakt,

1 mg/kg
Aorta-Gesamtextrakt,

10 mg/kg

4 + ■■ starkes Auftreten von Atheromen hinsichtlich Anzahl und Ausdehnung.

2 + = etwa 50% im Vergleich zur Kontrolle.

I + =■ Auftreten etwa gleich dem bei normalen Kaninchen.

2. Biologische Aktivität 1 linsichtlich der biologischen Aktivität wurde die antikoagulierende Wirkung (gemäß USP) und die Klärungs-

uktiviiät bei Rauen (Morton Grosman Verfahren, j. Lab. and Cün.

März !954, Seite 445) bestimmt. Bei der

Bestimmung des letztgenannten Parameters wurden einige Veränderungen vorgenommen, um die Wirkung in internationalen Lipase-Einheiten (ULI) gemäß der UIB Definition (International Biochemical Union) ausdrükken /u können, wobei eine internationele Einheit (ULI) gleich der Aktivität ist, welche das Substrat in einer Geschwindigkeit von 1 Micromol pro Minute umwandelt.

Die Ergebnisse der biologischen Untersuchungen von FAPA sind in Tabelle II im Vergleich mit Heparin und Aorta-Gesamtextrakt zusammengefaßt.

Tabelle Il

Heparin

Aortaextrakt

FAPA

antikoagulierende Wirkung(USP/mg) Klärungsaktivität (ULI/1 Plasma) bei einer Dosis von 03 mg/kg

135-148 480 ±100

3. Produkt-Verträglichkeit

etwa 0,5
15 + 7

5-15
270 ±80 50

a) Toxizität: FAPA wird von Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen, sowohl bei parenteraler als auch bei oraler Verabreichung von täglichen Dosen von 200 mg/kg gut vertragen.

b) Immunologische Versuche:

Bei Meerschweinchen, welche mit FAPA behandelt wurden, ergaben immunologische Versuche auf Antikörper und Anaphylaxie weder eine Antikörper- noch eine anaphylaktische Reaktion.

c) Vasokinetische Untersuchungen:

Es ergaben sich keine Auswirkungen weder des Histamin- noch des Adrenalintyps, sogar bei Dosen von 50 mg/kg.

Alle vorgenannten Versuche zeigen, daß FAPA als antiarteriosklereCisches Medikament verwendet werden kann, da seine Aktivität in der Größenordnung der des Heparins liegt, jedoch ohne das Risiko von Hämorrhagien, welche für die letztgenannte Substanz typisch sind.

_i Andererseits ist die biologische Aktivität von FAPA etwa zehnmal größer als die von Aorta-Gesamtextrakt, jedoch ohne immunologische Nebenwirkungen, was einen wesentlichen Vorteil in bezug auf die Posologic und die Gefahr der Sensibiüsierung während der Therapie bedeutet.

Nachsehend sind einige praktische Beispiele für die Herstellung des erfindungsgemäßen Polysaccharids aufgeführt.

ίο Beispiel 1

50 kg Kalbsaorta werden fein gemahlen und in 661 Wasser homogenisiert. Nachdem man die Masse langsam auf 50°C erhitzt hat, gibt man 0,6 kg Papain zu, das zuvor in 91 Wasser, welches 10 g Natrium-meta-bisulfit enthielt, suspendiert wurde.

Man erhitzt die gesamte Masse auf 65°C und läßt sie unter diesen Bedingungen 3 Stunden stehen, wobei man durch entsprechende Alkalizugabe dafür sorgt, daß der pH nicht unter 6 absinkt. Nach dieser Zeit erhitzt man die Masse 15 Minuten lang auf 95⁰C, läßt 30 Minuten stehen und filtriert dann über ein mit Filtererde beschichtetes Tuch.
Man gibt 0,6 kg Cetyltrimethylammoniumchlorid, gelöst in 35 I Wasser, zu dem Filtrat, und nachdem man über Nacht stehengelassen hat, wird die überstehende Flüssigkeit abgesaugt. Der Niederschlag wird abfiltriert und in 251 Wasser, das 3 kg Natriumchlorid enthält, gelöst, wobei man auf 70⁰C erhitzt. Diese Lösung wird durch Filtrieren geklärt. Das Filtrat wird mit einem gleichen Volumen Aceton behandelt. Man wäscht den Niederschlag, nämlich das rohe Natriumsalz von FAPA, mehrmals mit 70%igem Aceton und trocknet dann. Auf diese Weise erhält man 85 g des rohen Natriumsalzes von FAPA.

Man wäscht diesen Niederschlag dann in 1500 ml Wasser, stellt den pH auf 8 ein und behandelt dann mit 1,5 g Kaliumpermanganat und erhitzt allmählich auf 90⁰C. Den gebildeten Niederschlag filtriert man ab, stellt den pi I des Filtrats mit Natriumhydroxyd auf 11 ein und läßt es 10 Stunden bei 70⁰C stehen.

Danach kühlt man die Flüssigkeit, stellt den pH mit Chlorwasserstoffsäure auf 7 ein und filtriert über eine 0,8-micron-Membran. Die erhaltene Flüssigkeit behandelt man dann mit 2 Volumina Äthylalkohol. Nachdem man 2 Stunden stehengelassen hat, wird der Niederschlag abfiltriert und mit 500 ml 75%igem Alkohol gewaschen. Dann löst man den Niederschlag in 800 ml Wasser und engt ein, bis der Alkohol entfernt ist. Man filtriert das Konzentrat über eine 0,2-micron-Membran und lyophilisiert das klare Filtrat.
Auf diese Weise erhält man 42 g des Natriumsalzes von FAPA, welches folgende Eigenschaften aufweist:

Uronsäure 35%

Hexosamin 30,5%

-So₃Na iS,i%

— Nucleoside 5,2%

anorganische Salze 8% (hauptsächlich Chloride)

Klärungs-Aktivität 210 ±20 ULI/1

antikoagulierende Aktivität 6 UI/mg

Beispiel 2

Man verarbeitet 50 kg Schweine-Aorta wie in Beispiel 1 beschrieben und erhält 36 g des Natriumsalzcs von FAPA, dessen chemisch-physikalische Eigenschaften denen gemäß Beispiel 1 fast analog sind und welches eine Klärungsinduktions-Aktivität von 180±30 ULI/1 hat.

Beispiel 3

Man lysiert 50 kg Kalbsaorta mit Ficin anstelle von Papain und arbeitet ansonsten wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ausbeute beträgt 35 g des Natriumsalzes von FAPA mit chemisch-physikalischen Eigenschaften, die denen gemäß Beispiel 1 fast analog sind: die Klärungs-Aktivität beträgt 280 ±40 ULI/I.

Beispiel 4

Man homogenisiert 50 kg Kalbsaorta in 1501 Wasser und lysiert mit 2 kg Pankreatin bei pH 8 und 40⁰C während 24 Stunden, in Gegenwart von Toluol als Bakteriostatikum.

Nach dem Abfiltrieren wird die klare Flüssigkeit mit 3 Volumina Aceton behandelt Den erhaltenen Niedcrschlag hydrolysiert man 15 Stunden mit Alkali bei pH 11 und 70° C. Nach dem Abfiltrieren behandelt man die Flüssigkeit mit 400 g Cetylpyridiniumchlorid. wobei man dann das entsprechende unlösliche Ammoniumsalz von FAPA erhält Den Niederschlag löst man dann in 1500 ml Wasser, das 90 g Calciumchlorid enthält Nach dem Abfiltrieren wird die Flüssigkeit bei pH 8 mit 1 g Kaliumpermanganat behandelt, auf 90⁰C erhitzt und abfiltriert.

•us Filtrat wird 15 Stunden lang gegen einen Wasserstroni dialysiert, um überschüssige Salze zu entfernen, dann
urch eine 0,45-micron-Membran abfiltriert und lyophilisiert.

Auf diese V/eise erhält man 35.5 g des Calciumsalzes von FAPA, dessen chemisch-physikalische Eigenschaften
encn des Produkts gemäß Beispiel 1 fast analog sind, wobei die Klärungsinduktionsaktivität 315±30 ULl/l
cirägt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Polysaccharid, bestehend aus Hexosamin-glucanmonosulfaten mit Molekulargewichten von 10 000 bis 30 000 Dalton, erhältlich aus den Aorten von Schweinen und Kälbern gemäß dem Verfahren nach Anspruch 2, mit folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften·.

a) Bei saurer Hydrolyse werden Hexosamin, Uronsäuren und Sulfatgruppen in einem Molverhältnis von etwa 1:1:1 zusammen mit variablen Mengen an Nucleosiden freigesetzt;

b) elektrophoretisch erfoigt eine Auftrennung in drei anionischen Banden, welche mit AIcian Blau und Toluidin Blau sichtbar gemacht werden können;

c) mit Alkali- und Erdalkalimetallbasen bilden sich wasserlösliche Salze, während mit aliphatischen Ammoniumionen wasserunlösliche Salze entstehen;

d) das Natriumsalz ist zu 2% in 50°/oigem Äthylalkohol löslich, wohingegen die freie Säure zu 2% in 70%igem Äthylalkohol löslich ist;

e) das Polysaccharid reagiert mit Toluidin Blau, wobei sich eine minimale meiachromatische Reaktion

ergibt; f) das Drehvermögen [«]? beträgt —11 ° bis —22° (5%ige wäßrige Lösung).