SE443292B - Sett att framstella ett arteriellt polysackaridkomplex fran aorta av unga deggdjur - Google Patents

Description

7801631-s 2 bär att det i blodströmmen förekommer ett lipoproteinlipas, ett fysiologiskt enzym, som skiljer triglyceridernas esterbindningar och omvandlar dem till monoglycerider och fria fettsyror. Denna verkan är fullständigt oberoende av antikoagulationsverkan, som utgör den negativa sidan och bestämmer gränserna för heparinets användning i denna typ av terapi.

Inom antiarteriosklerosterapin har man vidare uppgivit i pub- licerade arbeten (Comi och Coll. - Boll. Chim. Farm. 106/5-309/21 (l967); Fr PS M 4,871) att man genom att administrera extrakt av' hel aorta till kaniner, som gjorts hyperkolesterolemiska med mflesür rolbaserad diet, kan åstadkomma en kraftig reduktion av ateromatos- bildningar. Å andra sidan har man visat (Dall'Occhi och Coll. Adv.

Exi. Med. Biol. 1967 1,468/83) att extrakt av hela aorta leder till immunitetsreaktioner med negativa effekter på pulmonarartä~ rerna. ' Man har nu upptäckt och föreliggande uppfinning grundar sig på denna upptäckt att det är möjligt att extrahera ett specifikt poly-- sackaridkomplex med anjonisk karaktär från unga däggdjurs aorta, vilket komplex har uppvisat överraskande antiarteriosklerotiska egenskaper förutom en fullständig avsaknad av biverkningar. _ Detta nya komplex, som för enkelhets skull i det följande kom- mer att betecknas med bokstäverna FAPA (arteriell antiarterioskle- rotisk polysackaridfaktor) utmärkes otvetydigt av följande kemisk- fysikaliska engenskaper: a) vid hydrolys frigör det hexosamin, uronsyror och sulfater i det ungefärliga molförhållandet LG/l med varierande mängder nukleosider.

- Efter sur hydrolys av FAPA visar analys följande genomsnittliga sammansättning av polysackaridkomponenterna: I - Hexosamin (glukosamin): specifik kolorimetrisk reaktion av aminen i hexoser med p-dimetylaminobensaldehyd = 30t2,25% Uronsyra: specifik kolorimetrisk reaktion med karbazol==30,5i5% - Organiskt $O¿: i överensstämmelse med FU 8:de utgåvan,' Vol. I, sid 106, stycke B = 16,5¿3% - Na: bestämd genom atomabsorption (ej rutin).= = l0r2% - Aska ' = l5r3% b)^ elektroforetiskt uppdelas FAPA i tre anjoniska band, som kan skiljas med alcianblått och toluidinblått.

Följande tabell visar de tre anjoniska bandens elektroforetiska mobilitet 3 78Û1651~8 Genomsnittliga densi- tometriska förhållan- Band Anodisk mobilitet den för pøsitiva band av toluidinblått U = 2,2 1 0,5 . 1o'4cm2v'1s'1 14 1 3% U = 2,09 1 o,s . 1o'4cm2v'1s'1 9 1 2% U = 1,93 1 0,05 .1o'4cm2v'1s'1 77 1 8% c) det reagerar med alkalimetaller och alkaliska jordartsmetaller d) e) f) 9) h) och bildar salter, som är mycket lösliga i vatten, medan dåre* mot de salter, som FAPA bildar med den alifatiska ammoniumjo- nen,är olösliga. natriumsaltet är till 2% lösligt i 50% etylalkohol, medan däre- mot syraformen är till 2% löslig i 70% etylalkohol det reagerar med toluidinblått och ger en minimummetakromatisk reaktion (ungefär 1/10 av den, som fås med heparin) spektrofotometriskt visar det ett maximum vid 260 1 l nm det har en vridande förmåga på polymeriserat ljus på -ll° till -22° det spektrum avsubstansen bestämt i KBr, vilket framgår av dia- följande funktioner: - COOH ~ NHR - COCH 3 - OSO3H - CH2OH Av summan analytiska data kan man fastslâ att FAPA har en struk- gramet i fig l, visar tur av följande typ: 7801651-8 . 4 .F coon R 2 KV O s \ on “ _: .__ - *Jm i on NHR3 _ COOH CH on _' t,__t__ .O 2_p};__0 __ *_ '''' F- _ -Än \¥H on NHR3 - coon zcon _? p /,,...f..__.0 jplilf, _ . _/ R 0/ - o \ï}_l. -. _ \________ _ H NHR3 _ p vari Rl och R2 betecknar -H eller -S03H, R3 betecknar -SO3H eller -CO-CH3, och m, n, p är heltal, som kan variera inom ett brett område och som definierar en molekylvikt på 10000-30000 dalton för polysackaridkedjorna.

Dessa egenskaper, och särskilt molekylförhållandena för de kom- ponenter, som erhållits efter hydrolys, tyder på att FAPA kan de- finieras kemiskt såsom ett molekylkomplex bestående av hexosamin- glykanmonsulfater Jkoñdroitinsulfater B och C och heparitinsulfa- ter från artärväggen). ,p°,.f 7 , Sättet att framställa FAPA enligt nppfinningen utmärkes huvud- sakligen av följande steg: I ' 3 ':__ _ l) man avlägsnar och maler omedelbart aorta från unga däggdjur, som just har slaktats, 2) man homogeniserar och suspenderar sagda vävnad i vatten eller lämpliga saltlösningar d 3) man låter proteolytíska enzymer, såsom trypsin, kymotrypsin, pankreatin, papain, ficin eller bromelin angripa vid_deras respektive optimala pH-värden, temperaturer och tidsperioder, 4) man separerar den digererade vätskan genom filtrering och upp- I samlar denf s 7801631-8 5) man utfäller FAPA från den digererade vätskan med lämpliga lös- ningsmedel, som är blandbara med vatten och/eller genom att man bildar olösliga salter med den alifatiska ammoniumjonen, 6) man renar substansen genom att man överför den till ett salt med baser av alkalimetaller eller alkaliska jordartsmetaller, avfärgar substansen med permanganat, behandlar den med alkali vid 70°C för eliminering av terminala delar av kvarvarande peptidkedjor, man avseparerar den önskade saltformen med lös- ningsmedel (natrium-, kalium-, kalciumsalter etc), man filtre- rar, steriliserar och lyofiliserar.

Vad beträffar de farmakologiska egenskaperna har FAPA under- sökts i jämförelse med vissa antiarteriosklerotiska beredningar av tidigare nämnd typ; särskilt har denna substans undersökts i jäm- förelse med heparin, det klarnande läkemedlet för antonomasi, och med hela aortaextrakt.

Följande grundläggande egenskaper bestämdes vid experiment in vivo. l. Verkan på experimentell arterioskleros Detta studium genomfördes på kaniner, som uppdelats i grupper om fem djur, för behandling och matning med heterogen diet, som var rik på kolesterol. _ Djurens blod testades för bestämning av förestrade fettsyror (EFA), total kolesterol, betalipoproteiner och koaguleringstid.

Kolesterolinnehållet i aortavävnaden bestämdes tillsammans med ateromsymptom. Tabell l ger en sammanfattning av de resultat, som erhölls med FAPA, heparin och extrakt av hel aorta efter 40 da- gars behandling. , .......-._........_.-.._._-._...______- _" ......, ,..._.___._.____.___f-.-___.__ 7801631-8 umcficmx mamfiuoc mos cmumfioxmumm flmë mxfla #>flumEHNoHmmm umåoxonæw m:nmHHouucox H cwumäoxmnnw >m wow Hmmmmzø mcwmëo zoo fimucm nmuumuuwn wm> Eouwum >m umäcxwnæw uømxnmä il +H ++N +w Il H+ HO.O H O.H H_O H OO.O H H Om H H Om H H HHN OH\Oa OH HHHOH ._ O . ams >m uxmnuxm ++++ ~.O H OOH H.O H m>_O H H OO OH H OHH OH H OHH mH\Os H HHHOH . Hwß >H HHHHHHH + m0.0 H w.H w.O H m.~ N H Om mH H OO O H OHH mx\ma OH :HHwmwm + mO.O H N .H_O H O.H H H Om OH H OO HH H HOH mH\me H OHHHOHH + OO.O H >.H HO.O H O.O HH H Om HH H OH O H NOH mH\Oe OH wmæm ++ OO.O H OO.H HOOO H HO_O m_~ H OH HH H OO H H OOH @H\Oe H Hmmm ++++ ~H_O H mO.~ OO_O H O>.O H H OO OH H OHN OH H OOH HHQHHOOH mdmumQ9m_HHo# AQHE Eßumm Eflnwm Ednmm OOH\ma HoH >H moHO OHH He OH\Os Ha OOH\ma Ha OOH\wa Eoumum smummfloxmunom |mmcHumHflmm0x umcflwuoumomHH|m H0HmummHoM mmm H flflmmflü 1 7801631-8 2. Biologisk aktivitet De aspekter på biologisk aktivitet, som bestämdes, var den anti- koagulerande aktiviteten (i överensstämmelse med USP) och den klar- nande aktiviteten på råttor (Motron Grosman-metoden J. Lab. och Clin. Med.,mars,l954 sid 445). Vad beträffar denna senare bestäm- ning gjordes modifikationer i föreliggande fall för att det skulle bli möjligt att uttrycka effekten i internationella lipasemen- heter (ULI) i överensstämmelse med UIB-definitionen (International Biochemical Union), där en internationell enhet (ULI) är lika med den aktivitet, som överför substratet med en hastighet av en mikr0- mol per minut. _ Resultaten av FAPA¿sbiologiska aktivitet visas i tabell 2 i jämförelse med heparin och aortaextrakt.

TABELL 2 Heparin Aortaextrakt FAPA Antikoagulerande aktivi- tet (USP/mg) 135-148 omkring 0,5 5-15 Klarnande aktivitet (ULI/l plasma) vid en dos på 0,5 mg/kg 480il00 l5+7 270280 3. Produkttolerans A) -Toxicitet: FAPA visade sig tolereras bra av råttor, kaniner och marsvin, som behandlats antingen genom parenteral admi- nistrering eller oral administrering med doser (per diem) på 200 mg/kg. b)- Immunologiska test: På marsvin, som behandlats med FAPA gav immunologiska test med avseende på antikropps- och anafylax- bildning ej något antikropps- eller anafylaktogent respons. c)- Vasokinetiska undersökningar: ingen effekt vare sig av hista- min- eller adrenalintyp, noterades ens med doser på 50 mg/kg.

Alla de nämnda testerna visar att FAPA kan väljas såsom läke- medel för antiarteriosklerotiskt bruk eftersom dess verkan är av samma storleksordning som heparinetsnen utan att man får de blödningsrisker, som är typiska för den senare substansen. Vidare är FAPAS biologiska aktivitet ungefär 10 ggr högre än den biolo- giska aktiviteten hos extrakt av hel aorta men FAPA saknar de I immunoreaktiva biverkningarna och är sålunda avsevärt fördelak- tigare om man ser till posologi och sensitivitetsrisk under te- 7801631-s 0 is rapi. Några praktiska exempel på framställningen av det nya arte- riella polysackaridkomplexet enligt uppfinningen ges i det följan- de i syfte att göra det möjligt att reproducera förfarandet men utan att begränsa det.

EXEMPEL I 50 kg kalvaorta maldes fint och homogeniserades i 66 liter vat- ten. Efter långsam uppvärmning av massan till 50°C tillsattes 0,6 kg papain, som tidigare suspenderats i 9 liter vatten inne- hållande l0 g natriummetabisulfit.

Hela massan uppvärmdes till 65°C och hölls under dessa beting- elser i tre timmar, varvid man såg till att pH ej sjönk under 6 genom lämplig tillsats av alkali. Efter denna tidsperiod uppvärmdes mas- san till 9s°c i ls min. p Då blandningen stått i 30 min filtrerades den genom tyg med en förbeläggning av filterjord. 0,6 kg cetyltrimetylammOniumklOrid, löst i 35 liter vatten till- sattes till filtratet. I Då blandningen stått över natten avsögs den överliggande vätskan.

Fällningen uppsamlades genom filtrering och löstes i 25 liter vat- ten innehållande 3 kg natriumklorid genom uppvärmning till 70°C.

Denna lösning klarnades genom filtrering. Filtratet behandlades med en lika stor volym aceton. Fällningen, nämligen det råa nat- riumsaltet av FAPA, tvättades flera gånger med 70% aceton och tor- kades sedan. 85 g av det råa natriumsaltet av FAPA erhölls på detta sätt.

Denna fällning tvättades i 1500 ml vatten, dess pH inställdes sedan på 8 och den behandlades sedan med 1,5 g kaliumpermanganat och uppvärmdes så småningom till 90°C. Blandningen filtrerades för att eliminera bildad fällning; Filtratets pH inställdes på ll med natriufnhyarat och hölls vid 7o°c i Ilqigtlm. j Efter denna tidsperiod kyldes vätskan, dess pH¿inställdes på 7 med saltsyra och blandningen filtrerades genom en 0,8 mikron »yl_ membran. Den erhållna vätskan behandlades med 2 volymer etylalko- hol. Då blandningen stått i 2 tim uppsamlades bildad fällning ge- nom filtrering och man tvättade med 500 ml 75% alkohol.

Fällningen löstes i 800 ml vatten och koncentrerades tills kvarvarande alkohol eliminerats.

Koncentratet filtrerades genom ett 0,2 mikron mcmbran och det klara filtratet lyofiliserades.

På detta sätt erhölls 42 g av FAPAs natrimsalt med följande egenskaper: 9 7801631-s uronsyra 35% hexosamin _ 3Û,5% - SO3Na l8,l% - nukleosider 5,2% oorganiska salter 8% (huvudsakligen klorider) klarnande aktivitet 210 i 20 ULI/l antikoagulerande aktivitet 6 UI/mg EXEMPEL 2 50 kg svinaorta behandlades såsom i exempel l. 36 g av natrium- - saltet av FAPA erhölls med kemisk-fysikaliska egenskaper, som var analoga med de enligt föregående exempel och en klarnande aktivi- tet på l80 i 130 ULI/l.

EXEMPEL 3 t 50 kg kalvaorta löstes med ficin istället för papain och förfa- randet fullföljdes sedan såsom i exempel l. Utbytet uppgick till 35 g natriumsalt av FAPA med kemisk-fysikaliska egenskaper analo- ga med de i exempel 1 och en klarnande aktivitet på 280 É 40 ULI/1.

EXEMPEL 4 50 kg kalvaorta homogeniserades i 150 liter vatten och löstes med 2 kg pankreatin vid pH 8 och 40°C i 24 tim i närvaro av toluen såsom bakteriostatikum.

Efter filtrering behandlades den klara vätskan med 3 volymer aceton. Den erhållna fällningen hydrolyserades med alkali vid pH ll och 70°C i 15 tim. Efter filtrering behandlades vätskan med 400 g cetylpyridinklorid för bildning av motsvarande olösliga kvartenära ammoniumsalt av FAPA. Fällningen löstes sedan i 1500 ml vatten innehållande 90 g kalciumklorid. Efter filtrering behand- lades vätskan vid pH 8 med l g kaliumpermanganat, värmdes till 90°C och filtrerades. Filtratet dialyserades i l5 tim mot en vat- tenström för eliminerande av överskott av salter och filtrerades sedan genom en 0,45 mikron membran och lyofiliserades. På detta sätt erhölls 35,5 g kalciumsalt av FAPA med kemisk-fysikaliska egenskaper analoga med de i exempel l och en klarningsaktivitet på 315 i 30 ULI/i.

Claims (1)

1. r 7 8 Û 1 6 31 - 8 lo " PATENTKRAV Sätt att framställa ett arteriellt polysackaridkomplex (FAPA) av anjonisk karaktär bestående av hexosaminglykanmonosulfater från aorta av unga däggdjur, k ä n n e t e c k n a t därav, att l) aorta på unga däggdjur avlägsnas och males omedelbart efter slakt, 2) den malda aortan homogeniseras och suspenderas i vatten eller en saltlösning, 3) suspensionen utsättes för angrepp av proteolytiska enzymer, såsom trypsin, kymotrypsin, pankreatin, papain, ficin eller bromelin under respektive optimala pH-, temperatur- och tids- betingelser, ' 4) den digererade suspensionen filtreras och filtratet uppsamlas, 5) FAPA utfälles ur filtratet med hjälp av lösningsmedel, som är blandbara med vatten, och/eller genom bildning av olösliga, kvaternära ammoniumsalter, och _ 6) FAPA löses i vatten, och ett alkalimetallsalt eller ett alka- liskt jordartsmetallsalt därav bildas, vilket salt separeras från den vattenhaltiga lösningen i ren form på konventionellt sätt.