DE2835096C2

DE2835096C2 -

Info

Publication number: DE2835096C2
Application number: DE2835096A
Authority: DE
Inventors: Fernando Lesmo Mailand/Milano It Fussi; Gianfranco Mailand/Milano It Fedeli
Original assignee: Hepar Chimie Sa Freiburg/fribourg Ch
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1977-08-10
Filing date: 1978-08-10
Publication date: 1987-12-03
Also published as: IT7826282A0; DE2835096A1; JPS5432609A; CH639670A5; US4230699A; US4264733A; GB2007693B; IT1158896B; JPS6341921B2; GB2007693A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Heteropolysaccharid Hexuronylhexosaminoglycansulfat, das durch Extraktion von tierischen Organen gewonnen wird, und antikoagulierende, antithrombotische und klärende Aktivitäten zeigt. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung dieses Heteropolysaccharids sowie ein dieses enthaltendes Arzneimittel.

Thrombose verursacht häufig dauernde Invalidität und ist einer der häufigsten Faktoren für den Tod bei kardiovaskulären Erkrankungen.

Der allgemeine Begriff Thrombose umfaßt Zustände von Hyperkoagulierbarkeit, deren Ursache zurückgeführt werden kann auf:

- "Risikofaktoren", welche zu einem "thrombogenen Zustand" führen, wie z. B. Rauchen, Streß, Anwendung von Kontrazeptiva des Gestagen-Typs über eine längere Zeit usw.
- Erbfaktoren, wie z. B. Fehlen oder Mangel an Inhibitoren (speziell von Antithrombin III).
- Ätiologische Faktoren mit verschiedenen und manchmal nicht völlig geklärten Ursachen, wie z. B. Veränderungen der Aggregation der Blutplättchen.
- Faktoren im Zusammenhang mit einer zeitweiligen Verlangsamung der Blutzirkulation, wie sie z. B. nach chirurgischen Eingriffen unter Narkose auftreten.

Die pathologischen Folgen eines "thrombogenen Zustands", wie er durch einen oder mehrere der oben erwähnten Faktoren bestimmt wird, können die folgenden sein:

- pulmonale, cerebrale, koronare Thromboembolie und Infarktbildung.
- Thrombophlebitis, variköse Syndrome
- intravaskulär disseminierte Koagulation.

Gegenüber solch wichtigen Erscheinungsformen kann heute auf zwei Strategien zurückgegriffen werden:

1. Verwendung thrombolytischer Mittel
2. Prävention thrombogener Zustände und ihrer Folgen.

Wegen der Schwere und der hohen Geschwindigkeit des möglichen Verlaufs der Thrombose ist es einleuchtend, daß die zweite Strategie bei weitem die bessere wäre.

Um im Sinne einer Prävention das Thromboseproblem anzupacken, gibt es zur Zeit zwei Typen von Medikamenten: die oralen Antikoagulantien (Cumarin und dessen Derivate) und Heparin. Die oralen Antikoagulantien wirken über die Leber, indem sie zwei Faktoren der Koagulation blockieren: Proconvertin und Prothrombin. Diese Antikoagulantien sind jedoch für eine längere Therapie ungeeignet und zeigen darüber hinaus eine ungenügende antithrombotische Aktivität, da ihre Wirkung keine anderen Faktoren der Hämkoagulation betrifft, die besonders bei der Genese der Thrombose eine Rolle spielen, insbesondere die XA- und die Blutplättchen-Faktoren.

Unter diesem Gesichtspunkt erscheint Heparin vorteilhafter, da es zusätzlich zu seiner Wirkung auf den sogenannten PF4-Blutplättchen-Faktor auf verschiedene Plasma-Faktoren der Hämkoagulation wirkt, insbesondere auf Thrombin, den XA-Faktor, und auch auf die Faktoren XII, XI und IX. Alle diese Wirkungen können auf die spezifische Fähigkeit des Heparins zurückgeführt werden, den Inhibitor und die oben genannten Koagulierungsfaktoren zu aktivieren. Dieser Inhibitor, der im Plasma vorhanden ist, wird Antithrombin III genannt und benötigt die Anwesenheit von Heparin als Cofaktor zur Entfaltung seiner Aktivität.

Unglücklicherweise ist die Heparin-Therapie aus zwei Gründen nicht empfehlenswert; erstens ist es nur parenteral wirksam, und seine Wirkung hält nicht länger als 8 bis 12 Stunden an, wodurch eine längere Prophylaxe, die täglich zwei Injektionen Heparin erfordern würde, nur schwierig zu erzielen ist. Zweitens hat Heparin nicht nur eine antithrombotische Wirkung, sondern bewirkt auch totale Antikoagulation. Obwohl diese zweite Wirkung manchmal vorteilhaft ist, kann in manchen Fällen, wenn die Therapie für den betreffenden Patienten nicht geeignet ist, bei allen unbestreitbaren Vorteilen der Prophylaxe einer Thrombose das Risiko einer Blutung ein ernstes Problem sein.

Es ist gefunden worden, daß das Heteropolysaccharid Hexuronylhexosaminoglycansulfat, wie es durch Extraktion tierischer Organe erhalten wird, nicht nur antikoagulierende, antithrombotische und klärende Wirkung hat, sondern auch oral und parenteral verabreicht werden kann; es kann über den Darm oder durch äußerliche Anwendung resorbiert werden und zeigt ein Verhältnis von antithrombotischer zu antikoagulierender Aktivität, die gegenüber Heparin Vorzüge aufweist.

Das erfindungsgemäße Produkt wird durch folgende Daten charakterisiert:

Hexosamin nach Hydrolyse (Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd): 29 ± 3 Gew.-%.
Uronsäuren nach Hydrolyse: 27 ± 3 Gew.-%.
Organisches SO₄^-- nach Hydrolyse (Titration mit Naphtharson): 27 ± 4 Gew.-%.
Acetylgruppen nach Hydrolyse: 7 ± 1 Gew.-%.
Natrium nach Hydrolyse (Atomabsorption): 10 ± 2 Gew.-%.
Molverhältnis Uronsäuren : Hexosamin : Sulfat : Acetyl : Natrium etwa 1 : 1,2 : 2 : 1,2 : 3.
Molekulargewichtsbereich (Gelchromatographie): 8000-16 000.
Spezifische Drehung [α] = -15° bis -30° (in Wasser)
Elektrophorese auf Celluloseacetat (Puffer: Pyridin, Essigsäure, Wasser im Verhältnis 1 : 10 : 229, pH = 4,5 und Entwicklung mit Toluidinblau): Eine Hauptbande mit einer elektrophoretischen Beweglichkeit U = 1,90-1,95 × 10^-4 cm² V^-1 s^-1
IR-Spektrum: charakteristische Banden bei 1740, 1647, 1555, 1375, 1235 und 1050 cm^-1
Löslichkeit: löslich in Wasser, verdünnten Mineralsäuren und verdünnten Alkalien, aber unlöslich in Ethanol,

und ist erhältlich nach dem weiter unten beschriebenen Verfahren.

Zur Identifizierung ist weiter der folgende Test nützlich: 1 ml einer 2%igen wäßrigen Lösung des erfindungsgemäßen Produkts wird mit 3 ml einer 2%igen wäßrigen Lösung von Cetylpyridiniumchlorid, erwärmt auf 40°C, versetzt. Es bildet sich ein voluminöser weißer Niederschlag. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in 3 ml einer 0,7 molaren KCL-Lösung suspendiert. Man beobachtet eine vollständige Auflösung des Niederschlags.

Das Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Polysaccharids ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) tierisches Lungen- oder Duodenumgewebe, das gemahlen und in Wasser suspendiert worden ist, mit einem proteolytischen Enzym hydrolysiert,
b) das filtrierte klare Hydrolysat mit Aceton, Dioxan, Methanol oder Ethanol versetzt,
c) den dabei gebildeten Niederschlag in einer Lösung eines Alkali-, Erdalkali (z. B. Natrium, Calcium)- oder Ammoniumsalzes einer starken Mineralsäure, wobei diese Salzlösung eine Ionenkonzentration entsprechend einer 0,8 molaren NaCl-Lösung hat, löst,
d) zu dieser Lösung bei einer Temperatur von nicht höher als 80°C Cetylpyridiniumchlorid oder -bromid oder Cetyltrimethylammoniumchlorid oder -bromid im Überschuß, wenigstens jedoch in einer Menge von 0,5 g je kg des Organs, von dem man ausgeht, zugibt, wobei ein Komplex gebildet wird, der in Lösung bleibt, den gleichzeitig gebildeten Niederschlag abtrennt,
e) die so erhaltene Lösung des Komplexes mit Wasser bis zu einer Ionenkonzentration nicht höher als die einer 0,4 molaren NaCl-Lösung verdünnt,
f) den gefällten Komplex abtrennt und in einer Salzlösung mit den gleichen Merkmalen wie in Stufe c) löst und
g) das gewünschte Produkt mit Aceton ausfällt und trocknet.

Bei spezieller Betrachtung der einzelnen Schritte des oben beschriebenen Verfahrens sollen die folgenden Besonderheiten herausgestellt werden. Das tierische Organ, das hydrolysiert wird, ist vorzugsweise frisch oder tiefgefroren. Das proteolytische Enzym wird vorzugsweise aus der Gruppe der pflanzlichen (Papain, Feigenprotease, Bromelin) oder der Bakterienendopeptidasen ausgewählt, wobei die Bedingungen, unter denen die Hydrolyse durchgeführt wird, vom Typ des Enzyms abhängen. Es wird besonders bevorzugt, die Hydrolyse in einem Zeitraum von nicht weniger als 3 Stunden unter mildem Erhitzen durchzuführen, bis der Wert des a-Aminostickstoffs (bestimmt nach Soerensen) sich nicht mehr ändert.

Zur Fällung aus der klaren Flüssigkeit nach der Hydrolyse wird als Lösungsmittel Aceton, Dioxan, Methanol oder Ethanol ausgesucht.

Zur Fällung des Endprodukts (Schritt g) wird Aceton verwendet, und der Niederschlag wird im Vakuum getrocknet oder lyophilisiert.

Die folgenden beiden Beispiele sollen den erfindungsgemäßen Extraktionsprozeß erläutern.

Beispiel 1

100 kg Schweineduodenum werden gemahlen und in 50 l Wasser suspendiert. Nach Erwärmen auf 40°C werden 200 g Papain, in 25 l Wasser suspendiert, zugegeben. Nach Erwärmen der gesamten Mischung auf 60°C wird die Auflösung drei Stunden fortgeführt.

Gegen Ende wird die Mischung 15 Min auf 90°C erhitzt. Die gesamte Menge wird mit 4 kg Filterhilfe in einer Filterpresse filtriert.

Das klare Filtrat wird auf 50 l konzentriert, dann 150 l Ethanol zugegeben und über Nacht stehen gelassen.

Nach Entfernen der überstehenden wäßrig alkoholischen Phase wird das Präzipitat sorgfältig getrocknet und in 25 l Wasser, das 1200 g NaCl enthält, suspendiert und dann filtriert. In das Filtrat werden unter Rühren 25 l einer 0,8 molaren Lösung von NaCl mit 50 g Cetyltrimethylammoniumchlorid zugegeben. Die Mischung wird auf 40°C erwärmt. Die Mischung wird mit 2 kg Filterhilfe über eine Filterpresse filtriert. Das klare Filtrat wird mit 2 kg Filterhilfe versetzt und unter Rühren mit 50 l Wasser verdünnt. Nach Erwärmen auf 40°C wird das Produkt durch Vakuumfiltration gesammelt.

Der Filterkuchen wird in 10 l einer 0,8 molaren NaCl-Lösung suspendiert und auf 40°C erwärmt. Nach Filtration wird der klaren Flüssigkeit unter Rühren das 1,5fache Volumen Aceton zugefügt. Die Mischung wird über Nacht stehengelassen. Die flüssige obere Wasser/Acetonphase wird entfernt, und das Präzipitat wird mit 2 × 5 l 70%igem Aceton gewaschen und dann mit wasserfreiem Aceton entwässert. Dann wird pulverisiert und vakuumgetrocknet.

Ausbeute: 8 g elfenbeinweißes, leicht hygroskopisches Pulver mit folgenden Eigenschaften:

Löslichkeit in Wasser:vollständig [α] :-18° Huronsäuren:28% Hexosamine:30% Organisches SO₄^--:26,5% Antikoagulierende Aktivität:25 U/mg (USP). Verhältnis der antithrombotischen zur
antikoagulierender Aktivität (Yin's Test/KCCT-Test) = 2.
Klärende Aktivität:125 ILU/mg (International Lipasemic Unit).

Was die klärende Aktivität betrifft, so ist sie verwandt mit der Lipase-Aktivität, nämlich dem Minimumwert der International Lipasemic Units (ILU), die in 1 Liter Plasma gefunden werden, wenn die zu prüfende Substanz Ratten in einer Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht intravenös verabreicht wird. Andererseits ist die Lipase-Aktivität in International Lipasemic Units ausgedrückt die Aktivität, die 1 Mikromol Oleinsäure pro Minute hydrolysiert.

Beispiel 2

50 kg Rinderlunge werden gemahlen und in 75 l Wasser suspendiert. Nach Erwärmen auf 40°C werden 200 g Papain in 25 l Wasser suspendiert zugegeben, und die Mischung 3 Stunden auf 65°C erhitzt. Danach wird die Mischung 30 min auf 90°C erhitzt.

Die Flüssigkeit wird filtriert und das Filtrat auf 50 l konzentriert und nochmals gefiltert. Zum Filtrat werden 100 l Aceton zugegeben und über Nacht stehen gelassen. Nach Entfernen der überstehenden flüssigen Phase wird das Präzipitat mit 50 l einer 0,8 molaren NaCl-Lösung, die 50 g Cetylpyridiniumchlorid enthält, aufgenommen. Die Mischung wird dann auf 40°C erwärmt und dann mit 2 kg Standard Supercel® (Filterhilfe) filtriert.

Das Filtrat wird mit 50 l Wasser, das 500 g Standard Supercel® suspendiert enthält, verdünnt. Der Niederschlag wird auf einem Filter gesammelt, in 10 l einer 0,8 molaren NaCl-Lösung suspendiert und filtriert. Das klare Filtrat wird durch Rühren mit 2 l Chloroform gewaschen. Nach Abtrennen der Chloroform- Phase wird die wäßrige Phase wieder filtriert und mit dem 1,5fachen Volumen Ethanol gefällt. Das Präzipitat wird gewaschen und mit Alkohol entwässert und dann in 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Membran filtriert und lyophilisiert.

Ausbeute: 6,9 g eines elfenbeinweißen Pulvers mit folgenden Eigenschaften:

Löslichkeit in Wasser:vollständig Drehwert:[α] = -24° Uronsäuren:31,2% Hexosamin:33,1% Organisches SO₄^--:22,8% Gerinnungshemmende Aktivität:28 U/mg (USP) Klärende Aktivität:115 ILU/mg Antithrombotische zu gerinnungshemmender Aktivität:2

Das erfindungsgemäße Heteropolysaccharid, wie es im oben beschriebenen Prozeß erhalten wird, wurde geprüft, um die pharmakologischen Eigenschaften und Aktivitäten festzustellen.

Akute Toxizität

Bei Meerschweinchen, Ratten, Mäusen und Kaninchen wurden keine toxischen Symptome bis zu einer Dosis von 400 mg/kg festgestellt.

LD₅₀
i. p. (Maus)1615 mg/kg oral (Maus)6000 mg/kg i. v. (Maus)1000 mg/kg LD₅₀
i. p. (Ratte)1463 mg/kg oral (Ratte)6000 mg/kg i. v. (Ratte) 150 mg/kg

Klärende Aktivität

1) Ediol Test: 100-50 ILU/mg
2) Triton Test: Serumlipide sind durch verabreichtes HP-80 bei Triton-behandelten Ratten signifikant reduziert.
3) Atherogenic diet test: Wenn HP-80 in einer Dosis von 1% zu einer halbgereinigten Nahrung ergänzt mit Cholesterol und Cholsäure gegeben wird, ist die Substanz in der Lage, die Serumlipide bei Kaninchen zu senken.

In vitro - gerinnungshemmende und antithrombotische Aktivitäten

Gerinnungshemmende Aktivität (USP):25-40 U/mg Kaolin-Cephalin-Gerinnungszeit (KCCT):14-22 U/mg Yin's Test/KCCT:1,8-2,5 (Heparin = 1)

Antithrombotische Aktivität

Ein statistisch signifikanter Effekt auf die Bewegung des Thrombus wird erreicht, bestimmt im Rattenplasma durch die Chandler-Schleife. Angesichts der oben aufgeführten Aktivitäten wird ein therapeutischer Nutzen erwartet bei oraler und parenteraler Anwendung mit täglichen Dosen von 100 bis 200 mg in folgenden Fällen:

Prävention postoperativer Thromboembolien
Prävention thrombotischer Erscheinungen infolge eines thrombogenen Status, wie z. B. bei fertilen Frauen die einer längeren Behandlung mit oralen Kontrazeptiva ausgesetzt sind.
Prävention der Thrombose tief liegender Venen.
Prävention von Zuständen von Hyperkoagulierbarkeit.
Korrektur der hyperdislipidemischen Zustände (Hyperdislipoproteinämie).
Perkutan sind die folgenden therapeutischen Anwendungen indiziert:
Thrombophlebitis, Phlebitis, Kontusionen, Hämatome.

Claims

1. Hexuronylhexosaminoglycansulfat, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften: Hexosamine nach Hydrolyse:29 ± 3 Gew.-% Uronsäuren nach Hydrolyse:27 ± 3 Gew.-% Organisches SO₄^-- nach Hydrolyse:27 ± 4 Gew.-% Acetylgruppen nach Hydrolyse: 7 ± 1 Gew.-% Natrium nach Hydrolyse:10 ± 2 Gew.-%Molverhältnis Uronsäure : Hexosamin : Sulfat : Acetyl : Natrium etwa 1 : 1,2 : 2 : 1,2 : 3Molekulargewicht (Gelchromatographie):8000-16 000Spezifisches Drehvermögen[α] = -30° bis -15° (in Wasser)Elektrophorese auf Celluloseacetat (Puffer : Pyridin, Essigsäure, Wasser im Verhältnis 1 : 10 : 229, pH 4,5 und Entwicklung mit Toluidinblau): eine Hauptbande mit elektrophoretischer Beweglichkeit U = 1,9-1,95 × 10^-4 cm² V^-1 s^-1
IR-Spektrum: charakteristische Banden bei 1740, 1647, 1555, 1375, 1235 und 1050 cm^-1
Löslichkeit: löslich in Wasser, verdünnten Mineralsäuren und verdünnten Alkalien, aber unlöslich in Ethanol,
erhältlich nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 bis 4.

2. Verfahren zur Gewinnung des Polysaccharids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) tierisches Lungen- oder Duodenumgewebe, das gemahlen und in Wasser suspendiert worden ist, mit einem proteolytischen Enzym hydrolysiert,
b) das filtrierte, klare Hydrolysat mit Aceton, Dioxan, Methanol oder Ethanol versetzt,
c) den dabei gebildeten Niederschlag in einer Lösung eines Alkali-, Erdalkali- oder Ammoniumsalzes einer starken Mineralsäure, wobei diese Salzlösung eine Ionenstärke entsprechend einer 0,8 molaren NaCl-Lösung hat, löst,
d) zu dieser Lösung bei einer Temperatur nicht höher als 80°C Cetylpyridiniumchlorid oder -bromid oder Cetyltrimethylammoniumchlorid oder -bromid im Überschuß, wenigstens jedoch in einer Menge von 0,5 g je kg des Organs, von dem man ausgeht, zugibt, wobei ein Komplex gebildet wird, der in Lösung bleibt, den gleichzeitig gebildeten Niederschlag abtrennt,
e) die so erhaltene Lösung des Komplexes mit Wasser bis zu einer Ionenstärke nicht höher als der einer 0,4 molaren NaCl-Lösung verdünnt,
f) den gefällten Komplex abtrennt und in einer Salzlösung mit den gleichen Merkmalen wie in Stufe c) löst und schließlich
g) das gewünschte Produkt mit Aceton ausfällt und trocknet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als proteolytisches Enzym Papain, Bromelin, Feigenprotease, Alkalase oder Neutrase einsetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Hydrolyse unter mildem Erhitzen wenigstens 3 Stunden durchführt, bis sich der Wert des α-Aminostickstoffs (nach Soerensen) nicht mehr ändert.

5. Arzneimittel, insbesondere geeignet zur Verhütung von thrombotischen Zuständen, enthaltend als aktiven Bestandteil das Polysaccharid nach Anspruch 1.