DE1129148B

DE1129148B - Verfahren zur Herstellung von Heparin-Derivaten zytostatisch wirkender Stoffe

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Publication number: DE1129148B
Application number: DEE21799A
Authority: DE
Inventors: Dr Med Gyoergy Csaba; Dipl-Ing Dr Jenoe Koeroesi
Original assignee: Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar
Current assignee: Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar
Priority date: 1960-10-19
Filing date: 1961-10-12
Publication date: 1962-05-10

Description

Verfahren zur Herstellung von Heparin-Derivaten zytostatisch wirkender Stoffe Es ist bekannt, daß die in neuerer Zeit zur Behandlung von malignen Tumoren vielfach angewendeten sogenannten zytostatischen Stoffe den allgemeinen Nachteil einer unspezifischen Wirkung zeigen; diese Stoffe beeinflussen nicht nur die Lebensfunktionen der Tumorzellen, sondern üben ihre Wirkung auch gegenüber den übrigen Zellen des behandelten Organismus aus. Diese Mittel sind deshalb in sehr hohem Grade toxisch, wodurch ihre therapeutische Anwendung außerordentlich erschwert wird.
Es ist ferner bekannt, daß bei Tumorerkrankungen die Menge des im Organismus anwesenden Heparins erheblich abnimmt, und gleichzeitig vermehren sich in der Umgebung der Tumoren und anderer wuchernder Gewebe erheblich die heparinhaltigen sogenannten Ehrlichschen Mastzellen; deshalb benötigen die Tumors zellen zu ihrer Vermehrung auch Heparin.
Es wurde nun gefunden, daß die mit Heparin gebildeten Verbindungen der zytostatisch wirkenden basischen Stoffe sowie der auf das Enzymystem der Zellen wirkenden, enzymhemmenden oder beide Wirkung zugleich zeigenden basischen Stoffe eine spezifische tumorhemmende Wirkung haben. Diese Eigenschaft der genannten neuen Heparinverbindungen kann dadurch erklärt werden, daß diese Stoffe biologisch einen heparinoiden Charakter zeigen und infolgedessen sich vorwiegend in den heparin-affinen Zellen des Organismus, also in den Tumorzellen. anhäufen.
So schädigen diese Stoffe spezifisch die Tumorzellen, und zwar in praktisch sehr erheblichem Grad auch bei so niedrigen Konzentrationen, bei welchen sie noch überhaupt keine oder nur kaum merkbare zellenschädigende Wirkung auf die gesunden Gewebe ausüben. Diese Eigenschaft der genannten Heparinverbindungen ist desto überraschender, da die bekannten Bausteine der Heparinsäure, die D-Glukoronsäure und das D-Glukosamin, die Entwicklung der experimentellen Tumoren sogar begünstigen.
In der Literatur wurden schon einige mit organischen Basen gebildete Salze der Heparinsäure beschrieben, welche aber keine zytostatischen oder zur Hemmung der im Stoffwechsel der Tumorzellen eine Rolle spielenden Enzyme fähigen Verbindungen als basische Komponente enthielten. Diese bekannten Heparinsalze haben auch überhaupt keine tumorhemmendenEigenschaften ; sie zeigen höchstens heparin ähnliche, blutgerinnungshemmende Wirkungen. So wurden z. B. eine aus 20 Teilen Heparin und I Teil Histamin hergestellte wäßrige Lösung (R.K.Sanyal und G. B. West, Nature, 178, S. 1293 [1956]) und die mit N,N'-Bis-(oc-methylbenzyl)-äthylendiamin(A. Ca ntone, Minerva Med. I., S. 230 [1953]) und mit Amino- akridinen gebildeten Heparinsalze (K. S. Dodgson, F. A. Rosk und B. Spencer, Biochem. J., 60, S. 346 [1955]) beschrieben, die aber keinerlei tumorhemmende Wirkung zeigen.
Diese neuen, spezifisch tumorhemmenden Heparinverbindungen können aus Heparinsäure (welche nicht unbedingt eine blutgerinnungshemmende Wirkung zeigen muß) und aus therapeutisch verwendbaren basischen zytostatischen Stoffen und/oder aus zur Hemmung der im Stoffwechsel der Tumorzellen eine Rolle spielenden Enzyme geeigneten basischen Stoffen hergestellt werden.
Die saure Komponente der erfindungsgemäßen neuen salzartigen Verbindungen ist also die stark sauer reagierende Heparinsäure; diese Verbindung wird in der Therapie vorwiegend in der Form ihres Natriumsalzes, und zwar zur Regulierung der Blutgerinnungsdauer, ferner bei Bluttransfusionen und zur Behandlung von Trombosen, verwendet. Die verschiedenen natürlichen Heparine bestehen aus Makromolekülgemischen, welche sich voneinander nicht nur in ihren durchschnittlichen Molekulargewichten, sondern auch hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung unterscheiden. Die am meisten vorkommende Art der Heparinsäure kann mit der folgenden, als erwiesen zu betrachtenden Zusammensetzung charakterisiert werden: sie besteht aus äquivalenten Mengen von D-Glukosamin-N-schwefelsäureund D-Glukuronsäure, wobei jede zweite D-Glukuronsäurekomponente an der C2-Hydroxylgruppe und jede D-Glukosaminkomponente an derC4-Hydroxylgruppe ebenfalls mitSchwefelsäure verestert ist und auch an die Stickstoffatome der letzteren je eine - SO3 H-Gruppe gebunden ist.
Theoretisch ist also die Heparinmolekülkette aus solchen sich wiederholenden Tetrasaccharid-Einheiten aufgebaut, die eine D- Glukosamin-N-schwefelsäure-2-schwefelsäure-ester-, eine D-Glukuronsäure-, eine n-Glukosamin- N- schwefelsäure-2- schwefelsäureester-und eine D-Glukuronsäure-4-schwefelsäureester-Eillheit in der angegebenen Reihenfolge enthalten. Das Molekulargewicht dieser im Makromolekiil sich mehrmals wiederholende Tetrasaccharid-Einheiten beträgt 1002,8; sie enthalten je fünf SO3H- und zwei COOH-Gruppen.
Die starke Neigung des Heparins, sich an Proteine zu binden, kann durch seine große Azidität, welche vorwiegend von den SO3H-Gruppen hervorgerufen wird, erklärt werden. Die Wirkung des Heparins auf die Blutgerinnung wird durch sein Molekulargewicht und seinen Schwefelsäuregehalt beeinflußt. Das durchschnittliche Molekulargewicht eines eine gute blutgerinnungshemmende Wirkung zeigenden Heparins ist etwa 20000. In den verschiedenen natürlichen Heparinen kommen aber in dem oben angeführten, vier Ringeinheiten umfassenden Molekülteil nicht immer fünf SO3H-Gruppen vor, sondern die Zahl dieser Gruppen schwankt im allgemeinen zwischen zwei und fünf. Diese natürlichen Heparine sind zwar in alkalischem Medium ziemlich stabil, sie neigen aber in saueren Medien zur hydrolytischen Depolymerisation, wodurch ihre blutgerinnungshemmende Aktivität abnimmt oder völlig verlorengeht. Da aber die Heparin-Affinität der Tumorzellen auch gegenüber solchen therapeutisch sonst minderwertigen bzw. wertlosen Heparinen besteht, können als Ausgangsstoffe des erfindungsgemäßen Verfahrens auch solche verwendet werden. Unter »Heparinsäure« ist also in dieser Beschreibung jede obenerwähnte Art des natürlichen Heparins in Form von freier Säure zu verstehen.
Als basische Komponente können bei der Herstellung der erfindungsgemäßen neuen Verbindungen solche basische Verbindungen von zellenbeschädigender Wirkung verwendet werden, welche als therapeutisch verwendbare Zytostatica oder als zur Hemmung der im Stoffwechsel der Tumoren eine Rolle spielenden Enzyme verwendbare Mittel bekannt sind. Unter den therapeutisch verwendbaren, unmittelbar auf die Zellenteilung wirkenden Stoffen sind am meisten die N-Loste, N-Halbloste und die Äthylenimin-Derivate als Ausgangsstoffe des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet; als Beispiele solcher Verbindungen können das 1 ,6-Bis-(ß-chloräthylenamino) 1 ,6-desoxy--mannit und das 2-[Bis-(p-chloräthyl)-aminomethyl]-benzimidazol erwähnt werden.
Die zur Hemmung der im Stoffwechsel der Tumorzellen eine Rolle spielenden Enzyme verwendbaren basischen Stoffe gehören zu verschiedenen Klassen der organischen Verbindungen. Diese Verbindungen zeigen in freier Form oder in Fonn von Salzen in den praktisch verwendbaren Konzentrationen überhaupt keine tumorhemmende Wirkung, nur ihre Heparinsäuresalze zeigen eine tumorhemmende Aktivität; dieser Umstand ist ein klarer Beweis des spezifischen Charakters der erfindungsgemäßen neuen Verbindungen.
Unter diesen enzymhemmenden Verbindungen zeigen die Sulfonamide, z. B. das p-Aminobenzolsulfonamid, das p-Aminobenzolsulfaguanidin oder das 2 - (4- Aminobenzolsulfamido) - 4 - methylthiazol, eine hemmende Wirkung gegenüber der Glukose-6-phosphat-dehydrogenase, Milchsäure-dehydrogenase, Glukose-dheydrogenase, Zytochrom-reductase, Brenztraubensäure-carboxylase, Zytochromoxydase, Succino-dehydrogenase und ähnlichen Enzymen. Einige Alkaloide, wie z. B. das Chinin und die dem Chinin ähnlichen synthetischen Malariamittel, wie z. B. das 3-Chlor - 7 - methoxy - 9 - (.x - methyl-diäthylamino - butylamino) - acridin, das 6-Methoxy-8-(8-diäthylaminoa-methylbutyl)-amino chinolin und das 7- Chlor- (4-diäthylamino-l-methyl-butylamino)-chinolin, zeigen eine hemmende Wirkung gegenüber Zytrochrom-reductase, Phosphoglycerinaldehyd - dehydrogenase, Phosphorylase, Hexochinase, Zytochromoxydase, Brenztraubensäure-dehydrogenase, Phosphoglukomutase oder Milchsäure-dehydrogenase. Verschiedene organische Arsenverbindungen, wie z. B. p-Amino-phenyldichlorarsin und 3-Amino-4-hydroxyphenyl-arsinoxyd, hemmen ebenfalls die Funktion der Redoxenzymsysteme.
Die verschiedenen Chinone zeigen bekannterweise ebenfalls eine enzymhemmende Wirkung, z. B. gegenüber der Brenztraubensäure-dehydrogenase, Succinodehydrogenase, Brenztraubensäure-carboxylase und Katalase. Bei den sogenannten Chinon-stickstofflosten und bei den Chinonäthyleniminderivaten, z. B. 2,5-Bisp - chloräthylamino - benzochinon - (1,4), 2,5 - Bis - dijB-chloräthylamino-benzochinon-(1,4), 2,5-Bis-äthylenimino - benzochinon - (1,4) und 2,5 - Bis - n - propoxy-3,6-bis-äthylenimino-benzochinon-(1,4), kann das gleichzeitige Bestehen beider erwähnter Wirkungen (der zytostatischen und enzymhemmenden) angenommen werden (vgl. S. Petersen, W. Gauß und E.Urbschat, Angew. Chem., 67, S.217 [1955]; W. Gauß und S. Petersen, a. a. 0., 69, 5.252 [1957]).
Als verwandte Verbindung kann auch das 2,5-Bisäthylenimino-hydrochinon, bei welchem ebenfalls eine tumorhemmende Wirkung festgestellt wurde (vgl.
A. Marxer, Experimentia, 11, S. 186 [1955], zu diesem Typ gerechnet werden. Da aus derartigen Verbindungen keine Salze mit Heparin gebildet werden können, wurden ihre basisch substituierten Derivate, wie z. B. 2, 5-Bis-fl-dimethylamino-äthoxy-3 ,6-bis-äthylenimino-benzochinon-(1,4), 2,5-Dichlor-3,6-bis-B-piperidino-äthylamino-benzochinon-(1,4) und 2,5-Din-methylpiperazino-benzochinon-(1,4), zur Salzbildung verwendet.
Bei dem Heparin-natriumsalz sowie bei der freien Heparinsäure kann überhaupt keine wachstumhemmende Aktivität gegen Tumoren in Tierversuchen festgestellt werden; diese Stoffe haben sogar eine gerade gegengesetzte Wirkung, sie beschleunigen das Wachstum der Tumoren und verursachen zugleich eine Abnahme des Körpergewichtes. Das ist ebenfalls ein Beweis dafür, daß es sich im Falle der erfindungsgemäßen Verbindungen um eine neue, ganz spezifische und unerwartete Wirkung handelt.
Die neuen, mit zytostatischen bzw. enzymhemmenden basischen Verbindungen gebildeten Heparinsalze können im Sinne der vorliegenden Erfindung derart hergestellt werden, daß Heparinsäure mit irgendeiner der obenerwähnten zytostatischen oder enzymhemmenden basischen Verbindungen umgesetzt wird. Es ist dabei nicht erforderlich, daß die als Ausgangsstoff verwendete Heparinsäure eine blutgerinnungshemmende Aktivität zeigt. Die beiden Komponenten können in äquivalenten Mengen oder in einem solchen Mengenverhältnis verwendet werden, daß die - Menge der basischen Verbindung geringer als die aus der Zahl der anwesenden -NH-SO3H- und - 0- SO3H-Gruppen berechnete äquivalente Menge ist: in letzterem Falle werden saure Heparinsalze als Produkte gewonnen. Beide Arten der als Produkt erhaltenen Heparinsalze zeigen die erwähnte vorteilhafte tumorhemmende Wirkung.
DieReaktion kann in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel, zweckmäßig in niederen primären Alkoholen oder in einer Mischung dieserLösungsmittel, vorteilhaft in einem Temperaturbereich zwischen -10 und +30°C, vorgenommen werden.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen neuen Heparin-Derivate ist es nicht nötig, daß feste, isolierte Heparinsäure als Ausgangsstoff verwendet wird; die bei der Heparinsäureherstellung als Rohprodukt gewonnene wäßrige ader organische Heparinsäurelösung kann ebenfalls als Ausgangsstoff verwendet werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten neuen Heparinsalze sind im Wasser meistens gut löslich; der pErWert der Lösung hängt von der Zahl der in der Heparinsäure anwesenden SO3H-Gruppen und von der Menge der verwendeten basischen Komponente ab. Zweckmäßigerweise wird das Verhältnis dieser Faktoren derart gewählt, daß der pn-Wert der wäßrigen Lösung des Produktes zwischen 1,5 und 7 beträgt.
Die im Sinne der vorliegenden Erfindung hergestellten neuen Heparin-Derivate zeigen eine zytostatische Aktivität, welche die Wirkung der bisher bekannten zytostatischen Mittel wesentlich übertrifft, da diese neuen Verbindungen auf Grund ihrer spezifischen Wirkungsweise hauptsächlich auf die Tumorgewebe wirken. Das wird auch dadurch bewiesen, daß, während z. B. 8 mg/kg 1,6-Bis-(,B-chloräthylamino)-1,6-desoxy-n-mannit-dihydrochlorid wegen seiner allgemeinen zellenschädigenden Wirkung einen 20- bis 250/0eigen Gewichtsverlust bei den Tieren verursacht, das mit Heparinsäure gebildete Salz derselben Verbindung in derselben Dose überhaupt keinen Gewichtsverlust herbeiführt, andererseits aber bei viel kleineren Dosen, z. B. 2,5 mg/kg, das Hydrochlorid der genannten zytostatischen Verbindung überhaupt keine tumorhemmende Wirkung zeigt, während das mit Heparinsäure gebildete Salz eine sehr merkliche tumorhemmende Wirkung aufweist.
Die praktische Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird näher in den nachfolgenden Beispielen veranschaulicht.
Beispiel 1 4,55 g (0,012 Mol) 1,6-Bis-(ß-chloräthylamino)-1,6-desoxy-D-mannit-dihydrochlorid werden in 20 mm Wasser gelöst und unter Eiskühlung mit einer Lösung von 1,34 g (0,024 Mol) Kaliumhydroxyd in 5 ml Wasser versetzt, dann wird dem Gemisch eine Lösung von 8,75 g Heparinsäure in 20 ml Wasser zugesetzt. Die klare Lösung wird bei einer Temperatur unter 30"C zur sirupartigen Dichte eingedampft und mit 75 mol absolutem Äthanol versetzt. Das sich ausscheidende Heparinsalz wird filtriert, mit 20 ml absolutem Äthanol und dann mit 20 ml wasserfreiem Äther gewaschen.
Es werden 14,10g 1,6-bis-(p-chloräthylamin)-1,6-des- oxy-D-mannit-heparinsaures Salz erhalten (theoretische Ausbeute 14,21 g) in Form eines hellkremfarbigen, amorphen, wasserlöslichen, 12,6 °/o KCl enthaltenden, keinen charakteristischen Schmelzpunkt zeigenden Produktes.
Das als Ausgangsprodukt verwendete 1,6-Bis-(B-chloräthylamino) - l,6-desoxy- D mannit- dihydrochlorid (Degranol, Mannomustin) ist ein bekanntes zytostatisches Mittel, dessen Herstellung in der Mitteilung von L. Vargha usw. (J. Chem. Soc. [1957], S. 805) beschrieben ist.
Die zur obigen Reaktion verwendete Heparinsäure zeigt eine blutgerinnungshemmende Aktivität von 3,3 IE/mg; sie hat keinen charakteristischen Schmelzpunkt, wird über 180°C langsam braun verfärbt und über205°Cverkohlt.Analyse:N = 3,00/o, S = 13,150/o.
Diese Heparinsäure enthält also je Tetrasaccharidgruppe anstatt der maximalen fünf nur im Durchschnitt 3,7 SO3H-Gruppen. Demgemäß ist das Molekulargewicht dieser sich wiederholenden Tetrasaccharidgruppen anstatt 1002,8 nur 898.
Im Endprodukt sind 80°/o der in der Heparinsäure ursprünglich anwesenden SO3H-Gruppen durch die Basizität des Mannomustins gebunden. Die Anwesenheit dieser freien SO3H-Gruppen wird auch durch den pn-Wert der wäßrigen Lösung des Produktes (3 bis 3,5) gezeigt.
Das auf obige Weise hergestellte Mannomustinheparinat hat in Tierversuchen folgende Resultate gezeigt: Crocker-S. 180-Tumor an Mäusen: tägliche Dosen von 25 mg/kg haben bei einer 10tägigen Behandlung das Wachstum der Tumoren um 42°/o retardiert. Bei mit Mannomustin-dihydrochlorid gleich£eitig durchgeführten vergleichenden Versuchen hat die Behandlung mit die gleiche Menge Mannomustin enthaltenden Dosen nur eine 250/0ige Hemmung des Tumorwachstums verursacht.
Solider Ehrlich-Tumor: bei einer 10tägigen Behandlung mit täglichen Dosen von 25 mg/kg hat das Mannomustin-heparinat die Gewichtszunahme der Tumoren um 63,6 0/o retardiert. Die gleichzeitig mit Mannomustin-dihydrochlorid durchgeführten vergleichendenVersuchehaben eine 240/die Beschleunigung ( !) des Tumorwachstums ergeben.
Németh-KellnerschesAscites-Lymphoma: 100mg/kg Mannomustin-heparinat wurden nach 24 Stunden und nach 48 Stunden nach Einimpfen des Tumors verabreicht; nach 6 Tagen war eine 760/0ige Hemmung des Tumorwachstums festzustellen.
Beispiel 2 Es wird in ähnlicher Weise gearbeitet, wie im Beispiel 1 beschrieben, nur wird anstatt von 0,012 Mol Mannomustin die mit den anwesenden SO3H-Gruppen der Heparinsäure äquivalente Menge, also im Falle des im Beispiel 1 verwendeten Heparins 0,016 Mol Mannomustin, mit der Heparinsäure in Reaktion gebracht.
Dadurch wird als Produkt ein KCl-haltiges neutrales Salz erhalten, welches in wäßriger Lösung einen p-Wert von 5,5 bis 6 zeigt. Dieses Produkt gab in Tierversuchen denjenigen der im Beispiel 1 beschriebenen gleichwertige Ergebnisse.
Beispiel 3 0,55g reine Mannomustinbase (Zersetzungspunkt 278"C [Herstellung vgl. Vargha usw., a. a. O.]) werden mit 1,31 g Heparinsäure (Qualität wie im Beispiel 1) in 15 ml Wasser gelöst und die erhaltene klare Lösung unter Ventilation oder Vakuum bei einer Temperatur unter 30 C zur sirupartigen Dichte eingedampft. Durch Zugabe von 20 ml abs. Äthanol wird das schwach saure KCl-freie Mannomustinheparinat gefällt, filtriert und mit 10 ml abs. Äthanol, dann mit 10ml wasserfreiem Äther gewaschen. Es werden 1,81 g KCl-freies Mannomustin-heparinat erhalten, welches bei der Analyse 4,26 0/o Stickstoffgehah zeigt. Dieses Produkt zeigt infolge seiner größeren Reinheit eine entsprechend gesteigerte Wirkung.
Solider Ehrlich-Tumor: bei einer 10tägigen Behandlung mit täglichen Dosen von 140 mg/kg wurde das Wachstum des Tumors um 55°/0 retardiert.
Benevolenskaja-Sarkom: bei einer 21 tägigen Behandlung von mit Benevolenskaja-Sarkom eingeimpften Ratten mit täglichen Dosen von 60mg/kg wurde eine 640/ge Wachstumshemmung des Tumors erreicht.
Yoshida-Sarkom an Ratten: bei 7tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 50 mg/kg wurde eine 99,2°/Oige Hemmung erreicht.
Beispiel 4 Eine im Durchschnitt 3,5 SO3H-Gruppen pro Tetrasaccharid-Einheiten enthaltende Heparinsäure wird in Wasser gelöst und die Lösung mit der berechneten Menge von 2-[Bis-(p-chloräthyl)-aminomethyl]-benzimidazol-Base neutralisiert. Die erhaltene klare Lösung wird unter Ventilation zur sirupartigen Dichte eingeengt, mit .25 ml wasserfreiem Aceton versetzt, das gefällte Salz filtriert, mit wasserfreiem Aceton und wasserfreiem Äther gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene Benzimidazol-N-lost-heparinat zeigt in Tierversuchen eine dem Mannomustin-heparinat ähnliche tumorhemmende Wirkung. Das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors wurde bei IOtägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 100 mg/kg um 42°/o retardiert.
Die als Ausgangsstoff verwendete 2-[Bis-(,-chloräthyl)-aminomethyl]-benzimidazol-Base wird aus dem Dihydrochlorid in üblicher Weise bei einer Temperatur von 0°C hergestellt; die Herstellung des Dihydrochlorids wurde von E. Hirschberg usw., Cancer Research, 17, S. 904, und WS. Bunt und E. J. Nikawitz, J. Org. Chem., 24, S. 712, beschrieben.
Beispiel 5 0,90 g Heparinsäure (je Tetrasaccharid-Einheiten im Durchschnitt 3,5 SO 3H-Gruppen enthaltend, ohne blutgerinnungshemmende Wirkung) und 0,80 g Sulfaguanidin werden in 20 ml Wasser gelöst, die Lösung filtriert und bei Zimmertemperatur im Vakuum zur Trockne verdampft. Das als Rückstand gewonnene Salz wird mit 20 ml wasserfreiem Äthanol auf einen Filter gebracht und mit 20 mol wasserfreiem Äther gewaschen. Es werden 1,62 g Sulfaguanidin-heparinat erhalten; das Produkt zeigt keinen Schmelzpunkt und wird oberhalb von 180"C langsam verkohlt. Die 50/0ige wäßrige Lösung des Produktes zeigt den pH-Wert 2. Analyse: N = 13,3 0/o.
Auf ähnliche Weise können auch die mit Heparinsäure gebildeten Salze von den folgenden Sulfamiden hergestellt werden: p-Aminobenzolsulfamid, 2-(4-Aminobenzolsulfamido)-4-methylthiazol und 2-Sulfanilamido-4, 6-dimethylpyrimidin.
In Tierversuchen haben diese Produkte ebenfalls gute tumorhemmende Wirkung gezeigt. Das p-Aminobenzolsulfamid-heparinat hat bei 1 tägiger Behandlung in täglich 40-mg/kg-Dosen das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors um 24 0/o retardiert. Bei dem 2-(4-Aminobenzolsulfamido)-4-methylthiazol wurde unter ähnlichen Bedingungen 400ige Hemmung gefunden, bei dem Sulfaguanidin-heparinat war die Hemmung 49,801,ig und bei dem 2-Sulfanilamido-4,6-dimethylpyrimidin-heparinat unter den gleichen Bedingungen 250/o.
Beispiel 6 1,31 g Heparinsäure (welche im Durchschnitt 3,7 SO3H-Gruppen pro Tetrasacchard-Einheiten enthält und eine blutgerinnungshemmende Aktivität von 3 IE/mg zeigt) werden in 25 ml Wasser gelöst und bei 0°C mit 0,58 g Chininbase versetzt. Die erhaltene Lösung wird filtriert und unter 10 Torr Vakuum bei 30"C zur sirupartigen Dichte eingeengt.
Durch Zugabe von 20 mol wasserfreiem Tetrahydrofuran wird das schwach saure Salz gefällt, filtriert, mit 5 ml Tetrahydrofuran, dann zweimal mit je 5 ml Äther gewaschen.
Es werden 1,84g Chinin-heparat erhalten, dessen wäßrige Lösung einen pH-Wert von 4,3 zeigt Analyse: N = 4,8 0/o (entspricht dem theoretischen Stickstoffgehalt). Das Produkt hat keinen charakteristischen Schmelzpunkt und wird oberhalb von 190"C verkohlt.
Dieses Produkt zeigt gegenüber dem soliden Ehrlich-Tumor bei 10tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 100 mg/kg eine 260/0ige retardierende Wirkung.
Beispiel 7 0,655 g Heparinsäure (mit 13,15 0/o Schwefelgehalt, enthält also pro Tetrasacchard-Einheiten im Durchschnitt 3,7 SO3-Gruppen; zeigt eine blutgerinnungshemmende Wirkung von 3 IE/mg) werden in Wasser gelöst und die Lösung unter Eiskühlung mit 0,358 g 3-Amino-4-hydroxy-phenylarsinoxyd versetzt. Die Lösung wird bei einer Temperatur unter 30"C beinahe zur Trockne verdampft und der Rückstand mit 10 ml abs. Äthanol auf Filter gebracht. Das erhaltene Salz wird zweimal mit je 10ml wasserfreiem Äther gewaschen. Es werden 0,93 g 3-Amino-4-hydroxyphenylarsinoxyd-heparinat erhalten; Anylyse: As = 13,50/o, N = 4,30/.
Beispiel 8 1,31 g Heparinsäure (Qualität wie bei Beispiel 7) werden in feingepulvertem Zustand in 50 ml wasserfreiem Äther suspendiert und bei einer Temperatur von -10"C mit 0,92 g 3-Amino-4-hydroxyphenyldichlorarsin versetzt; dann wird das Gemisch in trockenem Stickstoffstrom bei 0°C 5 Stunden lang gerührt. Dann wird das Gemisch unter schwachem Vakuum bei Zimmertemperatur zur Trockne verdampft und der Rückstand in Stickstoffatmosphäre durch Verreiben homogenisiert.
Analyse der erhaltenen Arsenverbindung: As = 12,0°/o, Cl = 11,2°/o, N = 400/ Dieses Produkt zeigt in Tierversuchen dieselbe Wirkung wie das nach Beispiel 7 erhaltenen Produkt, da es bei der Einwirkung von Wasser zu derselben Verbindung hydrolisiert.
Beispiel 9 0,655 g Heparinsäure (Qualität wie in den Beispielen 7 und 8) werden in 15 ml Wasser gelöst, mit 0,144 g 2,5-Bis-äthylenimino-hydrochinon versetzt; dann wird die Lösung im Vakuum bei Zimmertemperatur zur Trockne verdampft und das als Rückstand erhaltene schwach saure Salz mit 10 ml absolutem Äthanol auf einen Filter gebracht, mit 10 ml wasserfreiem Äther gewaschen. Ausbeute: 0,75 g; Analyse: N = 5,05 0/o.
Das Produkt ist in Wasser löslich, pE-Wert der Lösung: 5,5.
Beispiel 10 0,850 g Heparinsäure (Schwefelgehalt 11,75 0/o; enthält also je Tetrasaccharid-Einheiten im Durchschnitt 3,1 SO3H-Gruppen, zeigt keine blutgerinnungshemmende Wirkung) werden in 25 ml Wasser gelöst; dann wird die Lösung mit 0,636g n(-)-threo-l-p-Nitrophenyl-2-amino-1,3-propandiol versetzt. Die erhaltene klare Lösung, welche einen pH-Wert von 6 zeigt, wird wie im Beispiel 5 weiterverarbeitet. Ausbeute 1,40 g.
Dieses im Wasser gut lösliche Produkt hat das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors bei 10tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 100mg/kg um 340/o retardiert.
Beispiel 11 0,830 g Heparinsäure (Schwefelgehalt 11,0°/o, enthält also im Durchschnitt 2,85 SO3-Gruppen je Tetrasaccharid-Einheiten; zeigt keine blutgerinnungshemmende Wirkung) werden in 25 ml Wasser gelöst und mit 0,60 g 3-Amino-4-oxyphenyl-arsonsäure versetzt. Nach üblicher Verarbeitung der Lösung werden 1,35 g hellbraunes Salz erhalten; der p,-Wert des Produktes ist wegen der Anwesenheit von freien Arsonsäuregruppen 1,7.
Das Produkt zeigt, in physiologischer Salzlösung gelöst, bei intraperitonealer Verabreichung, 10 Tage lang in 150ml/kg täglichen Dosen verwendet, eine 41 0/0ige Retardierung des soliden Ehrlich-Tumors.
Beispiel 12 0,850 g Heparinsäure (Qualität wie im Beispiel 10) werden in 25 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 0,465 g 7-Chlor-4-(4-diäthylamino- 1 -methylbutylamino)-chinolin versetzt und die Lösung in üblicher Weise verarbeitet. Das erhaltene Salz zeigt einen pE-Wert von 4,2; seine Analyse entspricht den berechneten Werten. Das Produkt zeigt bei 10tägiger Anwendung in täglichen Dosen von 150 mg/kg eine 250/,ige Retardierung des soliden Ehrlich-Tumors.
Beispiel 13 1,7 g Heparinsäure (Qualität wie im Beispiel 10) werden in 40ml Wasser gelöst, mit 1,07g 2,5-Bisp- dimethyl - aminoäthoxy- 3,6 - bis-äthylenimino-benzochinon-(1,4) (Schmelzpunkt 60 bis 61"C) versetzt.
Die Lösung (pH = 6) wird filtriert und unter Ventilation in einer Schale von großer Oberfläche innerhalb von 3 Stunden zur sirupartigen Dichte eingeengt. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird mit 30 mol Aceton versetzt, das ausgefällte hellbraune Salz filtriert und mit dreimal 10ml Aceton gewaschen.
Ausbeute: 2,62 g (97 O/o der theoretischen Menge).
Beispiel 14 Es wird wie im Beispiel 10 gearbeitet, aber als basische Komponente werden 0,91 g 2,5-Di-N-methyl- piperazino-benzochinon-(1,4) (Schmelzpunkt 188 bis 190"C) verwendet. Es werden 2,37 g hellbraunes Heparinsalz erhalten (95 0/o der theoretischen Menge).
Das Produkt ist in Wasser gut löslich; px-Wert der wäßrigen Lösung = 6.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von neuen, erhöhte und spezifische Wirkung zeigenden Heparin-Derivaten zytostatischer oder den Stoffwechsel der Tumorzellen hemmender Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man zytostatisch wirkende oder die im Stoffwechsel der Tumorzellen mitwirkendeEnzyme hemmende basische Verbindungen in an sich bekannter Weise mit Heparinsäure umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Heparinsäure eine die Blutgerinnung nicht hemmende Heparinsäure mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht unter 25000 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Heparinsäure eine je Tetrasaccharid-Einheiten durchschnittlich drei bis vier SO3 H-Gruppen enthaltende Heparinsäure verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man N-Lost-Derivate, N-Halblost-Derivate oder Äthylenimin-Derivate als zytostatische Verbindungen verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man organische Arsenverbindungen, Sulfonamide oder basisch substituierte Chinon-Derivate als zellenstoffwechselhemmende Verbindungen verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Chinaalkaloide oder synthetische Malariamittel als zellenstoffwechselhemmende Verbindungen verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man o(-)-threo-l -p-Nitrophenyl-2-amino-1,3-propandiol als zellenstoffwechselhemmende Verbindung verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die basische Verbindung und die Heparinsäure in einem solchen Mengenverhältnis umsetzt, daß das erhaltene Salz in 30/0aber Lösung einen Px-Wert zwischen 1,5 und 7,5 zeigt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die basische Verbindung und die Heparinsäure in einem solchen Mengenverhältnis umsetzt, daß die basische Verbindung zur Bindung sämtlicher in der Heparinsäure anwesender SO3H-Gruppen nicht ausreicht.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in wäßrigem oder alkoholischem bzw. wäßrig-alkoholischem Medium bei einer Temperatur zwischen - 10 und +30°C durchführt und das entstandene Heparinsalz vom Reaktionsgemisch isoliert.

In Betracht gezogene Druckschriften: Biochem. J., 60 (1955), S. 346; Minerva med. I. (1953), S. 230; nature, 178 (1956), S. 1293.