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Verfahren zur Herstellung von neuen Heparinderivaten
Es ist bekannt, dass die in neuerer Zeit zur Behandlung von malignen Tumoren vielfach angewendeten sogenannten zytostatischen Stoffe den allgemeinen Nachteil einer unspezifischen Wirkung zeigen ; diese
Stoffe beeinflussen nicht nur die Lebensfunktionen der Tumorzellen, sondern üben ihre Wirkung auch gegenüber den übrigen Zellen des behandelten Organismus aus. Diese Mittel sind deshalb in sehr hohem Grade toxisch, wodurch ihre therapeutische Anwendung ausserordentlich erschwert wird.
Es ist ferner bekannt, dass bei Tumorerkrankungen die Menge des im Organismus anwesenden Heparins erheblich abnimmt und gleichzeitig vermehren sich in der Umgebung der Tumore und anderer wuchernder Gewebe erheblich die heparinhaltigen sogenannten Ehrlich'schen Mastzellen, deshalb benötigen die Tumorzellen zu ihrer Vermehrung auch Heparin.
Es wurde nun gefunden, dass bestimmte mit Heparin gebildete Verbindungen zytostatisch wirkender Stoffe sowie auf das Enzymsystem der Zellen wirkender, enzymhemmender Stoffe oder Heparinverbindungen mit Stoffen, die beide Wirkungen zugleich zeigend, eine erhöhte bzw. spezifische tumorhemmende Wirkung haben. Diese Eigenschaft der genannten neuen Heparinverbindungen kann dadurch erklärt werden. dass diese Stoffe biologisch einen heparinoiden Charakter zeigen, und infolgedessen sich vorwiegend in den heparinaffinen Zellen des Organismus, also in den Tumorzellen, anhäufen. So schädigen diese Stoffe spezifisch die Tumorzellen, u. zw. in praktisch sehr erheblichem Grad auch bei so niedrigen Konzentrationen, bei welchen sie noch überhaupt keine oder nur kaum merkbare zellenschädigende Wirkung auf die gesunden Gewebe ausüben.
Diese Eigenschaft der genannten Heparinverbindungen ist umso überraschender, als die bekannten Bausteine der Heparinsäure, die D-Glukuronsäure und das D-Glukosamid die Entwicklung der experimentellen Tumore sogar begünstigen.
Diese neuen Heparinderivate von erhöhter bzw. spezifischer tumorhemmender Wirkung werden erfindungsgemäss dadurch hergestellt, dass man Heparinsäure mit basischen, zur Salzbildung fähigen N-LostDerivaten, N-Halblostderivaten, Äthylenimin-Derivaten, Sulfonamiden, organischen Arsenverbindun- gen, Chinon-Derivaten oder Hydrochinon-Derivaten, Chinalkaloiden, wie Chinin, oder dem Chinin ähn-
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Die saure Komponente der erfindungsgemäss herstellbaren neuen salzartigen Verbindungen ist also die stark sauer reagierende Heparinsäure ; diese Verbindung wird in der Therapie vorwiegend in der Form ihres Natriumsalzes, u. zw. zur Regulierung der Blutgerinnungsdauer, ferner bei Bluttransfusionen und zur Behandlung von Trombosen verwendet. Die verschiedenen natürlichen Heparine bestehen aus MakromolekülGemischen, welche sich voneinander nicht nur in ihren durchschnittlichen Molekulargewichten, sondern auch hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung unterscheiden.
Die am meisten vorkommende Art der Heparinsäure kann mit der folgenden, als erwiesen zu betrachtenden Zusammensetzung charakterisiert werden : sie besteht aus äquivalenten Mengen von D-Glukosamin-N-schwefelsäure und D-Glukuronsäure, wobei jede zweite D-Glukuronsäure-Komponente an der C2-Hydroxylgruppe und jede D-Glukosamid-
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Theoretisch ist also die HeparinmoleMllkette aus solchen sich wiederholenden Tetrasaccharid-Ein- heiten aufgebaut, die eine D-Glukosamin-N-schwefelsäure-2-schwefelsäure-ester, eine D-Glukonsäure, eine D-Glukosamin-N-schwefel-2-schwefelsäureester und eine D-Glukonsäure-4-schwefelsäureester-Ein- heit in der angegebenen Reihenfolge enthalten.
Das Molekulargewicht dieser im Makromolekül sich mehr- mals wiederholenden Tetrasaccharid-Einheiten beträgt 1002, 8 ; sie enthalten je 5 SO3 H- und 2 COOH- Gruppen.
Die starke Neigung des Heparins, sich an Proteine zu binden, kann durch seine grosse Azidität, wel- che vorwiegend von den SOgH-Gruppen hervorgerufen wird, erklärt werden. Die Wirkung des Heparins auf die Blutgerinnung wird durch sein Molekulargewicht und seinen Schwefelsäuregehalt beeinflusst. Das durchschnittliche Molekulargewicht eines Heparins mit guter blutgerinnungshemmender Wirkung ist etwa 20 000. In den verschiedenen natürlichen Heparinen kommen aber in dem oben angeführten, Vier-RingEinheiten umfassenden Molekülteil nicht immer fünf SOgH-Gruppen vor, sondern die Zahl dieser Gruppen schwanktim allgemeinen zwischen 2 und 5.
Diese na türlichen Heparine sind zwar in alkalischem Medium ziemlich stabil, sie neigen aber in saueren Medien zur hydrolytischen Depolymerisation, wodurch ihre blutgerinnungshemmende Aktivität abnimmt oder völlig verloren geht. Da aber die Heparin-Affinität der Tumorzellen auch gegenüber solchen, therapeutisch sonst minderwertigen bzw. wertlosen Heparinen besteht, können als Ausgangsstoffe des erfindungsgemässen Verfahrens auch solche verwendet werden. Unter "Heparinsäure"ist also in dieser Beschreibung jede oben erwähnte Art des natürlichen Heparins, in Form von freier Säure, zu verstehen.
Als basische Komponente kommen bei der Herstellung der neuen Verbindungen die oben erwähnten basischen, zur Salzbildung fähigen Komponenten in Frage. Es sind dies unter anderem die genannten N-Lost-Derivate, N-Halblost-Derivate und Äthylenimin-Derivate. Als Beispiele solcher Verbindungen können das 1, 6-Bis- (ss-chloräthylenamino)-1, 6-desoxy-D-mannit und das2- [Bis- (ss-chloräthyl)-amino- methyl]-benzimidazol erwähnt werden.
Weiters kommen als basische Komponenten Sulfonamide, organische Arsenverbindungen, Chinon- und Hydrochinon-Derivate in Frage. So zeigen z. B. das p- Aminobenzolsulfonamid, das p- Aminobenzol- sulfaguanidin oder das 2- (4-Aminobenzolsulfamido)-4-methylthiazol eine hemmende Wirkung gegenüber den Glukose-a-phosphat-dehydrogenase, Mi1chsäure-dehydrogenase, Glukose-dehydrogenase, Zytochromreductase, Brenztraubensäure-carboxylase, Zytochromoxydase, Sukzino-dehydrogenase usw. Enzymen eine hemmende Wirkung. Einige Alkaloide, wie Chinaalkaloide, z.
B. das Chinin und die dem Chinin ähnlichen synthetischen Malaria-Mittel, wie z. B. das 3-CMor-'7-methoxy-9- (a-methyldiäthylamino- - butylamino)-acridin, das 6-Methoxy-8-(α-diäthylamino-α-methylbutyl)-aminochinolin und das 7-Chlor- - (4-diäthylamino-l-methyl-butylamino)-chinolin, zeigen eine hemmende Wirkung gegenüber Zyto-
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In der Literatur wurden schon einige, mit organischen Basen gebildete Salze der Heparinsäure beschrieben, welche aber keine zytostatische oder zur Hemmung des im Stoffwechsel der Tumorzellen eine
Rolle spielenden Enzyme fähige Verbindungen als basische Komponente enthielten. Diese bekannten
Heparinsalze haben auch überhaupt keine tumorhemmende Eigenschaften ; sie zeigen höchstens heparin- ähnliche, blutgerinnungshemmende Wirkungen. So wurden z. B. eine aus 20 Teilen Heparin und 1 Teil Histamin hergestellte wässerige Lösung (R. K. Sanyal und G. B. West, Nature 178 [1956], S. 1293 und die mit N, N'- Bis- (a-methylbenzyl) - äthylendiamin (A. Cantone, Minerva Med. L [1953], S. 230) und mit
Aminoakridinen gebildeten Heparinsalze (K. S. Dodgson, F. A. Rose und B. Spencer, Biochem.
J. 60 [1955],
S. 346) beschrieben, die aber keinerlei tumorhemmende Wirkung zeigen.
Es ist beim erfindungsgemässen Verfahren nicht erforderlich, dass die als Ausgangsstoff verwendete
Heparinsäure eine blutgerinnungshemmende Aktivität zeigt. Die beiden Komponenten können in äquivalenten Mengen oder in einem solchen Mengenverhältnis verwendet werden, dass die Menge der basi- schen Verbindung geringer als die aus der Zahl der anwesenden-NH-SOgH-und-0-SO H-Gruppen berechnete äquivalente Menge ist : in letzterem Falle werden saure Heparinsalze als Produkte gewonnen.
Beide Arten der als Produkt erhaltenen Heparinsalze zeigen die erwähnte vorteilhafte tumorhemmende Wirkung.
Die Reaktion kann in einem anorganischen oder organischen Lösungsmittel, zweckmässig in Wasser, in niederen primären Alkoholen oder in einer Mischung der gesamten Lösungsmittel, vorteilhaft in einem Temperaturbereich zwischen-10 und +300C, vorgenommen werden.
Bei der Herstellung der erfindungsgemässen neuen Heparinderivate ist es nicht nötig, dass feste, isolierte Heparinsäure als Ausgangsstoff verwendet wird ; die bei der Heparinsäureherstellung als Rohprodukt gewonnene wässerige oder organische Heparinsäurelösung kann ebenfalls als Ausgangsstoff verwendeterden.
Die erfindungsgemäss hergestellten neuen Heparinsalze sind im Wasser meistens gut löslich ; der PHWert der Lösung hängt von der Zahl der in der Heparinsäure anwesenden SOH-Gruppen und von der Menge der verwendeten basischen Komponente ab. Zweckmässigerweise wird das Verhältnis dieser Faktoren derart gewählt, dass der pH-Wert der wässerigen Lösung des Produktes zwischen 1, 5 und 7,5 liegt.
Die im Sinne der Erfindung hergestellten neuen Heparinderivate zeigen eine zytostatische Aktivität, welche die ähnliche Wirkung der bisher bekannten zytostatischen Mittel wesentlich übertrifft, da diese neuen Verbindungen auf Grund ihrer spezifischen Wirkungsweise hauptsächlich auf die Tumorgewebe wir-
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Gewichtsverlust bei den Tieren verursachen, das mit Heparinsäure gebildete Salz derselben Verbindung in derselben Dosis überhaupt keinen Gewichtsverlust herbeiführt, anderseits aber bei viel kleineren Dosen, z. B. 2, 5 mg/kg, das Hydrochlorid der genannten zytostatischen Verbindung überhaupt keine tumorhemmende Wirkung zeigt, während das mit Heparinsäure gebildete Salz eine sehr merkliche tumorhemmende Wirkung aufweist.
Die praktische Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird näher in den nachfolgenden Beispielen veranschaulicht.
Beispiel l : 4, 55 g (0, 012 Mol) l, 6-Bis- (ss-chloräthylamino)-l, 6-desoxy-D-mannit-dihydro- chlorid werden in 20 ml Wasser gelöst und unter Eiskühlung mit einer Lösung von 1, 34 g (0,024 Mol) Kaliumhydroxyd in 5 ml Wasser versetzt, dann wird dem Gemisch eine Lösung von 8,75 g Heparinsäure in 20 ml Wasser zugesetzt. Die klare Lösung wird bei einer Temperatur unter 300C zur sirupartigen Dichte eingedampft und mit 75 ml abs. Äthanol versetzt. Das sich ausscheidende Heparinsalz wird filtriert, mit 20 ml abs. Äthanol und dann mit 20 ml wasserfreiem Äther gewaschen.
Es werden 14, 10 g l, 6-Bis- - (ss-chloräthylamin)-l, 6-desoxy-D-mannit-heparinsaures Salz erhalten (theoretische Ausbeute 14, 21 g) in Form eines hell kremfarbigen, amorphen, wasserlöslichen, 12, 6% KCI enthaltenden, keinen charakteristischen Schmelzpunkt zeigenden Produktes.
Das als Ausgangsprodukt verwendete 1, 6-Bis- (ss- chloräthylamino)-l, 6-desoxy-D-mannit-dihydrochlorid (Degranol, Mannomustin) ist ein bekanntes zytostatisches Mittel, dessen Herstellung in der Mitteilung von L. Vargha usw. (J. Chem. Soc. [1957], S. 805) beschrieben ist.
Die zur obigen Reaktion verwendete Heparinsäure zeigt eine blutgerinnungshemmende Aktivität von 3,2 IE/mg ; sie hat keinen charakteristischen Schmelzpunkt, wird über 1800C langsam braun verfärbt und über 2050C verkohlt. Analyse : N= 3, 00/0, S = 13, 150%). Diese Heparinsäure enthält also je Tetrasaccharidgruppe anstatt der maximalen 5 nur im Durchschnitt 3,7 SOH-Gruppen. Demgemäss ist das Molekulargewicht dieser sich wiederholenden Tetrasaccharidgruppen anstatt 1002,8 nur 898.
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Im Endprodukt sind 80% der in der Heparinsäure ursprünglich anwesenden SOgH-Gruppen durch die Basizität des Mannomustins gebunden. Die Anwesenheit dieser freien SOH-Gruppen wird auch durch den pH-Wert der wässerigen Lösung des Produktes (3-3, 5) gezeigt.
Das auf obige Weise hergestellte Mannomustin - Heparinat hat in Tierversuchen folgende Resultate
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durchgeführten vergleichenden Versuchen hat die Behandlung mit die gleiche Menge Mannomustin enthaltenden Dosen nur eine 25% ige Hemmung des Tumorwachstums verursacht.
Solider Ehrlich-Tumor : bei einer 10tägigen Behandlung mit täglichen Dosen von 25 mg/kg hat das Mannomustin-Heparinat um 63, 6ufo die Gewichtszunahme der Tumoren verzögert. Die gleichzeitig mit Mannomustin-dihydrochIorid durchgeführten vergleichenden Versuche haben eine 24'%0igue Beschleunigung des Tumorwachstums ergeben.
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morwachstums festzustellen.
Beispiel 2 : Es wird in ähnlicher Weise gearbeitet, wie im Beispiel 2 beschrieben, nur wird anstatt von 0,012 Mol Mannomustin die mit den anwesenden SO3H-Gruppen der Heparinsäure äquivalente Menge, also im Falle des im Beispiel 1 verwendeten Heparins 0,016 Mol Mannomustin mit der Heparinsäure in Reaktion gebracht. Dadurch wird als Produkt ein KCl-haltiges neutrales Salz erhalten, welches in wässeriger Lösung einen pH-Wert von 5, 5 bis 6 zeigt. Dieses Produkt gab in Tierversuchen denjenigen der im Beispiel 1 beschriebenen gleichwertige Ergebnisse.
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hergestellt werden : p-Aminobenzolsulfamid, 2- (4-Aminobenzolsulfamido)-4-methyl-thiazol und 2-Sulfanilamido-4,6-dimethyl-pyrimidin,
In Tierversuchen haben diese Produkte ebenfalls gute tumorhemmende Wirkung gezeigt.
Das p-Aminobenzolsulfamid-heparinat hat bei 10tägiger Behandlung in täglich 40 mg/kg Dosen das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors um 24% retardiert. Bei dem 2-(4-Aminobenzolsulfamido)-4-methylthia-
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gleichen Bedingungen 25%.
Beispiel 6 : 1, 31 g Heparinsäure (welche im Durchschnitt 3, 7 SOsH-Gruppen pro TetrasaccharidEinheiten enthält und eine blutgerinnungshemmende Aktivität von 3 IE/mg zeigt) werden in 25 ml Wasser gelöst und bei 0 C mit 0, 58gChininbase versetzt. Die erhaltene Lösung wird filtriert und unter 10 Torr Vakuum bei 300C zur sirupartigen Dichte eingeengt. Durch Zugabe von 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wird das schwach saure Salz gefällt, filtriert, mit 5 ml Tetrahydrofuran, dann zweimal mit je 5 ml Äther gewaschen.
Es werden 1, 84 g Chinin-heparat erhalten, dessen wässerige Lösung einen pH-Wert von 4, 3 zeigt.
Analyse : N 4, 8% (entspricht dem theoretischen Stickstoffgehalt). Das Produkt hat keinen charakteristischen Schmelzpunkt, wird oberhalb von 1900C verkohlt.
Dieses Produkt zeigt gegenüber dem soliden Ehrlich-Tumor bei 10tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 100 mg/kg eine 26% igue retardierende Wirkung.
Beispiel 7 : 0, 655 g Heparinsäure (mit 13, 150/0 Schwefelgehalt, enthält also pro Tetrasaccharid-
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oxyd versetzt. Die Lösung wird bei einer Temperatur unter 300C beinahe zur Trockne verdampft und der Rückstand mit 10 ml abs. Äthanol auf Filter gebracht. Das erhaltene Salz wird zweimal mit je 10 ml wasserfreiem Äther gewaschen. Es werden 0, 93 g 3 - Amino-4-hydroxy-phenylarsinoxyd-heparinat erhalten ; Analyse : As 13, 5%, N 4. 35o.
Beispiel 8: 1,31 g Heparinsäure (Qualität wie bei Beispiel 7) werden in feingepulvertem Zustand in 50 ml wasserfreiem Äther suspendiert und bei einer Temperatur von -100C mit 0, 92 g 3-Amino-4-hydroxy-phenyl-dichlorarsin versetzt, dann wird das Gemisch in trockenem Stickstoffstrom bei OOC 5 h lang gerührt. Dann wird das Gemisch unter schwachem Vakuum bei Zimmertemperatur zur Trockne verdampft und der Rückstand in Stickstoffatmosphäre durch Verreiben homogenisiert.
Analyse der erhaltenen Arsenverbindung : As 12, 0%, Cl 11, 2%, N 4,0go. Dieses Produkt zeigt in Tierversuchen dieselbe Wirkung wie das nach Beispiel 7 erhaltene Produkt, da es bei der Einwirkung von Wasser zu derselben Verbindung hydrolysiert.
Beispiel 9 : 0, 655 g Heparinsäure (Qualität wie im Beispiel 7 und 8) werden in 15 ml Wasser gelöst, mit 0, 144 g 2, 5-Bis-äthylenimino-hydrochinon versetzt, dann wird die Lösung im Vakuum bei Zimmertemperatur zur Trockne verdampft und das als Rückstand erhaltene schwach saure Salz mit 10 ml abs. Äthanol auf einen Filter gebracht, mit 10 ml wasserfreiem Äther gewaschen. Ausbeute : 0, 75 g ; Analyse : N 5,05%. Das Produkt ist in Wasser löslich, pH-Wert der Lösung : 5, 5.
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25 ml Wasser gelöst, dann wird die Lösung mit 0,636 g D(-)-threo-1-p-Nitrophenyl-2-amino-1,3-propandiol versetzt. Die erhaltene klare Lösung, welche einen PH-Wert von 6 zeigt, wird wie im Beispiel 5 weiterverarbeitet. Ausbeute 1, 40 g.
Dieses im Wasser gut lösliche Produkt hat das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors bei 10tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 100 mg/kg um 34% retardiert.
B e i s p i e l 11: 0,830 g Heparinsäure (Schwefelgehalt 11,0%, enthält also im Durchschnitt 2, 85 SO-Gruppen je Tetrasaccharid-Einheiten ; zeigt keine blutgerinnungshemmende Wirkung) werden in 25 ml Wasser gelöst und mit 0, 60 g 3-Amino-4-oxyphenyl-arsonsäure versetzt. Nach üblicher Verarbeitung der Lösung werden 1, 35 g hellbraunes Salz erhalten, der pH-Wert des Produktes ist wegen der Anwesenheit von freien Arsonsäure-Gruppen 1, 7.
Das Produkt zeigt in physiologischer Salzlösung gelöst, bei intraperitonealer Verabreichung, 10 Tage
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igueBei spiel 12 : 0, 85 g Heparinsäure (Qualität wie im Beispiel 10) werden in 25 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 0, 465 g 7-Chlor-4-(4-diäthylamino-1-methylbutylamino)-chinolin versetzt und die Lösung in üblicher Weise verarbeitet. Das erhaltene Salz zeigt einen PH-Wert von 4, 2 ; seine Analyse entspricht den berechneten Werten. Das Produkt zeigt bei 10tägiger Anwendung in täglichen Dosen von 150 mg/kg eine 25% ige Retardierung des soliden Ehrlich-Tumors.
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Beispiel 13: 1,7 g Heparinsäure (Qualität wie im Beispiel 10) werden in 40 ml Wasser gelöst, mit l, 07 g 2, 5 - Bis - ss - dimethyl - aminoäthoxy - 3,6 - bis -äthylenimino-benzochinon-(1, 4) (Schmelzpunkt 60-61 C) versetzt.
Die Lösung (PH = 6) wird filtriert und unter Ventilation in einer Schale von grosser Oberfläche inner- , halb von 3 h zur sirupartigen Dichte eingeengt. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird mit 30 ml Aceton versetzt, das ausgefällte hellbraune Salz filtriert und mit 3. X 10 ml Aceton gewaschen. Ausbeute : 2, 62 g (97% der theoretischen Menge).
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14 : Es wirdpH-Wert der wässerigen Lösung = 6.
PATENTANSPRÜCHE : l. Verfahren zur Herstellung von neuen Heparinderivaten von erhöhter bzw. spezifischer tumorhemmender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man Heparinsäure mit basischen, zur Salzbildung fähigen
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