DE2833898C2

DE2833898C2 -

Info

Publication number: DE2833898C2
Application number: DE2833898A
Authority: DE
Inventors: Fernando Lesmo Mailand/Milano It Fussi; Gianfranco Mailand/Milano It Fedeli
Original assignee: Hepar Chimie Sa Freiburg/fribourg Ch
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1977-08-09
Filing date: 1978-08-02
Publication date: 1988-06-23
Also published as: AU3873878A; JPS5430277A; ES472934A1; FR2400037A1; FR2400037B1; US4757057A; IT1083903B; DE2833898A1; GB2002406B; CH642979A5; JPS6234041B2; DK349678A; DK159278B; GB2002406A

Description

Die Erfindung betrifft ein depolymerisiertes Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie ein therapeutisches Präparat, insbesondere zur Vorbeugung bzw. Verhütung von thrombotischen Erscheinungen.

Thrombose ist einer der häufigsten Mortalitäts- und Morbilitätsfaktoren mit oft permanentem Invaliditätscharakter im Bereich der kardiovaskularen Erkrankungen.

Der allgemeine Begriff Thrombose umfaßt Zustände der Hypergerinnfähigkeit, deren Ursache auf folgende verschiedene Faktoren zurückgeführt werden kann:

- "Risikofaktoren", die einen thrombogenen Zustand herbeiführen, wie beispielsweise Rauchen, Überanstrengung (Streß) und Gebrauch von Empfängnisverhütungsmitteln des Gestagen-Typs über längere Zeit;
- Vererbungsfaktoren, wie das Fehlen von koagulationsverhütenden Faktoren (insbesondere von Antithrombin III);
- ätiologische Faktoren verschiedener Herkunft bzw. mitunter noch nicht ganz geklärten Ursprungs, wie Modifikationen der Adhäsivität der Thrombozyten;
- Faktoren, die mit einer zeitweisen Verlangsamung des Blutkreislaufes einhergehen, wie sie beispielsweise nach chirurgischen Eingriffen unter Narkose auftreten.

Die pathologischen Folgen eines durch einen oder mehrere der vorgenannten Faktoren herbeigeführten "thrombogenen" Zustands können folgende sein:

- Thromboembolien der Lungen, des Gehirns, der Koronarien;
- Thrombose der tiefen Venen;
- thrombotische Venenentzündungen, Krampfadern-Syndrome;
- diffuse Streuung intravaskularer Mikrothromben.

Gegenüber solch wichtigen Erscheinungsformen können heute zwei verschiedene Strategien verfolgt werden:

1. Verwendung thrombolytischer Mittel;
2. Vorbeugung thrombogener Zustände und ihrer Folgen.

Angesichts der Schnelligkeit und Gefährlichkeit, mit denen sich die Thrombose entwickeln kann, liegt es auf der Hand, daß die zweite Strategie die weitaus bessere wäre.

Um das Problem der Thrombose vom Gesichtspunkt der Vorbeugung anzugreifen, verfügt man bisher über zwei Kategorien von Arzneimitteln; die oralen Antikoagulantien (Cumarin und Derivate) und das Heparin.

Die oralen Antikoagulantien (Cumarin und Derivate) wirken auf die Leber, indem sie die zwei Faktoren der Blutkoagulation Prokonvertin und Prothrombin blockieren. Diese Antikoagulantien führen jedoch zu Häufungserscheinungen und eignen sich daher schlecht für eine längere Therapie. Ferner haben sie, obzwar sie koagulationshemmend sind, eine geringe thrombosehindernde Wirkung, weil sie nicht auf andere Faktoren der Blutkoagulation wirken, die an der Genese der Thrombose besonders beteiligt sind, allen voran der Faktor Xa und die thrombozytischen Faktoren.

Das Heparin erscheint von diesem Gesichtspunkt aus als vorteilhafter, da es auf die verschiedenen plasmatischen Faktoren der Blutkoagulation wirkt, und insbesondere auf das Thrombin, auf den Faktor Xa und auch auf die Faktoren XII, XI, IX, außer auf den thrombozytischen Faktor, der mit PF4 bezeichnet wird: Alle diese Wirkungen sind auf die spezifische Fähigkeit des Heparins zurückzuführen, den im Plasma anwesenden Inhibitor freizugeben, der die oben aufgezählten Faktoren der Koagulation hemmt. Dieser Inhibitor heißt Antithrombin III und erfordert die Anwesenheit von Heparin, um seine Wirkung entfalten zu können.

Leider weist das Heparin zwei Nachteile auf; erstens ist es nur parenteral wirksam, und seine Wirkung hält nicht länger als 8 bis 12 Stunden an, weshalb eine längere Prophylaxe, die 2 Injektionen Heparin täglich vorsieht, schwerlich durchzuführen ist. Zweitens hat Heparin nicht nur eine antithrombotische Wirkung, sondern auch eine totale gerinnungshemmende Wirkung. Ist auch diese zweite Wirkung in einigen Fällen günstig, so kann doch in anderen Fällen das Risiko einer Hämorrhagie, wenn die Therapie sich nicht für den einzelnen Patienten eignet, ein schwerwiegender Nachteil sein gegenüber den wenn auch außer Frage stehenden Vorteilen einer Prophylaxe der Thrombose.

Heparinfraktionen geringen Molekulargewichts begegnet man in zwei Fällen:

a) bei der Depolymerisierung des Heparins mit chemischen oder enzymatischen Methoden (vgl. A. Horner in "HEPARIN" - Kakkar, Thomas 1976 und Perhin und Mitarbeiter Carb. Res. 18, 185 (1971));
b) in den Mutterlaugen der Extraktionsprozesse der Herstellung des Heparins für therapeutische Zwecke.

Diese Fraktionen, die Molekulargewichte von 5000 haben und variable Mengen von schwefelsauren Gruppen enthalten, die im allgemeinen geringer sind als die des Heparins, haben bislang keine nutzvolle therapeutische Anwendung gefunden.

Es ist nun gefunden worden, daß diese Fraktionen, wenn sie die schwefelsauren Gruppen in Mengen und Stellungen enthalten, die für das Heparinmolekül charakteristisch sind, biopharmakologische Eigenschaften besitzen, die denen des Heparins analog und therapeutisch sogar überlegen sind.

Das erfindungsgemäße Produkt wird durch folgende Daten charakterisiert:

- Mittleres Molekulargewicht (bestimmt mit der Methode von Somogy im Vergleich zu dem Heparin des Handels): zwischen 2600 und 5500 Daltons;
- Hexosamine nach Hydrolyse (Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd): 28±2%;
- Uronsäuren nach Hydrolyse (Reaktion mit Carbazol): 31±4%;
- Organisches SO₄^-- nach Hydrolyse (Titrierung mit Naphtarson): 30±4%;
- Molare Verhältnisse Uronsäuren : Hexosamine : SO₄^--=1 : 1 : 2;
- Spezifisches Drehvermögen der wäßrigen Lösung:
[α]=+40° bis +50°;
- Elektrophorose auf Celluloseacetat (Puffer Pyridin/Essig säure/Wasser 1 : 10 : 229) pH 4,5 und Entwicklung mit Toluidin-Blau) = ein einziges Band mit anodischer Beweglichkeit U =2,1×10^-4 cm² v^-1 sec^-1;
- amorphes, leicht hygroskopisches, elfenbeinfarbenes Pulver;
- klare oder leicht opaleszierende wäßrige Lösung;
- pH der 5%igen wäßrigen Lösung: 7 bis 8;
- metachromatische Erkennungsreaktion: Zugabe von 1 ml 2%iger Lösung des Produkts zu 1 ml einer mit 0,1 ml 1 N-Salzsäure angesäuerter 0,0025%iger Lösung von Toluidin-Blau bewirkt einen Umschlag der Farbe von blau auf blaurötlich und ist erhältlich nach dem weiter unten beschriebenen Verfahren.

Die von der Depolymerisierung des Heparins kommenden Fraktionen oder die depolymerisierten Heparinen entsprechenden Fraktionen mit Molekulargewichten zwischen 2000 und 5000 weisen biopharmakologische Eigenschaften auf, die denen des Heparins überlegen sind, sofern sie in geeigneter, weiter unten beschriebener Weise behandelt werden, um die aktiven Gruppen wiederaufzubauen. So ist das erfindungsgemäße Produkt zum Unterschied von Heparin selbst auch bei oraler Verabreichung wirksam und wird bei perkutaner Verabreichung leichter absorbiert. Ferner hat es im Vergleich zum Heparin des Handels ein vorteilhaftes Verhältnis zwischen thrombosehemmender und gerinnungshemmender Wirkung.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des depolymerisierten Heparins ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Heparinfraktion mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 2000 und 5000 Daltons mit der gleichen Gewichtsmenge eines Schwefeltrioxid-Pyridin- oder Schwefeltrioxid- Trimethylamin-Komplexes in alkalischem Milieu in an sich bekannter Weise umsetzt, das Reaktionsprodukt mit Methanol, Ethanol, Aceton oder Dioxan fällt, das gefällte Produkt in Wasser wieder auflöst und über einen Ionenaustauscher oder ein Molekularsieb führt.

Aus der Lösung gewinnt man das Produkt durch Fällen mit mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln oder durch Lyophilisierung.

Das so erhaltene Produkt hat die oben angegebenen Eigenschaften.

Die nachstehenden Beispiele erläutern insbesondere das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Produkte.

Beispiel 1

500 g einer Heparinfraktion mit den folgenden analytischen Grundeigenschaften:

- pH der 5%igen Lösung: 5,8,
- organisches SO₄^--: 13,6%,
- Drehvermögen [α ]=+48°,
- Mittleres Molekulargewicht (bestimmt mit der Methode von Somogy im Vergleich zum Heparin des Handels): 4850±300 Daltons,
- Hexosamine: 33,5%,
- Uronsäuren: 31,8%,
- gerinnungshemmende Wirkung: praktisch Null

wurden als Pulver mit 500 g Pyridin-Schwefeltrioxid und 500 g wasserfreiem Natriumcarbonat vermischt.

Die Mischung wurde in 10 Liter destilliertem Wasser dispergiert und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt.

Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Flüssigkeit mit 20 Liter Methanol behandelt. Es bildete sich ein weißer Niederschlag, der nach Abscheidung durch Zentrifugieren in 5 Liter destilliertem Wasser aufgelöst und auf eine 20 Liter Dowex® Retardion 11 A 8 enthaltende Säule (Durchmesser 16 cm, Höhe 110 cm) gegeben wurde.

Das Eluat wurde mit 20%igem Natriumhydroxid auf pH 6 eingestellt und mit 2 Volumina Methanol behandelt. Nach dem Dekantieren wurde der weiße Niederschlag mit Methanol dehydratisiert und unter Vakuum bei 40°C getrocknet. Ausbeute 365 g.

Das Produkt wies folgende analytische Eigenschaften auf:

- pH der 5%igen Lösung: 6,5,
- organisches SO₄^--: 31%,
- Drehvermögen [α ]=+47°,
- Mittleres Molekulargewicht (bestimmt mit der Methode von Somogy im Vergleich zum Heparin des Handels) =5300±300 Daltons,
- Hexosamine: 28,5%,
- Uronsäuren: 30%,
- gerinnungshemmende Wirkung: 36 U/mg (USP).

Beispiel 2

250 g Trimethylamin-Schwefeltrioxid und 250 g wasserfreies Natriumcarbonat wurden als Pulver mit 250 g einer die nachstehend aufgeführten analytischen Grundeigenschaften aufweisenden Heparinfraktion vermischt:

- pH der 5%igen wäßrigen Lösung: 6,4,
- Mittleres Molekulargewicht (bestimmt mit der Methode von Somogy im Vergleich zum Heparin des Handels): 3400±400 Daltons,
- organisches SO₄^--: 11,8%,
- Hexosamine: 34,2%,
- Uronsäuren: 36%,
- gerinnungshemmende Wirkung (USP): 0,5 U/mg.

Das Gemisch wurde in 5 Liter destilliertem Wasser dispergiert und 12 Stunden lang bei 55°C gerührt.

Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Lösung auf ein Bett von 10 Liter Dowex® Retardion 11 A 8 gegeben.

Das Eluat wurde mit 20%igem Natriumhydroxid auf pH 6 eingestellt und mit drei Volumina Aceton behandelt. Es bildete sich ein weißer Niederschlag, der nach dem Dekantieren mit Aceton dehydratisiert und unter Vakuum bei 40°C getrocknet wurde. Ausbeute 165 g.

Das Produkt wies die folgenden analytischen Eigenschaften auf:

- pH der Lösung (5%ig): 7,1,
- Drehvermögen [α ]=+42°,
- Mittleres Molekulargewicht (bestimmt mit der Methode von Somogy im Vergleich zum Heparin des Handels): 3900±280 Daltons,
- organisches SO₄^--: 28,5%,
- Hexosamine: 29%,
- Uronsäuren: 30%,
- gerinnungshemmende Wirksamkeit: 17 U/mg (USP).

Das mit dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene Produkt wurde auf seine pharmazeutisch-biologischen Eigenschaften und Wirkungen untersucht wie folgt:

Toxikologische Prüfungen:
Keine toxische Wirkung bei oraler Verabreichung an Ratten, Mäusen, Kaninchen und Meerschweinchen bis zur Dosis von 1000 mg/kg

LD₅₀ i. p.
(Maus)<3000 mg/kg (Ratte)∼2000 mg/kg LD₅₀ i. v.
(Maus)<1000 mg/kg (Ratte) 354 mg/kg

Prüfung der Klärwirkung:
Setzt bedeutend die Serumpegel der Triglyceride in Tieren mit experimenteller Hyperlipämie durch Triton®.

Gerinnungshemmende Wirkung:
USP50 U/mg
Prüfung "Kaolin-Cephalin Clotting Time" (KCCT): 7-19
Verhältnis thrombosehemmende Wirkung/gerinnungshemmende Wirkung in vitro (Yin's/KCCT): 2,5

Thrombosehemmende und gerinnungshemmende Wirksamkeit in vivo (Hund):
Verabreicht intravenös (25 IU/kg) und oral (300-15 000 U/kg) verlängert es die Thrombin-Zeit und die KCCT und schützt es vor durch Thromboplastine induzierter Thrombosis.

Thrombosehemmende Wirkung in vivo (Kaninchen):
Verabreicht intravenös in Dosis von 20 Anti Xa U/kg schützt es vor durch Thrombin induzierter Thrombose.

Es ergibt sich daher die Indikation folgender therapeutischer Anwendungen, oral oder parenteral verabreicht:

- Vorbeugung post-operativer Thromboembolien,
- Vorbeugung thrombotischer Erscheinungen im Gefolge eines thrombogenen Zustands, wie beispielsweise demjenigen, der bei fruchtbaren Frauen bei anhaltender Behandlung mit oralen Empfängnisverhütungsmitteln vom Gestagen-Typ eintritt,
- Vorbeugung venöser Thrombosen,
- Vorbeugung von Zuständen der Hyperkoagulierbarkeit,
- Korrektur der hyperdislipidämischen Zustände (Hyperdislipoproteinämien).

Claims

1. Depolymerisiertes Heparin mit niedrigem Molekulargewicht und mit nachstehenden chemisch-physikalischen Eigenschaften:

- Mittleres Molekulargewicht: zwischen 2600 und 5500 Daltons;
- Hexosamine nach Hydrolyse: 28±2%;
- Uronsäuren nach Hydrolyse: 31±4%;
- Organisches SO₄^-- nach Hydrolyse: 30±4%;
- Molare Verhältnisse Uronsäuren : Hexosamine : SO₄^--=1 : 1 : 2;
- Spezifisches Drehvermögen der wäßrigen Lösung
[α]=+40° bis +50°;
- Elektrophorese auf Celluloseacetat (Puffer Pyridin/ Essigsäure/Wasser 1 : 10 : 229) pH 4,5 und Entwicklung mit Toluidin-Blau) = ein einziges Band mit anodischer Beweglichkeit U =2,1×10^-4 cm² v^-1 sec^-1;
- amorphes, leicht hygroskopisches, elfenbeinfarbenes Pulver;
- klare oder leicht opaleszierende wäßrige Lösung;
- pH der 5%igen wäßrigen Lösung: 7 bis 8;
- metachromatische Erkennungsreaktion: Zugabe von 1 ml 2%iger Lösung des Produkts zu 1 ml einer mit 0,1 ml 1 N-Salzsäure angesäuerter 0,0025%iger Lösung von Toluidin-Blau bewirkt einen Umschlag der Farbe von blau auf blaurötlich,

erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 2.

2. Verfahren zur Herstellung des depolymerisierten Heparins gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Heparinfraktion mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 2000 und 5000 Daltons mit der gleichen Gewichtsmenge eines Schwefeltrioxid-Pyridin- oder Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplexes in alkalischem Milieu in an sich bekannter Weise umsetzt, das Reaktionsprodukt mit Methanol, Äthanol, Aceton oder Dioxan fällt, das gefällte Produkt in Wasser wieder auflöst und über einen Ionenaustauscher oder ein Molekularsieb führt.

3. Therapeutisches Präparat, insbesondere zur Vorbeugung bzw. Verhütung von thrombotischen Erscheinungen, enthaltend das Produkt nach Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil.