CH642979A5

CH642979A5 - Oligo-eteropolisaccaridi con attivita eparinosimili, procedimento per il loro ottenimento e relative composizioni terapeutiche.

Info

Publication number: CH642979A5
Application number: CH823778A
Authority: CH
Inventors: Fernando Fussi; Gianfranco Fedeli
Original assignee: Hepar Chimie Sa
Priority date: 1977-08-09
Filing date: 1978-08-02
Publication date: 1984-05-15
Also published as: DK159278B; ES472934A1; GB2002406B; FR2400037B1; FR2400037A1; GB2002406A; US4757057A; JPS6234041B2; DE2833898C2; IT1083903B; JPS5430277A; DK349678A; AU3873878A; DE2833898A1

Description

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RIVENDICAZIONI

1. Oligoeteropolisaccaride costituito da una frazione eparinica a peso molecolare compreso tra 2000 e 5000, contenente gruppi attivi, solforici, delle quantità e posizioni caratteristiche delle molecole dell'eparina.

2. Oligoeteropolisaccaride secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere proveniente da depolimerizzazione di eparina.

3. Oligoeteropolisaccaride secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere ottenuto da eparine depoli-merizzate.

4. Oligoeteropolisaccaride secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dalle seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

— Peso molecolare medio (determinato col metodo di Somogy in confronto con eparina: compreso fra 2 600 e

5 500.

5. Oligoeteropolisaccaride secondo la rivendicazione 4, caratterizzato da una reazione metacromatica di riconoscimento in cui 1 mi di soluzione di prodotto al 2% aggiunta a 1 mi di soluzione di blu di toluidina allo 0,0025 % aci-dulato con 0,1 mi di acido cloridrico IN determina un viraggio del colore dal blu al blu-rossastro.

6. Procedimento per la preparazione dell'oligoeteropo-lisaccaride secondo le rivendicazioni 1, 2 o 3, caratterizzato dal fatto che un materiale di partenza scelto tra oligomeri eparinici con peso molecolare compreso tra 2000 e 5000 e frazioni epariniche a basso peso molecolare viene trattato con un egual peso di un solfotriossido di una base organica azotata in ambiente alcalino, ed il prodotto di erazione viene precipitato con un solvente miscibile con acqua, e purificato.

7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto solfotriossido è scelto tra quelli di piridina e trimetilammina.

8. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto solvente miscibile con acqua è metanolo, etanolo, acetone, diossano.

9. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che per la purificazione il prodotto precipitato viene ripreso in soluzione acquosa e fatto passare attraverso una resina di scambio ionico od un setaccio molecolare.

— Esosamine dopo idrolisi (reazione con p-dimetilam-mino-benzaldeide: 28 rh 2%.

— Acidi uranici dopo idrolisi (reazione con carbazo-lo): 31 ± 4%.

— SO=4 organico dopo idrolisi (titolazione con naftar-zone): 30 ± 4%.

— Rapporti molari acidi uranici/esosamine/SO=4 = 1/1/2.

— Potere rotatorio specifico della soluzione acquosa [a]D20 = +40°/+50°.

— Elettroforesi su acetato di cellulosa, (tampone piri-dina/AC; acetico/acqua (1/10/229) pH 4.5 e sviluppo con blu di toluidina) = una sola banda con mobilità anodica

U = 2.1. IO-4 cm2 v_1 sec.-1.

— Polvere color avorio amorfo leggermente igroscopica.

— Soluzione acquosa limpida o leggermente opalescente.

— pH della soluzione acquosa al 5%: 7-8.

10. Composizione terapeutica, in particolare per la prevenzione di fatti trombotici, caratterizzata dal fatto di contenere quale ingrediente attivo Poligoeteropolisaccaride secondo la rivendicazione 1.

Ogetto della presente invenzione è un oligoeteropolisaccaride atto a trovare impiego terapeutico generale nella prevenzione di fatti trombotici.

Altro oggetto della presente invenzione è il processo per la preparazione di tale eteropolisaccaride.

Ulteriore oggetto della presente invenzione sono gli im-peghi terapeutici e le composizioni farmaceutiche che contengono come ingrediente attivo l'oligo-eteropolisaccaride della presente invenzione.

La trombosi è uno dei più frequenti fattori di mortalità e mobilità con caratteri spesso di invalidità permanente, nell'ambito delle malattie cardiovascolari.

Nel termine generico di trombosi si possono comprendere stati di ipercoagulabilità la cui origine può essere ricondotta a:

Nel termine generico di trombosi si possono comprende-bogenico quale ad esempio il fumo, gli stress, l'uso prolungato di antifecondativi di tipo progestinico, ecc.;

— fattori ereditari quali l'assenza di fattori inibitori della coagulazione (particolarmente l'antitrombina III);

— «fattori di rischio» che determinano uno stato tram-ancora ben chiarita come modificazioni della adesività pia-strinica ecc.;

— fattori ezioologici di origine varia e talvolta non della circolazione sanguigna quale si verifica ad esempio successivamente ad interventi chirurgici sotto narcosi.

Le conseguenze patologiche conseguenti ad imo stato «trombogenico» determinato da uno o più fattori sopra elencati possono essere:

— tromboembolie polmonari, cerebrali, coronariche, ecc.;

— trombosi delle vene profonde;

— tromboflebiti, sindromi varicose;

— disseminazione diffusa di microtrombi intravascolari.

A fronte di ima fenomenologia tanto imponente a tut-

t'oggi è possibile far ricorso a due tipi di strategia:

1) l'impiego di agenti trombolitici;

2) la prevenzione degli stati trombogenici e delle loro conseguenze. Data la gravità e la rapidità con cui si può evolvere la trombosi, è chiaro che delle due strategie di gran lunga sarebbe preferibile la seconda.

Per affrontare su basi preventive il problema della trombosi sono finora disponibili due categorie di farmaci: gli anticoagulanti orali (cumarina e derivati) e l'eparina.

Gli anticoagulanti orali (cumarina e derivati) agiscono a livello epatico bloccando i due fattori dell'emocoagula-zione; proconvertina e protrombina; essi tuttavia danno fenomeni di accumulo e pertanto mal si prestano ad una prolungata terapia ed inoltre, pur essendo degli anticoagulanti, hanno una scarsa attività antitrombica perché non agiscono su altri fattori dell'emocoagulazione particolarmente implicati nella genesi della trombosi, primi fra tutti il fattore Xa e i fattori piastrinici.

L'eparina si presenta sotto questo aspetto più vantaggiosa in quanto agisce sui vari fattori plasmatici dell'emocoagulazione e particolarmente sulla trombina, sul fattore Xa ed anche sui fattori XII, XI, IX oltre che sul fattore piastrinico denominato PF4; tutte queste azioni vanno ricondotte alla capacità specifica da parte dell'eparina di sbloccare l'inibitore, presente nel plasma, dei fattori della coagulazione sopra elencati; tale inibitore si chiama anti-trombina III e richiede appunto come cofattore per esplicare la propria azione la presenza di eparina.

Purtroppo l'eparina presenta due inconvenienti: anzitutto è attiva soltanto per via parenterale ed il suo effetto non sussiste per più di 8-12ore, per cui è difficilmente realizzabile una profilassi prolungata nel tempo che prevede 2 iniezioni giornaliere di eparina. Secondariamente l'eparina non

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ha solo un effetto antitrombotico ma anche un effetto anticoagulante in toto. Ora, se questo secondo effetto è in taluni casi favorevole, in altri casi il rischio di emorragia, se la terapia non è adattata al singolo paziente, può essere un grave inconveniente a fronte dei vantaggi, peraltro indiscutibili, di una profilassi della trombosi.

Frazioni epariniche a basso pM si incontrano in due casi:

a) nella depolimerizzazione dell'eparina con metodi chimici od enzimatici (cfr. A. Horner in «HEPARIN» - Kakkar, Thomas 1976 - e Perhin e coli. Carb. Res. 18 185 (1971);

b) nelle acque madri dei processi estrattivi di produzione dell'eparina per uso terapeutico.

Tali frazioni, che hanno pH 5.000 e contenenti quantità varabili di gruppi solforici, generalmente inferiori a quelli dell'eparina, non- hanno finora trovato utile impiego terapeutico.

È stato ora trovato che tali frazioni, se contengono i gruppi solforici nelle quantità e posizioni caratteristiche della molecola dell'eparina hanno proprietà biofarmacologiche analoghe a quelle dell'eparina e proprietà terapeutiche anche superiori.

In particolare è stato trovato che:

i) frazioni oligopolisaccaridiche provenienti dalla depolimerizzazione dell'eparina o corrispondenti ad eparine de-polimerizzate con pM compreso fra 2000 e 5000 hanno proprietà biofarmacologiche superiori a quelle dell'eparina, purché vengano opportunamente trattate per ricostituire i gruppi attivi;

ii) a differenza dell'eparina stessa le frazioni trattate sono attive anche per via orale;

iii) le frazioni trattate sono più facilmente assorbite per via percutanea rispetto all'eparina;

iiii) in particolare eparine depolimerizzate e ricostituite sono dotate di un rapporto fra attività antitrombotica e attività anticoagulante favorevole rispetto all'eparina commerciale.

Il processo di cui alla presente invenzione può essere schematizzato come segue:

materiale di partenza scelto tra oligomeri eparinici con pM compreso fra 2000 e 5000 e frazioni epariniche a basso peso molecolare viene trattato con un egual peso di solfo-triossidi di basi organiche azotate quali: piridina solfotriossido, trimetilammina solfotriossido, ecc. in ambiente alcalino.

Dopo completamento della reazione il prodotto è precipitato con solventi miscibili con acqua (etanolo, acetone, ecc.) ripreso in soluzione acquosa e purificato mediante passaggio su resine a scambio ionico o su setacci molecolari.

Dalla soluzione si ottiene il prodotto mediante precipitazione con solventi miscibili con acqua o mediante liofilizzazione.

Il prodotto così ottenuto ha le seguenti caratteristiche: identificazione:

— polvere color avorio amorfo leggermente igroscopica

— soluzione acquosa limpida o leggermente opalescente

— pH della soluzione acquosa al 5%: 7-8

— reazione metacromatica di riconoscimento: 1 mi di soluzione di prodotto al 2% aggiunta a Imi di soluzione di blu di toluidina allo 0,0025% acidulata con 0,1 mi di acido cloridrico IN determina un viraggio del colore dal blu al blu-rossastro

— potere rotatorio specifico della soluzione acquosa [a]D20 = +40°/+50°.

— eletroforesi su acetato di cellulosa, (tampone piridina/ Ac. acetico/acqua (1/10/229) pH 4,5 e sviluppo con blu di toluidina) = una sola banda con mobilità anodica U = 2.1. IO-4 cm2 v-1 sec.-1.

Altri dati chimici del prodotto dell'invenzione sono:

— Peso molecolare medio (determinato col metodo di Somogy in confronto con eparina commerciale): compreso fra 2600 e 5500 daltons.

— Esosamine dopo idrolisi (reazione con p-dimetilammi-nobenzaldeide: 28 ±2%.

— Acidi uranici dopo idrolisi (reazione con carbazolo): 31 ± 4%.

— SO=4 organico dopo idrolisi (titolazione con naftarso-ne): 30 ± 4%.

— Rapporti molari acidi uronici/esosamine/SO=4 = 1/1/2.

I seguenti esempi illustrano particolarmente il processo di preparazione dei prodotti secondo l'invenzione senza intento limitativo.

Esempio 1

g 500 di un oligopolisaccaride avente le seguenti caratteristiche analitiche fondamentali:

— pH della soluzione al 5%: 5,8

— SO=4 organico: 13,6%

— potere rotatorio [a]D20 = +48°

— pM (determinato col metodo Somogy in confronto con eparina commerciale = 4850 ± 300 dantons.

—■ esomina : 33,5%

— acid uranici: 31,8%

— attività anticoagulante: praticamente nulla sono stati miscelati in polvere con 500 g di piridina solfotriossido e 500 g di carbonato sodico anidro.

La miscela è stata dispersa in 10 lt. di acqua distillata e tenuta in agitazione per 2 ore a temperatura ambiente.

Scaduto il tempo il liquido è stato trattato con 20 lt. di metanolo. Si è formato un precipitato bianco che, separato per centrifugazione, è stato ridisciolto in 5 lt. di acqua distillata e passato su una colonna (diametro 16 cm, h 110 cm) contenente 20 lt. di Dowex Ritardion 11 A 8.

L'eluato è stato regolato a pH 6 con sodio idrato al 20% e trattato con 2 volumi di metanolo. Dopo decantazione il precipitato bianco è stato disidratato con metanolo asciugato sotto vuoto a 40°C. Resa 365 g.

II prodotto ha dimostrato le seguenti caratteristiche analitiche:

— pH della soluzione al 5 % : 6,5

— S04 organico: 31%

— potere rotatorio [a]D20 +47°

— pM (determinato col metodo di Somogy in confronto con eparina commerciale) = 5300 ± 350 unità atomica di massa

— esosamine: 28,5%

— acidi uranici: 30%

— attività anticoagulante: 36 U/mg (USP).

Esempio 2

250 g di trimetilammina solfotriossido e g 250 di sodio carbonato anidro, sono stati miscelati in polvere con g 250 di un oligopolisaccaride avente le seguenti caratteristiche analitiche fondamentali:

— pH della soluzione acquosa al 5%: 6,4

— pM (determinato col metodo di Somogy in confronto con eparina commerciale): 3400 ± 400 unità atomica di massa

— S04 organico: 11,8%

— esosamine: 34,2%

— acidi uranici: 36%

— attività anticoagulante (USP) 0,5 U/mg.

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La miscela è stata dispersa in 5 lt. di acqua distillata e tenuta sotto agitazione per 12 h a 55°C.

Scaduto il tempo la soluzione è stata passata su un letto di 20 lt di Dowex Retardion 11 A 8.

L'eluato è stato regolato a pH 6 con sodio idrato al 20% e trattato con tre volumi di acetone. Si è formato un precipitato bianco che dopo decantazione è stato disidratato con acetone e asciugato sotto vuoto a 40°C. Resa 165 g.

Il prodotto ha dimostrato le seguenti caratteristiche analitiche:

— pH della soluzione al 5%: 7,1

— potere rotatorio [a]D20 = +42°

— pM (determinato col metodo di Somogy in confronto con eparina commerciale): 3900 ± 280 unità atomica di massa

— S04 organico 28,5%

— esosamine: 29%

— acidi uranici: 30%

— attività anticoagulante: 17 U/mg (USP).

Il prodotto ottenuto secondo il procedimento sopra descritto è stato sottoposto a saggi per determinare le sue proprietà farmacologiche e le sue attività.

Test tossicologici

Nessun effetto tossico somministrato per os a ratti, topi, conigli e cavie fino alla dose di 1000 mg/kg LD50 i.p. (topo) >3000 mg/kg (ratto) —2000 mg/kg LD50 i.v. (topo) >1000 mg/kg (ratto) 354 mg/kg

Test di attività chiarificante

Abbassa significativamente i livelli sierici dei triglice-ridi in. animali con iperlipemia sperimentale da Triton.

5 Attività anticoagulante USP > 50 U/mg

Test Caolin-Chephalin clotting time (KCIT): 7-19 Rapporto attività antitrombotica/anticoagulante in vitro (Ym's/KCCT) : 2,5.

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Attività antitrombotica e anticoagulante in vivo (cane) Somministrato i.v. (25 lU/kg) e per os (300-15000 U/kg) prolunga il tempo di trombina e il KCCT, protegge da trombosi indotta da tromboplastine.

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Attività antitrombotica in vivo (coniglio)

Somministrato i.v. alla dose di 20 Anti Xa U/kg protegge da trombosi indotta da trombina.

2o Vengono pertanto indicati i seguenti possibili impieghi terapeutici per via orale o per via parenterale:

— prevenzione di tromboembolie post-operatorie,

— prevenzione di fatti trombotici susseguenti a uno stato trombogenico quale ad esempio quello che insorge in

25 donne fertili in corso di trattamento prolungato con anticoncezionali orali di tipo progestinico,

— prevenzione dalle trombosi venose,

— prevenzione dagli stati di ipercoagulabilità,

— correzione degli stati iperdislipidemici (iper-dislipoprotei-nemie).

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