JPH04502928A - ヘパリン・サッカリドおよび医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗アテローム性動脈硬化活性を有する新規なデルマタン硫酸およびヘパリン・オ リゴサツカリドヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸が有する種型の薬理活 性は、最も長いポリサツカリド鎖に含まれている特徴ある構造ブロックの存在に ほとんどいつも関係がある。−例を挙けると、ヘパリンが抗凝血活性を有するた めの重要な必要条件は、Ｄ−グルクロン酸残基と１個だけのＤ−グルコサミン　 トリ硫酸残基を有する特異的なペンタサツカリドの存在である（　Ｔｈｕｎｂｅ ｒｇ　Ｌ、他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、、第１００巻、第３９３ページ 、１９８２年：Ｃａ５ｕ　ｎ、他、Ｂｉｏｃｈ、　Ｊ、、＃！１９７巻、第５９ ９　ページ、１９８１年；　Ｃｈｏａｙ　Ｊ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ ｂｙｓ、　ｋｓ、　Ｃｏｍｍ、。

纂１１６巻、第４９２巻、１９８５年）。この配列が抗トロンビン■（λＴｉｔ ）Ｋ対する真の結合部位である。ヘパリン補因子１（ＨＣＩＩ）は、８個以上の モノサツカリドからなるオリゴサツカリドによシ活性化される。このオリゴサツ カリドはデルマタン硫酸に含まれている（　Ｔｏｌｌｅｆａｅｎ　Ｄ、　Ｍ、他 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、、　Ｃｈｅｍ、、第２６２巻８、（第１９号）、第８８５４ペ ージ、１９８６年〕。

それ故、種々のポリサツカリドの巨大構造に含まれる特異的なモノサツカリドの 配列が、特異的活性部位の活性化には不可欠なものであると考えられる。

ところで、鳶＜べきことには、デルマタン硫酸のポリサツカリド鎖の７レキシビ リテイを増大すると血漿タンパクと結合する可能性が高まシ、その結果、デルマ タン硫酸自体の薬理活性が増大することがわかった。

過ヨウ素酸塩は、隣接する２個の未置換ヒトミキシル基を有する炭素間の結合を 切断することが知られている。

デルマタン硫酸においては、ウロン酸のＣ（２）位およびＣ（３）位には、はと んどすべて、２個の未置換トランスヒドロキシル基を有するので、この炭素原子 は前記と同じ条件にある。従って、過甘つ素識塩アニオンは、Ｃ（２）−Ｃ（３ ）結合を切断し、それぞれの炭素ヲ酸化してアルデヒドとし、その結果ウロン酸 サツカリド環の切断が生じる。

Ｃ（２）位またはＣ（３）位に０８０３基を有するウロン酸成分だけが影響を受 けることなくそのまま残る。この成分はマイナ一部分である。従って、過ミウ素 酸イオンによる酸化管受けるときには、高分子鎖全体が、出発物質のデルマタン の：＋７ホーメー７１ンとは異なるコンホーメーシｌンを必要とする。Ｃ（２） 位およびＣ（３）位のアルデヒド基は、水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元し 、−級アルコールにすることができる。さもないと、これらのアルデヒド基は酸 化されることがある。とにかく、デルマタ／鎖は散性Ｗ１境に対して不安定なも のとなシ１分解を受けて低分子量オリゴマーとなる（スミス・デグラデーシ１ン 〕か、ｔたは更に酸分単位にまでなる（スキーム１参照）。

加水分解の条件を適当に調整することにより、広い分子量範囲のものｔ得ること ができる。得られるフラクシ薯ンは、イオン交換樹脂における電荷密度の増大に 基づいて選ぶことができる。

このような連続反応に、分析の目的ですでにデルマタン硫酸に適用されている（ 　Ｆｒａｎｓｓｏｎ　Ｌ、　Ａ、他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ。

Ｒｅｓ　、　、第５６巻、第５４９ページ、１９７４年）。

それに亀かかわらず、得られたオリゴマー〇構造は、すでに立証されている出発 物質のデルマタンの抗血栓活性に比して、その抗血栓活性の驚くべき増大金示さ なかった。同様に、驚くべきことには、Ｃ（２）　−Ｃ（３）が開いたデルマタ ン硫酸は、ヘパリン補因子夏に対する親和力が乏しいか、または親和力を全く有 しないことを示した。

デルマタン硫酸の抗血小板活性は、おそらくヘパリン補因子Ｉを活性化する力に よるだけではな（（ＴｏｌｌｅｆｓｅａＤ、　Ｍ、他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、第２５７巻、Ｉｇ　２１６２　ページ、１９８２年；　Ｔｏｌｌｅｆａｅ ｎ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、第２５８巻、第６７１５ページ、１９８５ 年）、またまだ知られていないファクターおよび／またはメカニズムによるもの と思われる。

デルマタン硫酸、そのフラグメントｔたはその誘導体を特許請求している特許ま たは特許出願は知られているが、それにもかかわらず、開環デルマタン硫酸の薬 理活性は今日にいたるまでまだ開示されていない。

ＥＰ−Ａ−００９７６２５号ｒｉ、抗浮腫活性および抗うっ血活性を有する、殆 んど純粋なデルマタン硫酸を特許請求している。ＥＰ−λ−０１９９０５５号オ ヨび同０２！１８９９４号は、抗血栓活性を有する純粋なデルマタン硫ＩＩ！を 特許請求している。イギリス特許第２０９８２３２号は、人為的に多硫酸化し、 化学的にデボリメリゼー７ｗ　ｙＬ、　７ｔ、薬理作用を有するコンドロイチン 硫酸￥ｒ特許請求している。

ＰＯＴ／ＥＰ１００２９１号は、デポリメリゼーシ１ンされて分子量が５〜６　 Ｋｄとなシ、抗血栓活性を有し、バイオアベイラビリティが改善された、デルマ タン硫酸からのフラクシ璽ンｔ−特許請求している。

ＢＰ−Ａ−０２０８６２５号９−１、ポリサツカリド、従っテを友低分子量（１ ０Ｋｄ以下）で、結合繊織病理学上活性を有するデルマタン硫酸（請求項６）を 本包括的に特許請求している。

日本特開昭５７−４０５０２号（ＣＡ、蕗９７巻、第２８４５９ページ、１９８ ２年）Ｆｉ、ｐｎ≦２においてＤＭＳＯ中でデボリメリゼーシ璽ンした後、Ｈ， ８０４で再硫酸化した、デルマタン硫酸からのフラクシ璽ンｔ−特許請求してい る。

フランス特許第２５８４７２８号は、全ゲルコサミノグリカンの硫酸化、従って ま皮ピリジン中におけるピリジン−スルホトリオキサイドを用いたデルマタン硫 酸のポリ硫酸化についても特許請求している。

本発明は、開環した未置換ウロン歌成分ｔ−Ｖするデルマタン硫酸に関し、ま７ ’ＣＣ（２）またはＣ（３）ＫＯ−８０ｓ基を変化させることなく有するつＣ１ ７Ｍに関する。更に本発明にまた、開環したデルマタン硫酸フラグメントに関す る。

驚くべきことＫは、前記ポリサツカリドは、抗アテローム性動脈硬化活性、抗血 栓活性および血栓溶解活性を有し、しかもこれらの活性は、このポリサツカリド が誘導された天然のデルマタン硫酸の活性の４倍以上も高い。

本発明はまた。ｘｓｏｏ〜１０００ダルト／の範囲の分子量上官するヘパリンか らのオリゴサツカリドに関する。

このようなオリゴサツカリドは、抗凝血活性を全く有しないし、抗トロンビンＩ （ＡＴＩ）Ｋ対する親和力も有しない。これらのサツカリドは、１ｎｖｓｖｏに おいて抗アテローム性動脈硬化活性を有し、経口投与によっても血小板凝集上抑 制し、また自己筋収縮をブロックする。後者の活性は、内皮下平滑筋細胞の増殖 に関係がある。

本発明はま友、きわめて低分子量のヘパリン・オリゴサツカリドの７ラグメント に関する。現在までに知られておシ、また先行技術において開示されたヘパリン ・フラクシ曹ンまたは７ラグメントのすべては、ムＴｌ親和力が高すことに関係 がある、抗凝血（人ＰＴＴ）活性および抗血栓活性が乏しいことが特徴である。

とにかく、これまで開示されたヘパリンの解縮方法はすべて、ヘパリン・フラグ メントよシ低分子量よシ低分子量で、異なる構造特性を有する７ラグメンを生成 する。

肩〈べきことには、本発明のヘパリン・オリゴサツカリドは、分子量を除ｉては ヘパリン構造を保持し、しかも実験静脈血栓症モデルにおいて抗血栓活性を示し 、更に驚くべきことには、実験動脈血栓症モデルにおいても抗血栓活性を示す。

先行技術には、多数のヘパリン解縮方法が開示されている。各方法に特有の、異 なる構造特性を有する生成物を得ることができる。この特性によ〕、既知物質と 本発明の物質と１！ｔｌＩＩ！別することができる。

アメリカ特許第４３０５４５１号（ＥＰ−Ａ−００１４１８４号に対応する。） は、１４−１８個のサツカリド単位を有し、分子量が３６００〜４８００ダルト ンであシ、亜硝ａｔ−用いる脱アミノボリメリゼー７璽ンによ）得られるオリゴ サツカリドｔ−特許請求している。このオリゴサツカリドの主成分は、ジサッカ リド　Ｌ−イズロノジルー２−０−サルフェイトーＤ−グルコサミン−Ｎ、４− ジサルフエイトであシ、硫酸化されていないイズロン酸は、非還元端から５〜５ サツカリド単位離れ次位置く存在する。このオリゴサツカリドはグルクロン＆を 含まない。

アメリカ特許第４５００５１９号および同４５５１９８号は、亜硝Ｉｎ用いてヘ パリンをデボリメリゼーシ宵ンすることによシ得られるオリゴサツカリドｔ−特 許請求している。

このオリゴサツカリドの還元端にアンヒドロマンノースからなる。このアンヒド ロマンノースは、還元するとアンヒドロマンニトールにすることができ、酸化す るとＤ−マンナン酸にすることができる。

アメリカ特許第４４０１６６２号および同４４７４７７０号は、抗血栓活性が高 く、人Ｔ　ＩＫ対する親和力が高く、特に抗Ｘ１活性がきわめて高いオリゴサツ カリドｔ−特許請求している。このオリゴサツカリドは、６個以下のモノサツカ リドからなシ、亜硝＠！またはヘパリナーゼ管用いてデボリメリゼーシ璽ンする ことにより得られる。その構造は３位にも０ＳＯｓ基を有するグルコサミンを含 む。

ＢＰ−Ａ　００４８２３１号は、４〜８個のモノサツカリドを含み、且つグルコ サミン　３−〇−硫酸が存在することおよび還元端が２，５−アンヒドロ−Ｄ− マンノースからなることを特徴とするオリゴサツカリドｔ−特許請求している。

前記特許のすべてにおいて開示されている解縮は、アミノ糖とウロン酸との間の アセタール結合にかかわシがある。従って、得られるオリゴサツカリドは、常に 整数個のジサッカリドを有する化合物である。しかも、切断が生じる場合には、 硫黄の喪失が必ず起る。

アメリカ特許ｊＩ！４２８１１０８号は、中間体へパラミノ、敗北剤の存在下酸 性媒体中での加熱によるデポリメリゼーシ璽ンおよび再硫酸化を経内するＮ−脱 硫酸によって得られる低分子ヘパリンを開示している。この方法は、ヘパリン構 造に実質上の変化をひき起し、再硫酸化によりてもこの構造はもはや修復するこ とができない。

ＥＰ−人−４０１４４号に、ヘパリンのアルカリ加水分解法を開示している。

ＢＰ−Ａ−４４２２８号においては、ヘパリンのカルボキシル基のアルキルエス テルま次はアリールエステルＫをいて必ず起り、平均分子量が２０００〜９００ Ｇダルトンのオリゴマーを生成する。

前記後者の２方法は、ともにβ−説離を経て末端ノー４．５−不飽和ウロン識を 有するオリゴマーを生成する。

アメリカ特許第４６８７７６５号は、分子量が２０００〜５ｏｏａであるＬＭＷ −Ｈの血栓溶解に関する薬理用途を特許請求している。

アメリカ特許＠４４ａ４２８８号は、６個以上のすツカリド単位（分子量ＩＪＩ ＧＯダルトン以上）からなシ、且り２．５−アンヒドロマンノース還元端がある 鎖を有するムコポリサツカリドの製造方法ｔ−特許請求している。

本発ｔｓｏヘパリンーオリゴサツカリドは、ＰＣＴ／ＥＰ／８６１００２９１号 （ＷＯ８４１０４７２？号〕に開示された方法に類似の方法によって生成される 。前記方法は、ヘパリン・デボリメリゼー７ｗンのイニシエーターである２価の 金属（たとえば、ＣｕＨ）および過酸化物（たとえば、Ｈ宜０雪）を用いるＨｏ ・フリーラジカルの生成に基づいている。（ス中−ム２参照ン本発明のヘパリン ・７ラグメントは、平均分子量が３５００ダルトンであるＣ　２１１３１夏、分 子量が約２０００であるＯＰ　Ｓ　８１　／　１　／　１　、平均分子量が１７ ００であるＣ　２ＱＢ５　ｉｆおよび分子量がｔｏｏｏであるＯＦ　５８１　／ 　１　／　２としてデザインされている。前記フラグメントは、４÷１２のサツ カリド単位からなシ、先行技術の生成物と区別する下記の構造的特性を有する。

末端のアノマー炭素に還元していて、末端七ノサッカリドに、グルコサミン　Ｎ 、！−ジ硫酸およびウロン酸２−＠酸からなる。

これは、”Ｃ，ＮＭＲスペクトルにおいて、シグナルがそれぞれ９Ｌ７ｐｐｍお よび９４４　ｐりｍに現われることから明らかである。”Ｃ−ＮＭＲの残シの部 分から、ヘパリン構造が完全に保持されていることがわかる。ゲル浸透クロマト グラフィーは、本発明の方法によって得られるヘパリン・オリゴサツカリドにり いての連続パターンが、亜硝ＩＩＩ！を用いる他の脱アミン・デボリメリゼーシ 箇ン法によって生成されるオリゴサツカリドについて得られる、６００ダルトン の不連続パターンとは異なることを明示する。従って、これらのヘパリン・オリ ゴサツカリドの化学構造は、他の特許が特許請求してｂる化学構造とは全く異な る。

本発明のオリゴサツカリドは、ヘパリンの抗凝血活性を失なっているが、動脈血 栓症および静脈血栓症の双方に対して、抗アテローム性動脈硬化活性および抗血 栓活性並びに皮下ルートおよび経口ルートによる良好なバイオアベイラビリティ および長い持続効果を有する。これらのオリゴサツカリドは、コラーゲン、リス トセチ／およびＡＤＰ　Ｋよりて誘発される血小板凝集＠　ｅｘ　ｖｉｖｏで抑 制する。これとは逆に、もとのヘパリンは血小板凝集を誘発しく　Ｂｒａｃｅ　 Ｌ、　Ｄ、、　Ｆａｒｅｅｄ　Ｊ、、　−８ｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎＴｈｒｏｍｂ 、　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔ、、第１１巻、第１９０ページ、１９８５年；　Ｅ ｉｋａ　Ｃ，、８ｃａｎｄ　Ｊ、　）ｉａｅｍａｔｏｌ、、　＄　８巻、第２４ ８ページ、１９７２年）、および／または他の薬剤によって誘発された血小板凝 集を増進する。このオリゴサツカリドは血小板粘着を減小する。前記活性のすべ てが、ＥＰ−人−００２９１／８４号について行なわれた研究に基づいては予期 することはできないものである。

これまでに得られ几薬理結果は、経口投与量が１日当ル３〜１５Ｍ９７ｋｔたは 注射投与量が１日当シ１〜５岬／榊で、本発明のオリゴサツカリドは臨床的に有 用であることｔ推定させる。

本発明はま几、抗凝血活性が乏しいかまたは抗凝血活性が全くない抗血投薬、抗 アテローム性動脈硬化薬、線雑素溶解薬として人体の治療に用いるために行なう 本発明の生成物の産業上の適用すべてに関する。この目的達成のために、本発明 の化合物を、従来の技術と添加物とを用いて、非経口投４、局所投与および経口 投与に適した医薬組成物の形１１に処方する。たとえば、非経口投与に適した処 方には、バイアルびんに充てんした無菌液がある。ま友経口投与に適した処方に は、カプセル剤、錠剤期よびシロップ剤がある。シロップ剤においては、活性成 分をリポソームまたはミセルの形態にすることもできる。更にま九、局所投与の 処方には、常用の添加剤を・含有する軟膏がある。

以下に挙ける実施例に、更に詳細に説明するものであって、本発明を限定するも のではない。

実施ｆｌ１１ ｓａｔの純粋なデルマタン硫酸〔〔α）　Ｔ　＝−ｂ　ｏｏ：ｓｏ；／ｃｏｏ− レシオ　ＬＯ４（ｉｌ　ｆａｒｍｃｏ−Ｅｄ、　Ｐｒ、。

第４３巻、第１６５ページ、１９８８年〕、分子量ＭＷｐ　＝３００００ダルト ン、抗凝血活性なし］ｔ−５００ｍ１の水に加え、これに３００ｄのα５Ｍ　Ｎ ａ工Ｏａ溶液を加える。この溶液を一晩攪拌し続ける。ｐＨを６にｍ整し、２０ ｆのＮａＢＨ４ｔ−、少しずり３時間かけて加える。酢酸をたえ間なく定期的に 加えることによってｐＨを常に７に保つ。

この反応は温度ｔ−２５℃に自動ｖＩｉ整する。次いでこの溶液を、ＩＮＨＣｊ ２用いてｐＨ５に調整し、室温でα５時間攪拌する。その後Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨｔ −用いてｐ）ｌ’ｉｉ５に調整し、この溶液ｔ−１７２容に濃縮する。これに、 ３倍容のメタノールを加える。生成した沈殿を回収し、水に再溶解した後、メタ ノールを用いて再沈殿させ、乾燥して５４７ｔの０Ｐ６１６（収率８２．５チ〕 を得る。

実施例２ 実施例１で得た６ｔの生成物を１１０−の水に加え、１８０ｄ（Ｄ　ＩＲＡ　９ ２　ＳＰ　ｖシフ　（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　）Ｌｗａｓ社製〕を用いてパーコレー トする。このパーコレート液を濃縮して少量となし、Ｓ倍容のエタノールを加え て沈殿させる。

（１２５Ｍ、（Ｌ　５　Ｍｋよび５　ＭＯＮａＣｊ　溶液を用いてカラムから溶 離してフラクシ璽ンヲ得ル。

沈殿させて乾燥し友後、下記の化合物を得る。

２０７８　０Ｍ：２．８５Ｆ（収率４Ｚ２％）；　２０７８　（：１２５Ｍ：ｃ Ｌ７１Ｆ（収、＄１１．８４３　）　；　２０７Ｂ　（１５Ｍ：（ＬＡ２Ｆ　（ 収率１０％）；　２０７８　３Ｍ：ａｌ？Ｆ（収車５％）得られた化合物の特性 を出発物質と比較して第１図に示す。

２０　ＭＨｚ　で１０諺プキープ・オペレーティングし、Ｖａｒｉａｎ　ＣＦＴ 　２　Ｇによ〕配置した第１図の”Ｃ−ＮＭ５ｘベクトルは、化合物２０７８　 ０Ｍ　（第１図Ｂ）および化合物２０７８　α５Ｍ（第１図Ｃ）において、イズ ロン酸残基のＣ（２）とＣ（３）　ｔ−’ｌ？定するシグナルおよび不可欠の鎖 デルマタン硫酸（第１図人）と比較するイズロン酸残基のＣ（１）のシグナルに 関するハイ・フィールドに対するシフトを示す。マイナー・シグナルは、多硫酸 化配列を特定する。冥際、アニオン交換樹脂から溶離し九開環デルマタン硫酸に 対するこれらのマイナー・シグナルの強さは、ＮａＣＪ濃度が増大するにつれて 増大する（第１図Ｃ）。

得られた化合物は、出発物質デルマタン硫酸（ＯＦ４３７）と比較して改善され た抗血栓活性を示す。

実施例３ １ｆの化合物２０７８　０Ｍを１００ｄの（ＬＩＭ　ＨＣｊに加え、−６０℃に Ｓ時間加熱する。仁の溶液ｔ−ＮａＯＨで中和し、凍結乾燥する。生成物ＯＰ　 ４０２が得られる。５０Ｍ）ｈで、５■プｐ−ブ・オペレーティングしてＢｒｕ ｋｅｉＡＣ２００に記録したこの化合物のｉｍＣ・ＮＭＲスペクトル（第２図） は、デグラデーシ曽ン生成物の１２の特性的シグナルのほかに、アステリスを付 した２つの他のマイナー・シグナルを示す。その中の一つは９１ｐｐｍＫあシ、 おそらくグログ口／＃Ｒのレムナｙ　）　（ｒｅｍｎａｎｔ　）によるものであ る。Ａ−１２人−２，ムー３２人−４，Ａ〜５およびＡ−６で示されるシグナル は、不確かではあるがガラクトサミン核のそれぞれの炭ｌＡヲ特定するものであ る。シグナルｌ−４は、もともとはイズロン識の４位にあり次が、今ではそのレ ムナンドに含まれている炭素を特定するものである。

アステリス會付したシグナルＱ−４は、もともとはデルマタン硫酸構造に含まれ るグルクロン酸の４位にある炭素を特定するものである。デグラデーシＷ／生成 物の構造から、実施例２で得られて開示され友化合物の構造をＭｌ！する。

実施例５ （ＯＦ　Ａ８１／１／１　） ３００ｔのヘパリンｔ２ｊの水に溶かし、これに１２１Ｆの一水利酢酸銅を加え たものを反応器にいれる。五６時間かけて１０００ｓ＋ｊの１６９６過酸化水素 を反応物に加える。

１Ｎ　水酸化ナトリウム溶液を加えることによｔ）ｐＨｔ−７，５に保ち、外部 から加熱することによシ第１反応ＦＩ＃開中温度ｔ−４４〜６６℃に高かめる。

１２０−の５０僑酢酸を用いてｐＨｔ＆５に調整し、６ｆのアスコルビンｉ１！ ｔ−加える。そのオリゴサツカリドを冷却し、５倍容のメタノールを加えて沈殿 させる。

−過して乾燥し、１９Ｚ７Ｆの生成物を得る。この生成物の平均分子量１ｊ２９ ００ダルトンである。ろ液入を集める。１９１ｔのこの中間生成物ｔ−１３０Ｇ ｓｄの、６８℃に加熱した水に溶解する。水酸化ナトリウムを用いてｐＨ’ｔｚ ５に保ちながら、４００ｄの１６慢過酸化水素溶液をｚ５時間かけて加える。冷 却後、４倍容のメタノールを加える。−過によって沈１＆を回収し、乾燥する。

１２０ｔの生成物を得る。

全固形物を水に再溶解し、Ｃｈｅｌｅｘ　１００　（Ｂｉｏ−几ａｄ社製）レジ ン・力２ム（［径４備、高さＳ　５　ｔｘ　）　ｔ−＃ｉいてパーコレートする 。このパーコレート液に４倍容のメタノールを加える。

沈ｓｒ集めて乾燥する。９９．５１　ｔのＵＰ　５８１／１／１と名付ける生成 物を得る。

ＯＦ　３８１／１／１　化合物ｏ”Ｃ−ＮＭＲｘべｐ　）　ルＨ、ヘパリン構造 が本質を変える変化を受けることなくそのまま保たれていることを示し、またイ ズロン改やアミノ糖のアノマー炭素原子を還元しているＣ凰シグナルを明示して いる。この化合物について、ｉｎ　ｖｉｖｏおよび１ｎｖｉｔｒｏでの生物学的 評価を行なう。この評価（第５表）によれば、動脈血栓症（ａｒｔｒ、　ｔｈｒ ｏｍｂ　）実験モデルおよび静脈血栓症（マｅｎ、　ｔｈｒｏｏｘｂ　）実験モ デルにお−て、この化合物は驚くべき活性を示し、バイオアベイラビリティが良 好であル、効果が長く持続する（皮下投与した場合には、処置後８時間も効果が 持続する。）本発明のオリゴサツカリドに対する皮下注射ＥＤ、・／静脈注射Ｈ Ｄ、・のレシオは、ヘパリンについてのレシオよりかなシ大である。

カオリン誘発血栓症モデルにおいて、ラットの場合（Ｈｌａｄｖｅｃ　Ｊ、、　 Ｐｈｙｉｉｏｌ、　Ｂｏｈｅｍｏｓｌｏｖａｃａ、第２４巻、第５５１〜５５４ ページ、１９７５年）は、静脈注射ＥＤ、、　、皮下注射ＥＤ、・および経口投 与ＥＤ、、は、それぞれａ５ｑ／時、ミロＭＩＩ／１ｑおよび９４Ｍｌ１輪であ ると七が判明した。生成物のバイオアベイラビリティの指標である前記の数値の レシオは、１／’７／１？である。

同一条件ては、λＤｒ−誘発凝集ｆ２０％も増すヘパリンと比較すると、ＯＰ　 ３８１／１／１は、７　ｏ　ｍｃｆ／ｄ員度で、２ｍｃｔのコラーゲンによりて 誘発される血小凝集、リストセチン−誘発血小板凝集および１４ｍｃｆ−のＡＤ Ｐによって誘発される血小板凝集を抑制する。本発明の生成は、生理食塩水と比 較すると血小板粘着を４９９６も減少しく　Ｍａｓｃｉａ　−Ｂｒｕｎｅｌｌｊ 、　Ｈｅｌｌｅｍ　Ａ、　Ｊ、　。

５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、、第７巻、第５７４ページ、１９７０ 年〕、血小板減少症を全く生じない。

前記の特性は、動脈血栓症実験モデルにおけるＯＰＳ　８１／１／１　の驚くべ き活性を明らかにするものである。

０Ｐ　３８１／１／２ 本実施例５の初めの部分で集めたｐ浪人を減圧下に１ｏｊＫ濃縮する。これに５ 倍容のアセトンを加える。

生成した沈１ｌＬｔ−濾過によシ回収し、水に再溶解（１００％）し、１００− のＣｂｅｌｅｘ　１００　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）レジ７ｆ用いてパーコレート する。完全に銅を除去し次バーコレート液を凍結乾燥する。１５　ｆ　ＯＯＰ　 ５１８／１／２　ｔ−得る。

化合物ＯＦ　３８１／１／２の”Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、きわめて低分子量の 生成物のシグナル特有のディスバージｌンを示す。しかも更に、アミノ糖および ウロン酸の還元アノマー炭素を特定するシグナルが、きわめて明瞭に現われてい る。

ヘパリンに共通の構造（これｒｉ特に、スルファミノのシグナルとＣ−硫酸のシ グナルによって立証されている。）は、そのまま保持されている。

β−７ノマー炭素を特定するシグナルの存在はまた、アノマー炭素の領域におい ても明らかである。この存在は、概して高分子量を有するヘパリン中に隠蔽され ている。

実施例６ （Ｃ２Ｑ８５　） ゲル濾過カラムによる７２クシｌネ一７ｗン笑施ｆＩＩ５で得几、５ｆの生成物 ＯＦ　３８１／１／１を５０ｄｆ）　（Ｈ５Ｍ　ＮａＣｊ溶液に加え、Ｕｌ　ｔ ｒｏｇｅｌ　Ａｃ、　Ａ　２０２（ＬＫＢ社製社製シカラム径５工、高さ１００ ｃｆｎ）を用いて、２１１ｔ／分でパーコレートする。４２０　ｄの効力のない 部分は棄て、各７ラクシＷン１０ｄｆ＠収する。初めの３０７ツクシ、ｙＦｉ棄 てる。フラクシ叢７５１〜４０４（７４０ｄ）を合わせる（１）。他の１１２の フラクシ曹ンをそれぞれプールする（ト）。

この２グループのフラクシ１７を濃縮して少量となし、Ｔｒｉａｓｚｃｒｙｌ　 ＧＦ　ｌ　５　Ｍ　ｆ用いてソルト・オフして、凍結乾燥する。生成物Ｃ２０８ ５Ｉ　（五ＩＩＦ）およびＣ２０８５１（α４７１）ｆ得る。その分子量プロフ ィルを第５図Ｃに示す。例として、ＢＰ−Ａ−１４１８４号の実施例１に従い、 亜硝酸音用いてデボリメリゼーシｌンすることによって得られる生成物のプロフ ィル〔第５図ａ〕およびアメリカ特許第４５００５１９号に従い、亜硝酸を用い てデポリメリゼーシ璽ンすることによって得られる生成物のプロフィル（第Ｓ図 ｂ）１−示す。整数はジサッカリド単位の数を意味する。

実施例７ （Ｃ２０８１１） 実施例６０′ｊ５法と同様の方法によるが、但し最初の８１の７５クシ嘗ンだけ を集めて、化合＠Ｃ２０８１１（１−０４１）を得る。

Ｒ＝Ｈ；Ｃ，Ｈ，Ｃｏ、ＣＭ、ｃ。

ヘパリン：ｍ＝４０＄　ｎ＝３１１１９Ｇｏ＝１０　ｓ　ｐ　＝２０９１ オリゴサツカリド： 〜１７００ダルトンの分子量については、ジサツカリドの統計的アバンダンス（ ａｂｕｎｄｓｉｎｃｅ　）は下記のとおシである。

ａ”：ｔ４　ｂ’：：１　ｃ’：α３５　ｄ′″：［Ｌ７Ｆｉｇ、ｌ　１３ｃ、 ＮＭＲ５ｐｅｃｔｒａ　（２０ＭＨｚ）１８０　１４０　１００　６０　２０　 ｐｐｍ補正書の写しく翻訳文）提出書 く特許法第１８４条の８） 平成３年４月１８８ １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＥＰ　８９１０１２１４２、発明の名称　抗アテ ローム性動脈硬化活性を有する新規なデルＨａおよびヘパリン・オリゴサツカリ ド３、特許出願人 住所　イタリア国　４１０４０　（モデナ）　コル口　ヴイア　バチノツチ１　 −名称　オボクリン　エツセ　ピ　ア　ラボラトリオ　ファルマコビオロジコ代 表者　ジウスティ　ジオルジオ 国籍　イタリア国 ４、代理人 住所　〒１７０東京都豊島区東池袋１丁目２８番１号グローリア初穂池袋　７０ ８号 ５、補正書の提出年月日　１９９０年１０月１２日６、添付書類の目録 補正書の写しく翻訳文） 浄否（トーＬ−二次史なし） 請求の範囲 ｔ　下記の一般式で表わされるデルマタン硫酸フラグメント 式中、Ａは、ピラノース環が２位と３位にあるＲ素の間でＲ環し次、 で表わされる構造を有する、−硫酸化されていないりｎン駿であってもよいし、 また、 式 で表わされる構造を有するＬ−イズロン！！２−硫駿であってもよい。

ここにおいて、伽）と比較すると、（ａ）のアパンダンス（ａｂｕｎｄａｎｃｅ 　）は９０％以上であシ、（ｂ）　ｄ　（ａ）　色比較する七１０−以下である 。

ｍは１ないし６０の範囲の整数である。

ｚｓｏ；７ｃｏｏ″″レシオが０．９ないしｔ４である請求項ＩＫ記載のデルマ タン硫酸７ラクシ箇ン。

Ａ　２０００ダルトンまでの分子量を有するデルマタン硫酸７ラクシ箇ン。

デルマタンまたはそのフラクシ璽ンと過ヨウ素酸塩イオンのような酸化剤との反 応； Ｃ（２）　−Ｃ（３）位にあるアルデヒド基を可能な限〕還元してヒドロキシメ チル基に変えること； 得られた生成物全アニオン交換樹脂によ〕可能な限シ７ラクシ璽ネーシ璽ンを行 ない、電子密度が異なるフラグメントを分離すること： 可能な限シの酸加水分解全行ない、所望の分子量を有するオリゴサツカリド全生 成すること からなる、請求項１〜Ｓのいずれかに記載のデルマタン硫酸７ラクシ箇ンの製造 方法。

五　ヘパリンのラジカル・デポリメリゼーク曹ンにより得ることができる、平均 ４〜１２個のモノサツカリドを含むヘパリン・オリゴサツカリド。

＆　イズロン酸　２−〇−硫酸またはゲルコサきン　Ｎ。

６−ジ硫酸からなル、還元アノマー炭素全盲する末端基を含む、請求項５に記載 のオリゴサツカリド。

２　分子量が！！５００〜１０００／ルトンであり、ＳＯ；／ＣＯＯ−レシオが 出発物質のヘパリンのそれと必ず同じである請求項５および６のいずれかに記載 のヘパリン・オリゴサツカリド。

ａ　抗Ｘａ活性がヘパリンのそれよシロ０倍も低く、動脈血栓症においてさえ抗 血栓活性が高く、抗血小板凝集活性が高く、皮下ルートおよび経口ルートによる バイオアベイラビリティが高い、請求項５，６および７のいずれかに記載のヘパ リン・オリゴサツカリド。

２　活性成分として、請求項１〜Ｓのいずれかに記載のデルマタン硫酸７ラクシ 曹ンおよび７ラグメントを有し、抗血栓活性、血栓溶解活性および抗アテローム 性動脈硬化活性が高い医薬組成物。

１α　活性成分として、請求項５〜８のいずれかに記載のヘパリン・オリゴサツ カリドを含有し、抗血栓活性、血栓溶解活性および抗アテローム性動脈硬化活性 を有する医薬組成物。

１ｔ　滅菌注射液剤奄しくに滅菌注射懸濁液剤、カプセル剤、錠剤、活性成分が リポソームもしくはミセルのいずれかの形態とすることがあるシｑツブ剤または 軟膏剤もしくは臂薬剤の形態とした非経口投与用、経口投与用および局所投与用 の、請求項９１友は１０に記載の医薬組成物。

手続補正書（方幻 ２、発明の名称　抗アテローム性動脈硬化活性を有する新規なデルマタン硫酸お 呼びヘパリン・オリゴサツカリド ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　イタリアｌ］　４１０４０　（モデナ）　コル口　ヴイアバチノッティ　 ３ 名称　オボクリン　エッセ　ビ　ア　ラボラトリオファルマコビオロジコ ４、代理人 住所　〒１７０東京都豊島区東池袋１丁目２８番１号グローリア初穂池袋７０８ 号 ５、補正命令の日付　自発 ６、補正により増加する発明の数　なし

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．硫酸化されていないウロン酸のＣ（２）−Ｃ（３）結合の酸化切断の条件下 、過ヨウ素酸塩イオンを用いて生成することができる開環鎖デルマタン硫酸フラ クション。
2. ２．硫酸化されていないウロン酸のＣ（２）−Ｃ（３）結合の切断反応によって 得られるアルデヒド基を還元してヒドロキシメチル基にした、請求項１に記載の フラクション。
3. ３．アニオン交換樹脂を用い、電解質溶液により更にフラクショネーションし、 ＳＯ■／ＣＯＯ−レシオが０．９ないし１．４である、請求項１および２のいず れかに記載のデルマタン硫酸ブラウシュン。
4. ４．酸性媒体またはアルカリ性媒体中において、分子量が２０００ダルトンのフ ラグメントに加水分解した、請求項１，２および３のいずれかに記載のフラクシ ョン。
5. ５． デルマタンまたはそのフラクションと過ヨウ素酸塩イオンのような酸化剤との反 応； Ｃ（２）−Ｃ（３）位にあるアルデヒド基を可能な限り還元してヒドロキシメチ ル基に変えること； 得られた生成物をアニオン交換樹脂により可能な限りフラクショネーションを行 ない、電子密度が異なるフラグメントを分離すること； 可能な限りの酸加水分解を行ない、所望の分子量を有するオリゴサッカリドを生 成すること からなる、請求項１，２，３および４のいずれかに記載のデルマタン硫酸フラク ションの製造方法。
6. ６．ヘパリンのラジカル・デポリメリゼーションにより得ることができる、平均 ４〜１２個のモノサッカリドを含むヘパリン・オリゴサッカリド。
7. ７．イズロン酸２−Ｏ−硫酸またはグルコサミンＮ，６−ジ硫酸からなり、還元 アノマー炭素を有する末端基を含む、請求項６に記載のオリゴサッカリド。
8. ８．分子量が３５００〜１０００ダルトンであり、ＳＯ３／ＣＯＯ−レシオが出 発物質のヘパリンのそれと必ず同じである請求項６および７のいずれかに記載の ヘパリン・オリゴサッカリド。
9. ９．抗Ｘａ活性がヘパリンのそれより６０倍も低く、動脈血栓症においてさえ抗 血栓活性が高く、抗血小板凝集活性が高く、皮下ルートおよび経口ルートによる バイオアベイラビリティが高い、請求項６，７および８のいずれかに記載のヘパ リン・オリゴサッカリド。
10. １０．活性成分として、請求項１ないし４のいずれかに記載のデルマタン硫酸フ ラクションおよびフラグメントを含有し、抗血栓活性、血栓溶解活性および抗ア テローム性動脈硬化活性が高い医薬組成物。
11. １１．活性成分として、請求項６ないし９のいずれかに記載のヘパリン・オリゴ サッカリドを含有し、抗血栓活性、血栓溶解活性および抗アテローム性動脈硬化 活性を有する医薬組成物。
12. １２．滅菌注射液剤もしくは目津菌注射懸濁液剤、カブセル剤、錠剤、活性成分 がリボソームもしくはミセルのいずれかの形態とすることがあるシロップ剤また は軟膏剤もしくは膏薬剤の形態とした非経口投与用、経口投与用および局所投与 用の、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。