DD251355A5

DD251355A5 - Verfahren zur herstellung von oligosacchariden

Info

Publication number: DD251355A5
Application number: DD86290192A
Authority: DD
Inventors: Giuseppe Mascellani
Original assignee: ��@�K@�K@�Kk��
Priority date: 1985-05-17
Filing date: 1986-05-13
Publication date: 1987-11-11
Also published as: HUT46028A; ATE55396T1; AU5953386A; IT1214609B; HU203565B; US4973580A; CA1283098C; JPS63500184A; EP0221977A1; JP2510177B2; CN1009096B; IL78772A; EP0221977B1; ZA863651B; AR240461A1; AU601910B2; IL78772A0; CN86104301A; WO1986006729A1; DK173804B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligosacchariden durch kontrollierte chemische Depolymerisation von natuerlichen Polysacchariden wie Heparinen, Heparansulfaten, Dermatansulfaten, Chondroitinsulfaten, Hyaluronsaeure fuer die Anwendung als Arzneimittel. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens, mit dem auf einfache Weise im grosstechnischen Massstab Polysaccharide mit mittlerer relativer Molekuelmasse hergestellt werden koennen. Erfindungsgemaess werden Oligosaccharide mit mittlerer relativer Molekuelmasse hergestellt durch eine radikalische Reaktion in einer waessrigen Loesung bei einer Temperatur zwischen 20C und 70C in Anwesenheit eines aus der aus Cu , Fe , Cr , Cr2O7 bestehenden Gruppe ausgewaehlten Katalysators. Das Radikal wird in einer waessrigen Loesung aus einer aus der aus Peressigsaeure, 3-Chlorperbenzoesaeure, Wasserstoffperoxid, Cumenhydroperoxid, Natriumpersulfat, Benzoylperoxid bestehenden Gruppe ausgewaehlten Peroxidverbindung erzeugt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligosacchariden durch kontrollierte chemische Depolymerisation von natürlichen Polysacchariden wie Heparinen, Heparansulfaten, Dermatansulfaten, Chondroitinsulfaten, Hyaluronsäure. Die Erfindung betrifft auch die entstehenden neuen Produkte sowie entsprechende pharmazeutische Zusammensetzungen mit ihnen. Die entstehenden Erzeugnisse besitzen ein hohes Xa-Faktor-Inhibierungsvermögen, eine hohe antithrombotische Wirksamkeit, geringe oder keine antikoagulierende Wirkung, hohe fibrinolytische Wirksamkeit sowie entzündungshemmende Wirkung.

Die Produkte weisen auch eine gute Bioverfügbarkeit nach oraler Verabreichung auf, was auf die verringerte relative Molekülmasse der Oligomere im Vergleich mit den Ausgangspolysacchariden zurückzuführen ist.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Heparin mit einer niedrigen relativen Molekülmasse, d.h. im Bereich zwischen 3500 und 8000 Dalton, besitzt eine merkliche antithrombotische Wirksamkeit, verbunden mit keiner oder geringfügiger antikoagulierender Wirkung.

Es wurde außerdem berichtet, daß Fragmente von Dermatansulfat mit einem Gehalt von mindestens 12 bis 14 Zuckerresten, die durch Abbau mit Perjodsäure (Tollefsen, DM. Nouv. Rev. Fr. Haematol., 26,233,1984) und Fraktionierung auf einer Affinitätssäule entstanden sind, mit einer merklichen Wirksamkeit bezüglich des Kofaktors Il ausgestattet sind, wobei diese Wirksamkeit höher ist als die von nichtfraktioniertem Dermatansulfat. Andererseits sind keine Depolymerisationsprodukte anderer Chondroitin- und Heparinsulfate bekannt.

In der Literatur werden verschiedene Verfahren für die Depolymerisation von natürlichem Heparin beschrieben. Ein Verfahren, das sich für die Gewinnung von Verbindungen mit einer niedrigen relativen Molekülmasse eignet, besteht in der desaminierenden Hydrolyse von Heparin mit salpetriger Säure in einer verdünnten Lösung. Die entstehenden Verbindungen sind gekennzeichnet durch einen endständigen Rest, bestehend aus 2,5-Anhydromannose (I):

OH₂OR

CHO

R = ^H>

SO₃H

(US-Patent Nr.4.438.261; WO 82/03627, veröffentlicht am 28.10.1982; Europäische Patentanmeldung Nr.0048231)

Es wurde ein Verfahren zur alkalischen Hydrolyse von Heparin (Europ. Patentanmeldung Nr.0040144) oder Heparinalkyl-oder -arylestem (Europ. Patentanmeldung Nr.0044228) beschrieben, welches durch -Eliminierung zu Oligomeren mit einer mittleren relativen MolekiJImasse von 2000 bis 9000 Dalton führt, die den ungesättigten Zucker (II) als endständige Gruppe aufweisen:

CH₀OSOoH

0R^f

IiHSO₃H

R' » H, SO₃H ^

"^Ε__ϋ_5Ρ°^Η-

Die Ausbeuten sind bei diesem Verfahren sehr niedrig.

Ein anderes Depolymerisationsverfahren besteht in der enzymatischen Hydrolyse von Heparin durch Heparinase, in sehr verdünnten Lösungen und mit einer sehr niedrigen Ausbeute, mit der Bildung von Zucker (III) und Glucosamin in einer Halbacetalform (IV)

(COOH)

OH

(III)

(IV)

R = H, SO₃H

als endständige Gruppen (Europ. Patentanmeldung Nr. 0064452; J. Biol.Chem., 257,7310,1982).

Es wurden auch Verfahren zur Heparindepolymerisation beschrieben, die auf dem Einsatz von Oxydationsmitteln wie alkalischen Perjodaten basieren, welche die Bindung zwischen den proximalen C₂-C₃-Hydroxylgruppen der nichtsulfatierten Uronsäuren mit anschließender Labilisierung der Glucosidbindung oxidieren (Casu, B., „Structure and Biological Activity of Heparin". Advances in Carbohydr. Chem. Biochem. Bd.43,1985, S.51-134, Acad. Press).

Andere Verfahren basieren auf der kombinierten Wirkung von Wasserstoffperoxid und saurem pH bei hoherTemperatur(125°C) unter Druck auf Heparin. Eine Depolymerisation mit folglicher Veränderung und potentieller Schwächung der Wirksamkeit der Oligomere findet statt (Europ. Patentanmeldung Nr.0101141, veröffentlicht am 22.8.1984).

Andere Verfahren basieren auf der Säuredepolymerisation durch Schwefelsäure und einer parallelen oder nachfolgenden

Resulfatierung mit einem Chlorsulfonsäuregemisch (Nagasawa, K. et al., Arhiv. Biochem. Biophys., 150,451,1972; Franz.

Patentanmeldung Nr. 2.538.404).

All diese im Labormaßstab beschriebenen Verfahren sind gekennzeichnet durch niedrige Ausbeuten und schlechte

Reproduzierbarkeit, was wesentlich für die Erweiterung auf einen vorindustriellen oder industriellen Maßstab ist.

Die italienische Patentanmeldung Nr.40021 A/83, die der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0121067 entspricht, beschreibt ein Verfahren, bei dem gleichzeitig Wasserstoffperoxid, Askorbinsäure und Kupferacetat für die Gewinnung von Oligosacchariden mit einer geeigneten relativen Molekülmasse eingesetzt werden.

Die genannte Erfindung zieht recht lange Reaktionszeiten, d. h. bis zu 24 bis 48 Stunden, und stark verdünnte Heparinlösungen mit entsprechenden niedrigen Ausbeuten in Betracht. Außerdem sind die Depolymerisationsprodukte mit Askorbinsäureabbauprodukten verunreinigt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von Oligosacchariden, das Polysaccharide mit mittlerer relativer Molekülmasse liefert und das im großtechnischen Maßstab mit kurzer Reaktionszeit ausführbar ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Reaktionsverbindungen hierfür aufzufinden.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß jedes Polysaccharid von der Art der Heparine, Heparansulfate, Dermatansulfate, Chodroitinsulfate, Hyaluronsäure in einer wäßrigen Lösung bei Konzentrationen selbst über 10 bis 15% bei Temperaturen zwischen 20°C und 7O⁰C innerhalb weniger Stunden durch eine radikalische Reaktion depolymerisiert werden kann, die durch ein Radikal, z. B. das OH-Radikal, eingeleitet wird, welches in einer wäßrigen Lösung aus einer Persäure oder einem Peroxid wie Peroxyessigsäure, Wasserstoffperoxid, 3-Chlorperbenzoesäure Cumenhydroperoxid, Natriumpersulfat, Benzoylperoxid, in Anwesenheiteines Katalysators in einer Konzentration zwischen 0,1 Mol und 0,001 Mol, bestehend aus einem Metall wie Cu⁺⁺, Fe⁺⁺, Cr⁺⁺⁺ oder einem Anhydrid wie Cr₂O₇"", erzeugt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in der Depolymerisation eines Polysaccharids in einer 10 bis 20%igen wäßrigen Lösung bei einer Temperatur im Bereich zwischen 30⁰C und 70⁰C durch ein Peroxid oder durch eine Persäure wie Peroxyessigsäure, Wasserstoffperoxid, 3-Chlorperbenzoesäure, Natriumpersulfat, Cumylhydroperoxid eingeleitete radikalische Reaktion in Anwesenheit katalytischer Mengen eines Metalls wie Cu⁺⁺ oder Fe⁺⁺, oder Cr⁺⁺⁺ oder Cr₂O₇ usw. in einer Konzentration zwischen 0,001 und 0,1 Mol.

Das Depolymerisationsprodukt wird gewöhnlich im festen Zustand durch Ausfällen mit Lösungsmitteln oder quaternären Ammoniumbasen von der Reaktionslösung getrennt.

Die entstehenden Oligosaccharide werden in der Regel mit Alkalimetallen wie Natrium, Kalium oder Lithium oder mit Erdalkalimetallen wie Calcium oder Magnesium in Salze überführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet die nachstehend aufgeführten Vorteile gegenüber den bereits bekannten Verfahren:

— Schnelligkeit der Ausführung,

— Gewinnung von Polysacchariden mit der geforderten mittleren relativen Molekülmasse,

— Möglichkeit der großtechnischen Anwendung, bei hohen Konzentrationen von zu depolymerisierendem Biopolymer, so daß keine nachfolgenden und aufwendigen Konzentrations- und Reinigungsprozesse für die Gewinnung der depolymerisierten Produkte erforderlich sind.

Die entstehenden Oligosaccharide sind im wesentlichen rein, weil die Peroxidumwandlungsprodukte leicht entfernt werden können, und die Katalysatormetalle können durch EDTA oder durch Sequestierharze wie z. B. diejenigen, welche eine funktionelle Iminoacetessigsäuregruppe tragen, maskiert werden.

Andere als z. B. bei dem Polymerisationsverfahren auf der Basis der Verwendung von Askorbinsäure, die wiederum Dehydroaskorbin-, Diketoglutar-, Threonin- und Oxalsäure hervorbringt (Niedermeier, W. et al., B.B. A., 141,336,1967), die alle mögliche Verunreinigungssubstanzen der depolymerisierten Polysaccharide sind, enthält die Reaktionsmasse keine anderen Verunreinigungsstoffe.

Tatsächlich können die bei dem erfindungsgemäßen Depolymerisationsverfahren gewonnenen Produkte mit geringer relativer Molekülmasse im wesentlichen in Form von Natriumsalzen bei einem pH-Wert nahe der Neutralität mit einem inaktiven Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Aceton, Dioxan direkt von dem Reaktionsmedium abgetrennt werden. Das Produkt kann durch doppelte Fällung oder durch Auflösung, Elution auf einer Säule eines geeigneten Harzes und Umfällung mit Methanol oder Ethanol gereinigt werden.

Die erfindungsgemäßen Produkte können auch mit Kalium, Lithium, Calcium, Barium oder Magnesium oder mit organischen Basen wie mittels oder langkettigen Aminen in ein Salz überführt werden.

Für die Salzbildung mit anderen Kationen als Natrium besteht das übliche Verfahren in der Freisetzung von Heparinsäure oder der dem Dermatansulfat oder Heparansulfat entsprechenden Säuren auf einer Kationenaustauschersäule und der anschließenden Salzbildung mit dem gewünschten Kation.

Die erfindungsgemäße Oligosaccharide weisen hauptsächlich die reduzierenden endständigen Gruppen des C-i-Kohlenstoffs von Typ V und Vl auf.

CH₂OR₂

(GOOH)J—-o-

(V)

(VI)

Pur Heparin und Heparansulfat

Für Dermatansulfat

R = SO₃H, Ac	SO₃H
R-i = Rp ⁼ Ro ⁼ Hj R.= Uronsäure
Rc= Aminozucker
R = Ac
R₁= R₂ = H R₃= Uronsäure
R₄= SO₃H.

-= 4,0 sulfatiertes N-acetyliertes Galactosamin

ebenso wie die natürlichen Oligomere von Heparin und der anderen, durch chromatografische Fraktionierung oder durch selektive Fällung gewonnenen Polysaccharide.

Die endständigen Gruppen lassen sich jedoch leicht zu Aldonaten oxidieren, zum Beispiel mit NaJO, oder zu Alkoholen

reduzieren, zum Beispiel mit NaBH₄.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird der für die biologische Wirksamkeit wichtige Gehalt an "SO₃H-Gruppen nicht verändert, wie es aus dem Verhältnis "SOsH eq./~COOH eq., das für die Depolymerisationsprodukte im Vergleich mit den Ausgangsprodukten aufgestellt wurde, hervorgeht.

Das Verfahren ist außerdem dadurch gekennzeichnet, daß es unter Kontrolle gehalten und bei dem gewünschten Depolymerisationsgrad gestoppt werden kann, was von wesentlichem Vorteil ist, wie der Fachmann erkennen wird.

Das Verfahren wird kontrolliert, indem die mittlere relative Molekülmasse oder die biologische Wirksamkeit eines Oligomers, die in direkter Beziehung zu seiner mittleren relativen Molekülmasse steht, wie zum Beispiel die APTT (Activated Partial Thromboplastin Time = aktivierte partielle Thromboplastinzeit) oder aktivierte Anti-Faktor-X-Wirksamkeit, eingeschätzt wird.

Das Verfahren kann auf Wunsch gestoppt werden, indem der pH-Wert der Reaktion oder die Temperatur gesenkt wird oder die Erzeugung von Radikalen beendet wird oder durch Inhibierung mit einem bekannten Inhibitor wie SOD, Katalyse, p-

Oxybenzoaten.

Die erfindungsgemäßen Produkte weisen eine mittlere relative Molekülmasse zwischen 2000 und 700ODaItOn auf.

Die Erfindung betrifftauch alle mit der Verwendung der erfindungsgemäßen Produkte im industriellen Maßstab für den Einsatz für therapeutische Anwendungen beim Menschen wie antithrombotische, fibrinolytische und entzündungshemmende Mittel mit geringer oder keiner antikoagulierender Wirksamkeit verbundenen Aspekte, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen durch herkömmliche Verfahren und Trägerstoffe als pharmazeutische Zusammensetzungen für die parenterale, topische und

orale Verabreichung formuliert werden.

Beispiele von Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen in Ampullen enthaltene sterile

Lösungen.

Beispiele für Formulierungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, umfassen Kapseln, Tabletten und Sirups, bei denen der Wirkstoff auch mit Trägerstoffen in Form von Liposomen und Mizellen formuliert sein kann.

Beispiele für topische Formulierungen sind Salben, die die im Fachgebiet bekannten üblichen Salbengrundlagen enthalten.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert werden, die jedoch keinerlei Einschränkung des Umfanges der Erfindung bedeuten.

Beispiel 1

305g HFA116-7 Rohheparin werden zusammen mit 300g Natriumchlorid und 300g Natriumacetatdihydrat in ein Reaktionsgefäß

mit 21 Wasser gegossen.

Sobald die Auflösung stattgefunden hat, wird ein Salz, entsprechend 4,35g zweiwertigem, in 300ml Wasser gelöstem Kupfer, zugesetzt. Eine Lösung von 1000ml 15%igem Wasserstoffperoxid und Normallösung von NaOH werden separat unter ständigem Rühren zugetropft, um den pH-Wert im Verlaufe der Reak?^:on bei 7,5 zu halten. Tropfen und Rühren werden zwei Stunden lang fortgesetzt, die Temperatur der Reaktionsmasse wird bei 45°C bis 6O⁰C gehalten. Die Reaktionsmasse wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 17 g Dinatriumethylendiamintetraacetatdihydrat (EDTA) versetzt; der pH-Wert wird mit

Essigsäure auf 5,9 eingestellt.

Depolymerisiertes Heparin wird mit 7,91 Methanol ausgefällt. Das auf einem Filter gesammelte Präzipitat wird wieder in 4I Wasser gelöst und mit 75g Natriumacetatmonohydrat und 4g EDTA versetzt. Die entstehende, mit Essigsäure auf pH 5,8 eingestellte Lösung wird mit8! Methanol behandelt, das gebildete Präzipitat wird durch Filtration gesammelt, mit Methanol und

Aceton gewaschen und getrocknet.

Es werden 255g (Ausbeute 83,6%) eines weißen Heparins (OP 85/0201) mit niedriger relativer Molekülmasse gewonnen, welches folgende Merkmale aufweist: mittlere relative Molekülmasse: 4200 (Hilbom, J. C. und Anastassiadis, Anal. Biochem. 39,

88,1971);

U-APTT 33,19 (Basu, D. et al., N. Engl. J. M. 287,324,1972); U-aXa 81,7 (Teien, A. N. at al., Thromb, Res., 8,413,1976). Das Ausgangsrohheparin hatte die folgenden Merkmale: 13,700; 170,7; 166,8.

Beispiel 2

20Og 116,7 HFA Heparin werden zusammen mit 200g Natriumacetattrihydrat und 200g Natriumchlorid in ein thermostatisiertes Reaktionsgefäß gegeben. 2100ml einer 0,02molaren Lösung eines Kupfer(ll)-salzes werden zugesetzt. Wenn die Auflösung stattgefunden hat, werden 500ml 19%iges Wasserstoffperoxid und n-NaOH getrennt in einem Zeitabstand von 15 Minuten zugetropft, um den pH-Wert der Reaktionsmasse bei 7,2 zu halten. Im inneren Reaktionsgefäß liegt die Temperatur zwischen 35⁰C und 50⁰C.

30g Natrium-EDTA werden 60 Minuten nach Reaktionsbeginn zugesetzt; die Lösung wird mit Essigsäure auf pH 5,9 eingestellt, und das Produkt wird mit 2 Volumen MetOH ausgefällt.

Das Präzipitatwird mit Aceton gewaschen und sofort (ohne Trocknen) in 21 Wasser wieder aufgelöst. 5 g EDTA und 50g Natriumacetat werden zugesetzt. Der pH-Wert wird auf 6 eingestellt und 2,5 Volumen MeOH werden unter Rühren zugesetzt.

Nach Filtration, Anhydrisierung mit Aceton und Trocknen werden 183g Rohprodukt, Kodierung OPS4/2610, in einer Ausbeute von 91,5% gewonnen, welches die in Tabelle 1 aufgeführten Merkmale aufweist.

Tabelle 1

Produkt	Wirksamkeit in vitro	U-aXa	Wirksamkeit in vivo	Relative Mole	S	Uronsäure	; eq. "SO₃H
		166,8	* Ant i. v. act.	kül masse	%	%	eq. "COOh
	U-APTT	72,3	135	13700	10,6	26,7
Hep 116,7	170,7	127	3480	11,0	26,1	2,39
Es.1 OP84/2610	32,1	2,56

* antithrombotische Wirksamkeit in vivo

Der Kupfergehalt beträgt 3,93 ppm (Teile pro Million).

Die antithrombotische Wirksamkeit (Ant. act.) wurde in vivo nach der Methode von Revers, S; Mussoni, L.; Donati, M. B.; De Gaetano, G.,Thromb. Res. 18,699,1980, nach intravenöser Verabreichung eingeschätzt. Schwefel und Uronsäure wurden potentiometrisch nach Entfernung einer möglichen anorganischen Azidität durch Chromatografie auf einer Anionensäule (OH~-Form), und Freisetzung von Heparinsäure durch Überführung auf eine Kationensäule (H⁺) gemessen. Das Verhältnis zwischen den beiden Titrationskurvenkrümmungen entspricht "SO₃H eq./~COOH eq.

Bioverfügbarkeit nach oraler Verabreichung

Wenn das Produkt auf intrailealem Wege durch eine geeignete Trägersubstanz, bestehend aus einer Lipidphase und einem geeigneten oberflächenaktiven Mittel zur Gewährleistung eines stabilen Mizellensystems (Stanzani, L.; Mascellani, G.; Corbelli,

G. P.; Bianchini, P., J. Brit. Pharmacol.,33,783,1981), im Venenthrombosemodell nach Reyers et al.,verabreicht wird, erhält man die nachstehend aufgeführten ED 50 für die Halbierung der Thrombenmassen.

HFA 116,7 = 7,5 mg/kg

OP 84/2610 = 3,25 mg/kg. -

Beispiel 3

In ein Reaktionsgefäß, das mit einem temperierten Bad, Rührvorrichtung, graduierten Tropftrichtem und Thermometer ausgerüstet ist, werden 1 kg HFA15 Rohheparin, 0,495kg Natriumchlorid und 1 kg Natriumacetat gebracht und mit 101 Wasser gelöst. Anschließend werden 46g in 11 Wasser gelöstes Kupferacetatmonohydrat zugesetzt, die Temperatur wird auf 35°C eingestellt, und über einen Zeitraum von 2,5 Stunden werden eine Normallösung von NaOH zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 und eine 9%ige Wasserstoffperoxidlösung getrennt hinzugegeben. Die Innentemperatur wird parallel dazu so kontrolliert, daß ein Bereich von 35°C bis 60⁰C gestattet wird.

Im Verlaufe der Reaktion werden in regelmäßigen Zeitabständen Proben zur Kontrolle der die in-vitro-Wirksamkeit (U-APTT und U-aXa) und die mittlere relative Molekülmasse betreffenden Parameter entnommen.

Am Ende der Reaktion werden 90g EDTA zugesetzt, der pH-Wert wird mit 30%iger Essigsäure auf 5,9 eingestellt, und 44I Methanol werden der Reaktionsmasse zugesetzt.

Das gebildete Präzipitatwird durch Filtration gesammelt, mit Methanol gewaschen und in 101 Wasser wieder gelöst.

Die entstehende Lösung wird mit 350g Natriumacetat, 20g EDTA und, nach Einstellen des pH-Wertes auf 5,8, mit 201 Methanol versetzt. Das gebildete Präzipitat wird gesammelt, mit Methanol und Aceton gewaschen und getrocknet. 845,5g (Ausbeute 84,5%) weißes Heparin mit niedriger relativer Molekülmasse, welches die folgenden Merkmale hat, werden gewonnen:

Relative Molekülmasse: 4600 Dalton

U-APTT 34,4 U-aXa72,5.

Die folgende tabelle 2 gibt die mittlere relative Molekülmasse der Oligomere in den verschiedenen Verfahrensstufen sowie die entsprechenden analytischen Werte und die biologische Wirksamkeit an.

Tabelle 2

Zeit	mittlere relative	U-APTT	U-aXa	S	Uronsäuren	eq.-SO₃H
	Molekülmasse *"	*		%	%	eq.~COOH
O	13400	126,7	107,1	8,72	25,82	2,05
15'	11200	98,4
30'	9400	86,9
60'	8100	62	89,6	9,58	27,96	2,07
90'	6900	50,2
120'	5200	36	73
Rohpräzipitat	4600	34	73	9,65	28,16	2,08

Die Gleichung der Korrelationslinie zwischen der mittleren relativen Molekülmasse (x) und U-APTT (y) sieht folgendermaßen aus: y = 0,0108055X-20,1658 (r = 0,9925)

Das entstehende Rohprodukt wird in 61 Wasser gelöst und mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 Volumen/Stunde durch eine Anionenaustauscherharzsäule mit stark basischem Charakter in einer OH~-Form (Amberlittyp) (1000 χ 650mm) perkoliert.

Das Eluat wird mit Essigsäure auf pH 5eingestellt und durch 2 Liter eines schwach sauren chelatbildenden Austauscherharzes perkoliert.

Das Eluat ergibt nach Ausfällung mit Methanol 803,2g eines hochreinen Heparins mit niedriger relativer Molekülmasse (LMW OP 144).

Der atomare Absorptionstest bewies die Abwesenheit von Kupfer.

Die Signale der reduzierenden endständigen Gruppen erscheinen im anomeren Bereich des ¹³C-NMR-Spektrums; die Aufzeichnung erfolgt bei 20 MHz in D₂O, d. h. C-I von N-sulfatiertem Glucosamin (892,7 ppm) und 2,0 sulfatierter Iduronsäure (94,4ppm), im Vergleich mit Methanol als internen Standard, dessen chemische Umlagerung 51,75ppm beträgt.

Beispiel 4

25g vorher nach einem dem in Beispiel 3 beschriebenen analogen Verfahren depolymerisiertes (OP 84/0410) Heparin mit folgenden Merkmalen: U-APTT/mg = 7; U-aXa/mg = 52, antithrombotlsche Wirksamkeit in vivo 116, relative Molekülmasse

3300) werden einem Verfahren zur weiteren Depolymerisation gemäß nachstehender Beschreibung unterzogen.

25g des Heparin mit niedriger relativer Molekülmasse werden mit 0,75g Kupferacetat in 200ml Wasser gegossen. 180 ml 16%iges Wasserstoffperoxid werden anschließend im Verlaufe von 2 Stunden unter Rühren bei einer Temperatur von 65 bis 7O⁰C zugesetzt. Der pH-Wert wird mit Hilfe von NaOH bei 7,4 gehalten. Die entstehende Lösung wird gekühlt, auf pH 6 eingestellt, auf eine Chelex-100®-Säule (2,80 x 13cm),dannauf eine Amberlit®-Säule (IRA. 400 OH~-Form,4,20 χ 8cm)und anschließend auf eine in einer H⁺-Form vorliegende stark saure Polystyrensäule übertragen.

Das Eluat wird mit NaOH auf pH 7 eingestellt und gefriergetrocknet. 19,55g (Ausbeute 78,2%) eines Heparins, OP119, mit niedriger relativer Molekülmasse werden gewonnen. Seine Merkmale werden im Vergleich mit denen des Ausgangsproduktes in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Produkt	Relative	Sin%	Uronsäure	eq. "SO₃H
	Molekülmasse		%	eq. "COOH
P85/0410	3200	10,78	31,23	2,09
VLMW OP119	1700	7,3*	20,8*	2,12

Anmerkung: * Es wurde eine aliquote Menge des Produktes mit der sehr niedrigen relativen Molekülmasse (very low molecular weight — VLMW) von der Anionensäule zurückbehalten: Das erklärt die Abnahme der Prozentangaben von Schwefel und Uronsäure. Die Werte für "SO₃ eq./"~COOH eq. blieben erwiesenermaßen unverändert.

Das ¹³C-NMR-Spektrum zeigt bei 92,7 ppm ein sehr eindeutiges Signal, das dem anomeren Kohlenstoff von N-sulf^tiertem Glucosamin zuzuschreiben ist^Signale, die möglicherweise den C-pKohlenstoffen von Glucuronsäure bzw. lduron-2-O-sulfat zuzuschreiben sind, treten bei 90,9 und 94,4ppm auf.

Beispiel 5

10g Dermatansulfat (060284 Ac/sol).mit mittlerer relativer Molekülmasse von etwa 12000 für 50% und > 25000 für etwa 50% und mit 21 UantithrombotischerWirksamkeitund1,7und 17 U-APTT bzw. U-aXa werden zusammen mit 10g Natriumchlorid und 10g Natriumacetat in 100ml Wasser gegossen. 0,45g Kupferacetatmonohydrat werden zugesetzt. Wenn die Auflösung erfolgt ist, werden innerhalb von 40 Minuten 20 ml 24%iges Wasserstoffperoxid zugesetzt, wobei die Temperatur zwischen 25 und 47°C und der pH-Wert mit NaOH bei 7,6 gehalten wird.

Es wird weitere 20 Minuten lang gerührt; 0,5g EDTA werden zugesetzt, und der pH-Wert wird mit Essigsäure auf 6 eingestellt; das depolymerisierte Produkt wird mit 2 Volumen Methanol ausgefällt. Der feste Rückstand wird durch Filtration gesammelt und in 100 ml Wasser wieder aufgelöst. Nach dem Zusatz von Natriumacetat und 0,45 g EDTA und Einstellen des pH-Wertes auf 6 wird die Verbindung wieder mit Methanol ausgefällt. Im Anschluß an die Filtration ergibt der gesammelte feste Rückstand nach dem

Trocknen 7,1 g (Ausbeute 71 %) eines Dermatansulfates mit niedriger relativer Molekülmasse. Das einer chemischen und

biologischen Analyse unterzogene Produkt wies die folgenden Daten auf:

Mittlere relative Molekülmasse: 3 000-2 800

Schwefel, %: 7,4

Uronsäuren, %: 28,9

Verhältnis eq. SO₃-/eq. "COOH: 1,4

„Ιη-vitro''-Wirksamkeit U-APTT: = 1

Antithrombotische Wirksamkeit „in vivo": 35.

Dermatansulfat 060284 wurde auf einer Cellex D DEAE Cellulose-Säule, aktiviert mit 0,5 n-HCI, unter den folgenden Bedingungen fraktioniert. 8g Dermatansulfat wurden auf einer Säule (2,50 χ 55cm), die mit 0,1 molarer NaCI ausgeglichen war,

chromatografie!!. Es wurden Elutionen mit 2 Litern 0,1 molarer, 0,3 molarer und 1,5 molarer NaCI-Lösung durchgeführt. Die

Eluate wurden eingeengt, und Dermatansulfat wurde mit 2 Volumen Methanol ausgefällt.

Die getesteten Fraktionen werden zusammen mit den Fraktionierungsausbeuten und Merkmalen in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4

Fraktion	Ausbeute	Relaktive	S	Uronsäure	eq.	"SO₃H	in-vitro-Wirk-	in-vi vo-Wi rk-
	%	Molekül	%	%	eq.	"COOH	samkeit	samkeit
		masse					U-APTT U-aXa ;	antithrombotische Wirksamkeit

unfraktioniert	26,1	Π 2 000	6,9	28,2	1,49	1,7
		ς>25000	6,8	28,8	1,42
		f 12000
0,1 molar	21,2	J
		C 20 000
	36,7	η 2 ooo C 4000
0,3 molar	12 000			2,6
				3,0
1,5 molar

17

21

38

48,7 28,7

Die Depolymerisation gestattet die Gewinnung von Oligomeren mit zufriedenstellender Wirksamkeit bei guter Ausbeute. Diese Wirksamkeit ist andernfalls nur durch äußerst zeitaufwendige Fraktionierungen mit sehr niedriger Ausbeute zu erreichen. Die Depolymerisationsprodukte weisen außerdem fibrinolytische Wirksamkeit auf.

Beispiel 6

5g Heparin mit einer mittleren relativen Molekülmasse von 13700 Dalton werden mit 10g Natriumacetat in 100 ml Wasser gelöst. 15ml einer 0,32 molaren Lösung von Eisen(ll)-sulfat werden zugesetzt, und 50ml 5,4%iges Wasserstoffperoxid werden danach im Verlaufe Von 40 Minuten zugetropft. Die Temperatur der Reaktionsmasse wird bei 60⁰C gehalten. Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Reaktionsmasse wird gekühlt und auf Decalit filtriert. Das Filtratwird mit 0,6g EDTA versetzt, und das Produkt wird mit 300ml Methanol ausgefällt. 0,6g EDTA und 18g Natriumacetat werden zugesetzt; die entsprechende Masse wird erneut mit 600ml Methanol ausgefällt. Das durch Filtration gesammelte Depolymerisationsprodukt ergibt nach dem Trocknen 4,6g (Ausbeute 92%) Heparin mit einer relativen Molekülmasse von 7950.

Beispiel 7

2 g OP 436-7/08 Heparansulfat mit einer relativen Molekülmasse von 20800 werden in 30 ml Wasser zusammen mit 92 mg Kupferacetatmonohydrat gelöst. 15 ml 7,2%iges Wasserstoffperoxid werden im Verlaufe von 60 Minuten gelöst, wobei der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7 und die Temperatur bei 5O⁰C gehalten wird.

Am Ende der Reaktion werden 2g Natriumacetat, 100 mg EDTA und 100 ml Ethanol zugesetzt. Das gebildete Präzipitat wird durch Filtration gesammelt, mit Methanol gewaschen und erneut in 15ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Essigsäure auf einen pH-Wert bis zu 4,5 angesäuert und auf einer IRC718 Amberlitharzsäule (1,20 x 12cm)eluiert. Das Eluat wird mit 0,45g Natriumacetat bei einem pH-Wert von 5,5 und schließlich mit 30 ml Methanol versetzt. Das depolymerisierte Heparansulfat fällt aus, wird gesammelt und getrocknet. 1,18g (Ausbeute 59%) Produkt werden gewonnen. Das Produkt weist die in nachstehender Tabelle 5 aufgeführten Merkmale auf.

Tabelle 5

Heparansulfat mit niedriger relativer Molekülmasse

Produkt	Relative	U-APTT	U-aXa	S	Uron	-SO₃H
	Molekül masse			%	säure %	-COOH
HS 436-7/08	20 800	5,32	19,45	5,95	23,52	1,53
LMWHS*	5300		10,49	5,45	22,05	1,48

Beispiel 8

5g Rohheparin mit einer relativen Molekülmasse von 14500 Dalton werden in 100 ml einer 0,01 molaren Lösung eines zweiwertigen Kupfersalzes mit einem Gehalt von 5% Natriumchlorid und 5% Natriumacetat gegossen. 50ml einer 1,6 molaren Lösung von Natriumpersulfat werden unter Rühren und Erwärmen auf 58°C zugesetzt.

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid bei etwa 7 gehalten. Die Lösung wird gekühlt. Das rohe Reaktionsprodukt wird mit 350 ml Methanol ausgefällt; das Präzipitat wird erneut in 50 ml Wasser gelöst, auf einem Anionenaustauschharz (4,20 χ 15 cm) in der ~OH-Form und danach auf einem Kationenaustauschharz in derH⁺-Form (4,20 χ 10 cm) eluiert. Das auf pH 7 neutralisierte und mit3g Natriumacetat versetzte Eluatwird mit200ml Methanol behandelt.

Das durch Filtration gesammelte Präzipitat ergibt nach dem Trocknen 3,47g (Ausbeute 69,5%) hochreines Heparin mit einer niedrigen relativen Molekülmasse von 3900.

Beispiel 9 Salzbildung mit Calcium

200g OP146 LMW Heparin mit einer mittleren relativen Molekülmasse von 4700,28,4 U-APTT/mg, 88,67 U-aXa/mg, mit 9,55% Schwefel, 27,8% Uronsäuren und einem R₃-Verhältnis von SO₃H eq./COOH eq. = 2,08 (potentiometrische Untersuchung) werden in 2000ml Wasser gegossen und durch eine Säule (4,20 χ 100cm), die ein stark saures Polystyrenharz in der H⁺-Form enthält, perkoliert.

Das deutlich saure Eluat war mit einer Calciumhydroxidlösung konstant neutralisiert worden. Am Ende des Perkolationsvorgangs wurden 60g Calciumchlorid zugesetzt, und das Calciumheparin mit niedriger relativer Molekülmasse wurde mit 2 Volumen Methanol ausgefällt.

Nach dem Trocknen wurden 191 g OP149 Ca (Ausbeute 95,5%) Calciumheparin gewonnen, welches eine relative Molekülmasse von 4600 Dalton und die folgenden Merkmale aufwies:

S = 10,63%, Uronsäure = 28,78%, R₃ = 2,24 (potentiometrische Untersuchungen).

Ca = 9,58% (durch atomare Absorption)

Na = 0% (durch atomare Absorption)

U-APTT = 25,2/mg; U-aXa = 84,2/mg (Untersuchung durch diechromogene Methode).

Das Präparat war pyrogenfrei.

Beispiel 10

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren depolymerisiertes Heparin (OP 118 K mit 94,81 U-aXa (chromogen) pro mg und 29,92 U-APTT pro mg) wurde auf intrailealem Wege in einer Dosis von 35 mg/kg Ratten verabreicht, wobei nicht-depolymerisiertes Heparin in der gleichen Dosis zum Vergleich gegeben wurde. In Abständen wurden Proben gesammelt, und die anti-aktivierte Faktor-X-Wirksamkeit (aXa) wurde im Blutplasma der Ratten bestimmt. Die Plasmaspiegel sind in der folgenden Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6

Produkt

mm.

mcg/ml

AUC

LMW/OP118K	1	0	0	0
	2	15	13,9	1,9
	3	30	19,1	2,4
	4	60	32,3	4,6
	5	90	26,5	0,95
	6	120	11,7	0,85
	7	240	5,1
Heparin	1	0
	2	15
	3	30
	4	60
	5	120
	6	240

3 585,7

426

Das gewonneneiHeparin mit niedriger relativer Molekül masse (LMW) weist eine 8mal so hohe Bioverfügbarkeit wie das Heparin mit hoher relativer Molekülmasse auf, wie es die Vergleiche der Flächen unter der Kurve (areas under the curve—AUC) zeigen.

Beispiel 11

Nach den Bedingungen von Beispiel 5 depolymerisiertes Dermatansulfat (DS) wies die in der folgenden Tabelle 7 aufgeführten chemischen und Wirksamkeitsmerkmale auf. Sie sind im Vergleich mit den Merkmalen des nicht-depolymerisierten Produkts angegeben.

Tabelle 7

Produkt	U-APTT	U-aXa	Relative	S	Uron	SO₃H
			Molekül masse	%	säuren	COOH
Dermatansulfat	3,7	24,1	14000	6,8	27,4	1,51
Dermatansulfat mit niedriger relativer Molekülmasse (LMW-DS)	5,2	25,3	3000	7,7	27,8	1,67

Nach intrailealer Verabreichung, die Ratten im experimentellen Thrombosemodell erhielten, zeigte LMW-DS einen ED₆₀ (zur Halbierung der Thrombenmasse) von 6,9mg/kg gegenüber 8,9 mg/kg für das nicht-depolymerisierte Dermatansulfat. LMW-DS erwies sich ebenfalls alsfibrinolytisch.

Beispiel 12

10g Dermatansulfat OP 239 (gebildet aus der folgenden Mischung relativer Molekülmasse: 19% >20000,30% = 14000,50% = 12000, bestimmt durch HPLC [Hochleistungs-Flüssigchromatografie]) und Iah = —60 werden zusammen mit 250 mg essigsaurem Kupfer in 100ml Wasser gegeben.

30 ml 15%iges Wasserstoffperoxid werden im Verlaufe einer Stunde bei einer Temperatur zwischen 37°C und 4O⁰C zugesetzt. Der pH-Wertwird mit insgesamt 14ml NaOH normal bei 7,5 gehalten.

Am Ende der Reaktion wird die Lösung auf 2O⁰C abgekühlt, und der pH-Wert wird mit Essigsäure auf 5,8 gesenkt.

Zwei Volumen Methylalkohol werden zugesetzt, und das auf diese Weise gewonnene Präzipitat wird durch Filtration abgetrennt.

Anschließend wird es in 60ml Wasser löslich gemacht und auf Chelex 100®-Harz (02, Höhe 18cm) eluiert. Die gewonnene Lösung wird zusammen mit dem Waschwasser der Säule mit 2 Volumen Ethanol versetzt. Das durch Filtration abgetrennte und getrocknete Präzipitat ergibt 6,11 g (Ausbeute 61 %) Dermatansulfat mit den folgenden Merkmalen:

la] = -59,3; S = 6,7%; Iduronsäuren = 30,7%;

eg. SO₃H

eq. COOH

Mittlere relative Molekülmasse = 4800 Dalton (durch HPLC auf Protein-Pak-125-Säule [Waters]) Chemische ¹³C-NMR-Umlagerungen sind mit Bezug auf externes Tetramethylsilan angegeben, wobei Methanol als interner Bezug verwendet wird. Die chemische Umlagerung von Methanol in D₂O im Verhältnis zu Tetramethylsilan betrug 51,75 ppm.

Chemische Umlagerungen von L-Idosyluronsäure (U) und von Acetamidodeoxy-D-galactose (A), mit Angabe der Kohlenstoffatome, zu denen sie gehören, sind: δ (ppm): 104,8 (U₁), 103,6 (A₁), 82 (A₃), 77,73 (U₄), 76,94 (A₄), 76,08 (A₅), 72,7 (U₃), 70,9 (U2-5), 60,72 (A₆), 52,9 (A₂) 25,7 (CH₃). Im Bereich von 90 bis 95ppm sind die Signale der reduzierenden Endgruppen (A₁ und U₁) deutlich.

Die in-vitro-Verbindung hat folgende Werte: U-aXa = 2,5U.I./mg und U-APTT = 1,3U.I./mg.

Der Thromboseversuch mit Kaolin nach Hladovec (Physiologia Bohemoslovaca, 24,551,1975) ergab ED₅₀ = 1,2 mg/kg e.v.

Beispiel 13

5g Dermatansulfat 7-8HF mit einer relativen Molekülmasse >34000 (durch HPLC) werden zusammen mit 5g Natriumacetat in 100ml Wasser gegeben.

230mg Monohydrat-Kupfer(ll)-acetat werden zugesetzt, und danach werden 20 ml 12%iges Wasserstoffperoxid über einen Zeitraum von 1 Stunde zugetropft.

Die Temperatur wird zwischen 30 und 38°C und der pH-Wert mit insgesamt 5 ml 0,1 normaler NaOH bei 7,5 gehalten.

Am Ende der Reaktion werden 500mg Dihydrat-Dinatrium EDTA zugesetzt, der pH-Wert wird mit Essigsäure auf 5,9 eingestellt, und das Depolymerisationsproduktwird mit 2 Volumen Methylalkohol ausgefällt.

Das Produkt wird dann wie bei den vorangehenden Beispielen behandelt. 2,95g OP116 (Ausbeute 59%) werden gewonnen.

Merkmale des Produkts:

eq. SO₃H

S = 6,16%; Uronsäuren = 30,84%;

·= 1,21

eq. COOH Relative Molekülmasse = 6000 Dalton, bestimmt durch HPLC auf Protein-Pak-125-Säule (Waters), Fließgeschwindigkeit

1 ml/m:;··, bewegliche Phase: 0,125 molares Na₂SO₄, gepuffert bei pH 6 mit Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ 2 mM,

Brechungsindex-Detektor.

¹³C-NMR (TMS Tetramethylsilan) als externer Standard und Methanol als interner Standard mit chemischer Umlagerung 51,75ppm): δ ppm 104,8 (C-11duronsäure), 103,37 (C-1 Aminozucker-4,0-sulfat); 60,72 (C-6 Aminozucker-0-sulfat); 52,95 (C-2 Aminozucker N. Ac)

[a] = -60 (in Wasser)

Antithrombotische Wirksamkeit „in vivo": 24,7U

U-APTT „in vitro": 2U.I./mg.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Oligosacchariden durch kontrollierte chemische Depolymerisation natürlicher Polysaccharide, gekennzeichnet dadurch, daß die Polysaccharide in wäßriger Lösung bei einer Temperatur zwischen 20 und 70⁰C einer durch ein Radikal ausgelösten radikalischen Reaktion in Anwesenheit eines aus der aus Cu⁺"¹", Fe⁺⁺, Cr⁺⁺⁺ Cr₂O₇ bestehenden Gruppe ausgewählten Katalysators unterzogen wird.

2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß das Radikal in einer wäßrigen Lösung aus einer aus der aus Peressigsäure, 3-Chlorperbenzoesäure, Wasserstoffperoxid bestehenden Gruppe ausgewählten Peroxidverbindung erzeugt wird.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Katalysator in einer Konzentration von 0,1 bis 0,001 Mol verwendet wird.

4. Verfahren nach den vorstehenden Punkten, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktion in Lösungen von Polysacchariden in Konzentrationen von selbst mehr als 10 bis 15% durchgeführt wird.

5. Verfahren nach den vorstehenden Punkten, gekennzeichnet dadurch, daß die Polysaccharide aus der aus Heparinen, Heparansulfaten, Dermatansulfaten, Chonroitinsulfaten, Hyaluronsäure bestehenden Gruppe ausgewählt werden.

6. Verfahren nach den vorstehenden Punkten, gekennzeichnet dadurch, daß mit Natrium, Kalium, Calcium, Lithium oder Magnesium in ein Salz überführten Heparinfraktionen mit niedriger relativer Molekülmasse hergestellt werden.