KR20200020804A - 생체활성 올리고당 제조 - Google Patents
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Abstract
올리고당 생성 방법을 제공한다.
Description
관련 특허 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 6월 20일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/522,604에 대한 우선권 이익을 주장하고, 상기 가출원은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
올리고당으로도 공지된, 3 내지 20개의 단당류 길이의, 당 분자로 이루어진 단쇄는 그의 생체활성에 기인하여 큰 관심의 대상이 되고 있다. 이는 프리바이오틱스로서 작용할 수 있고, 면역계를 조정할 수 있고, 장내 병원균 부착을 차단할 수 있는 능력을 포함한다 [Hooper, L. V.; Midtvedt, T.; Gordon, J. I., Annual review of nutrition 2002, 22 (1), 283-307]. 이러한 올리고당 중 가장 우수한 예는 모유에서 생산된 것이다 [LoCascio, R. G. et al., Journal of agricultural and food chemistry 2007, 55 (22), 8914-8919; Marcobal, A. et al., Journal of agricultural and food chemistry 2010, 58 (9), 5334; Wang, M. et al., Journal of pediatric gastroenterology and nutrition 2015, 60 (6), 825]. 상기 화합물은 발생기 장내 특정 박테리아를 농축시키는 데 높은 특이성을 갖는 것으로 알려져 있다.
식물 및 동물 기반 생성물로부터 올리고당을 수확하는 데 여러 노력이 진행되어 왔다. 그 예로는 갈락토올리고당 (GOS) [Lamsal, B. P., Journal of the Science of Food and Agriculture 2012, 92 (10), 2020-2028] 및 프럭토스 올리고당 (FOS) [Yoshikawa, J. et al., Biotechnology letters 2008, 30 (3), 535-539]을 포함한다. 상기 생성물은 현재 기능식품 및 제약 적용에서 이용되고 있다.
모유 올리고당을 제외하면, 짧은 비접합 올리고당 쇄는 자연상에서는 쉽게 발견되지 않는다. 추가로, 이러한 화합물의 합성은 비용이 많이 들고, 올리고당이 대부분의 천연 생성물에는 고도로 풍부하게 존재하는 것이 아니기 때문에, 단리는 어렵다. 최대 100,000개의 단당류 길이의 당 분자의 다당류는 식물, 박테리아, 및 효모로부터 자연상에 매우 풍부하게 존재하고 있지만, 너무 커서 생물학적 활성을 소지하지 못한다.
펜톤(Fenton)의 화학법은 철 촉매를 이용하여 히드록실 및 히드로페록실 라디칼을 생성하는 것을 기반으로 하며 [Neyens, E.; Baeyens, J., Journal of Hazardous materials 2003, 98 (1), 33-50; Walling, C., Accounts of chemical research 1975, 8 (4), 125-131], 상기 라디칼 생성물은 결국에는 각종의 상이한 기질을 산화시킬 수 있다 [Kuo, W., Water Research 1992, 26 (7), 881-886; Lin, S. H.; Lo, C. C., Water research 1997, 31 (8), 2050-2056; Watts, R. J. et al., Hazardous Waste and Hazardous Materials 1990, 7 (4), 335-345; Zazo, J. et al., Environmental science & technology 2005, 39 (23), 9295-9302]. 특히, 펜톤의 산화는 핵산 복합체 및 단백질-단백질 상호작용을 그의 각 중합체의 선택적 절단에 의해 측정하는 분석 도구로서 사용되어 왔다 [Meares, C. F. et al., Methods in enzymology 2003, 371, 82-106; Rana, T. M.; Meares, C. F., Journal of the American Chemical Society 1990, 112 (6), 2457-2458]. 산화 및 철 촉매를 이용 및 이용하지 않는 탄수화물의 산화적 분해는 특히 전분 및 셀룰로스를 기능화하고, 목재 다당류를 분해하는 데 있어 큰 관심의 대상이 되어 왔다 [Emery, J. A. et al., Wood Science and Technology 1974, 8 (2), 123-137; Xu, G.; Goodell, B., Journal of Biotechnology 2001, 87 (1), 43-57; Haskins, J. F.; Hogsed, M. J., The Journal of Organic Chemistry 1950, 15 (6), 1264-1274; Selih, V. S. et al., Polymer Degradation and Stability 2007, 92 (8), 1476-1481; Parovuori, P. et al., Starch- Staerke 1995, 47 (1), 19-23]. 단당류, 이당류 및 올리고당에 대한 펜톤 타입 산화의 기전 및 결과는 다수의 연구원들에 의해 연구되어 왔다. 탄수화물의 펜톤 산화는 고유의 특이성을 갖는 경향이 있다. 이당류는 단당류 및 당 알콜보다는 더욱 쉽게 산화되는 것으로 밝혀졌고 [Morelli, R. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003, 51 (25), 7418-7425], (1→6) 연결은 (1→4) 연결보다 더욱 불안정한 경향이 있다 [Uchida, K.; Kawakishi, S., Carbohydrate Research 1988, 173 (1), 89-99].
더욱 최근에 펜톤 시스템은 콘드로이틴 술페이트, 헤파린, 및 다른 글리코사미노글리칸의 해중합을 위해 사용되고 있다 [Achour, O. et al., Carbohydrate Polymers 2013, 97 (2), 684-689; Li, J.-h. et al., Marine Drugs 2016, 14 (9), 170; Petit, A. C. et al., Carbohydrate Polymers 2006, 64 (4), 597-602; Wu, M. et al., Carbohydrate Polymers 2010, 80 (4), 1116-1124]. 상기 논문에서는 모두 이두론산 또는 글루쿠론산 잔기 형태의 산 함유 기질이 사용되었다.
다당류로부터 올리고당을 형성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 다당류를 과산화수소 및 Fe3 +, Fe2 + , Cu2 + 또는 본원에서 논의된 바와 같은 다른 금속과 반응시킨 후, 염기로 다당류 중의 글리코시드 연결을 절단하여 다당류로부터 올리고당을 형성하는 단계를 포함한다. 상기 반응은 본원에서 "FITDOG"로 지칭된다.
본 발명자들은 식물, 박테리아, 및 효모로부터 다당류를 분해함으로써 생체활성 올리고당을 제조하는 방법을 개발하였다. 본 방법은 철 (Fe3 +, Fe2 +) 또는 다른 전이 금속 (Cu1 +, Co2 + 등을 포함하나, 이에 제한되지 않음) 및 과산화수소로 구성된 펜톤 시약을 사용한다. 일부 실시양태에서, 올리고당은 DP 3 내지 20 범위로 제조된다 (DP는 중합도를 지칭한다). 일부 실시양태에서, 기술된 방법은 분석을 위한, 및 프리바이오틱, 항암, 병원균 차단이거나, 또는 다른 기능을 갖는 생체활성 식품을 위한 올리고당을 제조하게 될 것이다.
본 방법은 (예컨대, 식물, 박테리아, 또는 효모로부터의) 다당류를 생체활성 올리고당으로 전환시키는 데 사용될 수 있다. 본 방법은 다당류를 Fe3 + 및 과산화수소와 반응시키는 것을 포함한다. Fe2 + 및 Cu2 +를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 금속도 가변적 효능으로 동일한 결과를 가져온다. 일부 실시양태에서, 반응은 30분 (또는 예를 들어, 10분 내지 4시간, 예컨대, 15분 내지 2시간 또는 10분 내지 1시간) 동안 진행될 수 있다. 이어서, 반응은 염기 (예컨대, 수성 수산화나트륨, 수산화칼슘, 수산화칼륨 등)로 ?칭된다.
일부 실시양태에서, 생성된 올리고당은 특징화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성물 혼합물의 고성능 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법 (LC-MS) 분석 결과, 다당류 공급원에 의존하여 중합도가 3 내지 20 정도 (또는 예를 들어, 3 내지 최대 200)인 범위의 크기를 갖는 다수의 올리고당 구조가 나타난다. 올리고당 구조 및 조성은 다당류 공급원에 의존한다.
일부 실시양태에서, 중합도 (DP)가 3 내지 20 (또는 예를 들어, 3 내지 최대 200)으로 이루어진 올리고당을 식물 공급원으로부터 제조하는 것을 제공한다. 다당류는 예를 들어, 공지된 식품, 예컨대, 쌀, 바나나, 호박, 밀가루로부터의 것 및 식품 생산의 부산물로서의 다당류를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다당류는 식품 폐기물로부터 및 보통 식품으로 간주되지 않는 공급원으로부터 유래된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 다당류의 공급원은 프로세싱된 식품 및 식물 생성물이다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 (예를 들어, DP 3 내지 20 (또는 예를 들어, 3 내지 최대 200)의 중합도를 갖는) 올리고당을 박테리아 세포벽 다당류로부터 제조하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 (예를 들어, DP 3 내지 20 (또는 예를 들어, 3 내지 최대 200)의 중합도를 갖는) 올리고당을 효모 세포벽 다당류로부터 제조하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 (예를 들어, DP 3 내지 20 (또는 예를 들어, 3 내지 최대 200)의 중합도를 갖는) 올리고당을 조류 다당류로부터 제조하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 올리고당은 생체활성 올리고당이다. 일부 실시양태에서, 생체활성 올리고당은 인간 장에 유익한 박테리아에 의해 소비된다. 일부 실시양태에서, 생체활성 올리고당은 면역계를 조정할 수 있다. 올리고당은 면역계가 공지 및 비공지된 자극에 대하여 과소 또는 과잉 반응하도록 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체활성 올리고당은 병원균 차단제로서 작용한다.
일부 실시양태에서, 올리고당은 토양의 미생물총의 성장을 자극하는 선택적 탄소 기질이다. 일부 실시양태에서, 올리고당은 토양에의 훈증 또는 멸균화 프로토콜 이후에 토양에 첨가된다. 접근가능한 유기 탄소는 제어되지 않는다면, 토양 생태를 병원성 방향으로 유도할 수 있다. 유익한 토양 미생물총의 성장을 선택적으로 자극하는 특이적 올리고당을 제공함으로써, 토양내 토양 병원균 집단을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이 제조된 하나 이상의 올리고당의 조합을 하나 이상의 미생물 (예컨대, 유익한 토양 미생물)과 함께 토양에 첨가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이 제조된 하나 이상의 올리고당은 식품 보충용 프리바이오틱을 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고당은 과체중 및 비만인 아동에서의 식욕 조절 및/또는 에너지 (칼로리) 섭취 조절에 기여할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 반응 조건을 사용하여 다당류를 포함하는 불용성 섬유로부터 가용성 섬유를 생성하는 방법을 제공한다. 반응을 단지 특정 정도까지만 진행시킴으로써, 바람직한 특징을 갖는 조성물 (예컨대, 겔 또는 연고)을 생성할 수 있다. 가용성 섬유 생성물은 의약품 및 의료 기기, 식품 (즉, 점도증진제, 영양 개선, 향미 개질), (특성 유익한 토양 마이크로비옴 구성 요소로 농축시키는) 토양 개선, 및 섬유 생산 (즉, 신생 직물, 로프, 생분해성 패키징 등)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다수의 용도에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 불용성 섬유는 면이다.
일부 실시양태에서, 다당류로부터 올리고당을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 반응 혼합물 중 다당류를 과산화수소 및 전이 금속 또는 알칼리 토금속과 반응시킨 후; 반응을 염기로 ?칭시키고/거나, 염기로 다당류 중의 글리코시드 연결을 절단하여 다당류로부터 올리고당의 혼합물을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 전이 금속을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전이 금속은 철 (예컨대, Fe3+, Fe2+), 구리 (예컨대, Cu2+), 망가니즈, 코발트, 또는 몰리브데넘으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 알칼리 토금속을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알칼리 토금속은 칼슘 또는 마그네슘으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중 전이 금속 또는 알칼리 토금속은 적어도 0.65 nM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중 전이 금속 또는 알칼리 토금속은 0.65 nM 내지 500 nM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중 과산화수소는 적어도 0.02 M의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중 과산화수소는 0.02 M 내지 1 M의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화칼슘이다. 일부 실시양태에서, 염기는 적어도 0.1 M의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 염기는 0.1 M - 5.0 M의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 다당류로는 아밀로스, 아밀로펙틴, 베타글루칸, 풀루란, 크실로글루칸, 아라비노갈락탄 I 및 아라비노갈락탄 II, 람노갈락투로난 I, 람노갈락투로난 II, 갈락탄, 아라비난, 아라비노크실란, 크실란 (예컨대, 비치우드 크실란), 글리코겐, 만난, 글루코만난, 커들란, 또는 이눌린 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다당류는 식물 또는 동물 공급원으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 다당류는 박테리아 또는 조류 공급원으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 다당류는 (임의적으로 동결건조된) 식물 물질 형태의 것이다. 일부 실시양태에서, 식물 물질은 바나나, 병아리콩 또는 수수 식물 물질이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 하나 이상의 올리고당을 올리고당의 혼합물로부터 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 반응 이전에, 다당류를 하나 이상의 다당류 분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 다당류 분해 효소로는 아밀라제, 이소아밀라제, 셀룰라제, 말타제, 글루카나제, 또는 그의 조합을 포함한다.
상기 또는 본원 다른 곳의 방법에서 생성된 바와 같은 올리고당의 혼합물, 또는 상기 또는 본원 다른 곳의 방법에서 생성된 바와 같은 정제된 하나 이상의 올리고당을 포함하는 조성물을 또한 제공한다.
하기 표 1의 올리고당, 또는 표 1의 2개 이상의 올리고당의 혼합물을 또한 제공한다.
시험관내 또는 생체내에서 미생물을 자극시키는 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 미생물 (예컨대, 박테리아, 진균, 효모)을 미생물의 성장을 선택적으로 자극시키는 조건하에서 상기 방법에서 생성된 바와 같은, 또는 본원 다른 곳 (예컨대, 표 1)에 기술된 바와 같은 올리고당의 혼합물을 포함하는 조성물, 또는 표의 올리고당과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물은 프로바이오틱 미생물이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 동물의 장내 존재하고, 조성물은 동물에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 미생물은 동물에게 조성물과 별개로, 또는 조성물과 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 미생물은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(Bifidobacterium pseudocatenulatum)이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 토양 미생물, 구강 미생물 (예컨대, 박테리아), 또는 피부 미생물 (예컨대, 박테리아)이다.
정의
올리고당의 "중합도" 또는 "DP"란, 특정 올리고당의 일부인 당 단량체 단위의 총 개수를 지칭한다. 예를 들어, 3개의 갈락토스 모이어티 및 1개의 글루코스 모이어티를 갖는 테트라 갈락토-올리고당의 DP는 4이다.
"비피도박테리움(Bifidobacterium)"이라는 용어 및 그의 동의어는 인간에 유익한 특성을 갖는 혐기성 박테리아의 속을 지칭한다. 비피도박테리움은 위장관에 상주하는 박테리아인, 장내 세균총을 구성하고, 그의 숙주에 건강상 이점을 갖는 박테리아의 주요 균주들 중 하나이다. 정상적인 장내 세균총 내의 비피도박테리움에 대한 추가 설명에 대해서는 예컨대, 문헌 [Guarner F and Malagelada JR. Lancet (2003) 361, 512-519]를 참조한다.
"프리바이오틱" 또는 "프리바이오틱 영양소"는 일반적으로, 섭취시 위장관내 한 미생물 또는 제한된 개수의 미생물의 성장 및/활성을 선택적으로 자극함으로써 숙주에 유익한 영향을 주는 비가소화 식품 성분이다. 본원에서 사용되는 바, "프리바이오틱"이라는 용어는 예를 들어, 전체 모유 중의 것과 달리, 그의 비자연적으로 발생된 상태에서, 예컨대, 정제, 화학적 또는 효소적 합성 이후에 상기 기술된 비가소화 식품 성분을 지칭한다.
"프로바이오틱"이란, 적절한 양으로 투여되었을 때, 숙주에 건강상 이익을 부여하는 살아있는 미생물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "약" 및 "대략"이라는 용어는 수치 또는 범위로 명시된 양을 수식하는 데 사용될 때, 수치 뿐만 아니라, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 값으로부터의 합리적인 편차, 예를 들어 ±20%, ±10%, 또는 ±5%가 언급된 값의 의도된 의미 내에 포함되어 있음을 의미한다.
도 1. FITDOG에 의해 제조된 크실로글루칸 올리고당에 대한 MALDI-MS의 예.
도 2. 최적의 올리고당 존재비를 얻기 위한 황산철(III) 농도의 최적화.
도 3. 최적의 올리고당 존재비를 얻기 위한 완충제 pH의 최적화.
도 4. NaOH 및 과산화수소 농도의 최적화.
도 5. 시간 및 온도 조건의 최적화.
도 6. CuCl2, FeSO4, 및 Fe3(SO4)2로부터 생성된, 녹색 반으로 쪼개진 완두콩으로부터의 올리고당의 HPLC-MS 프로파일.
도 7. FITDOG 처리된 식품의 상대적인 단당류 조성.
도 8. FITDOG 처리된 바나나 껍질, 병아리콩, 및 수수에 대한, 주석 달린 염기 피크 크로마토그램. 주석은 표 1의 화합물 지정과 일치한다.
도 9. 버터넛 스쿼시의 펜톤 산화로부터 생성된 올리고당에서의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 MP80의 성장.
도 10은 크실란에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 11은 아라비노크실란에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 12는 리케난에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 13은 갈락토만난에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 14는 아밀로펙틴에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 15는 아밀로스에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 16은 람노갈락투로난 I에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 17은 크실로글루칸에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 18은 커들란에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 19는 갈락탄에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 20은 만난에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 21은 글루코만난에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 22는 낙엽송 아라비노갈락탄에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 23은 폴리갈락투론산에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 24는 이눌린에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 25는 Fitdog 방법에서 상이한 금속이 사용된, 아밀로스에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 26은 Fitdog 방법에서 상이한 금속이 사용된, 아밀로스에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 27은 아밀로스에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 28은 효모 세포벽 다당류에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 29는 1-200+ 헥소스로부터 다양한 중합화를 나타내는, 리터 규모의 FITDOG가 수행된 버터넛 스쿼시에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다. 상기 데이터는 나노-칩-HPLC/Q-TOF 질량 분석계에서 분석하였다. 4-7개의 헥소스로부터의 중합도가 최고 존재비인 것으로 나타났다.
도 2. 최적의 올리고당 존재비를 얻기 위한 황산철(III) 농도의 최적화.
도 3. 최적의 올리고당 존재비를 얻기 위한 완충제 pH의 최적화.
도 4. NaOH 및 과산화수소 농도의 최적화.
도 5. 시간 및 온도 조건의 최적화.
도 6. CuCl2, FeSO4, 및 Fe3(SO4)2로부터 생성된, 녹색 반으로 쪼개진 완두콩으로부터의 올리고당의 HPLC-MS 프로파일.
도 7. FITDOG 처리된 식품의 상대적인 단당류 조성.
도 8. FITDOG 처리된 바나나 껍질, 병아리콩, 및 수수에 대한, 주석 달린 염기 피크 크로마토그램. 주석은 표 1의 화합물 지정과 일치한다.
도 9. 버터넛 스쿼시의 펜톤 산화로부터 생성된 올리고당에서의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 MP80의 성장.
도 10은 크실란에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 11은 아라비노크실란에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 12는 리케난에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 13은 갈락토만난에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 14는 아밀로펙틴에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 15는 아밀로스에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 16은 람노갈락투로난 I에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 17은 크실로글루칸에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 18은 커들란에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 19는 갈락탄에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 20은 만난에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 21은 글루코만난에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 22는 낙엽송 아라비노갈락탄에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 23은 폴리갈락투론산에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 24는 이눌린에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 25는 Fitdog 방법에서 상이한 금속이 사용된, 아밀로스에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 26은 Fitdog 방법에서 상이한 금속이 사용된, 아밀로스에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 27은 아밀로스에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 28은 효모 세포벽 다당류에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 29는 1-200+ 헥소스로부터 다양한 중합화를 나타내는, 리터 규모의 FITDOG가 수행된 버터넛 스쿼시에 대한 주석 달린 염기 피크 크로마토그램을 보여주는 것이다. 상기 데이터는 나노-칩-HPLC/Q-TOF 질량 분석계에서 분석하였다. 4-7개의 헥소스로부터의 중합도가 최고 존재비인 것으로 나타났다.
정의된 올리고당 기로 진행되는 펜톤의 개시(Fenton's Initiation Toward Defined Oligosaccharide Groups: FITDOG)는 제어된 방식으로 다당류를 올리고당으로 분해하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 먼저 조 다당류는 과산화수소 및 전이 금속 또는 알칼리 토금속 (예컨대, 황산철(III))로 초기 산화적 처리되고, 이로써, 글리코시드 연결은 더욱 불안정해진다. 이후, 염기 유도 절단을 위해 NaOH 또는 다른 염기가 사용되고, 그 결과로 다양한 올리고당이 생성된다. 중간 중성화가 발생하고, 이로써, 필링 반응은 감소된다. 상기 방법은 다양한 탄수화물 공급원으로부터 다량의 생물학적으로 활성인 올리고당을 생성할 수 있는 능력을 갖는다.
원한다면, 생성된 다당류를 산화적 처리 및 금속 촉매로 처리하기 이전에, 다당류를 임의적으로 하나 이상의 다당류-분해 효소로 처리하여 다당류의 평균 크기 또는 복잡도를 감소시킬 수 있다. 다당류 효소의 비제한적인 예로는 예를 들어, 아밀라제, 이소아밀라제, 셀룰라제, 말타제, 글루카나제, 또는 그의 조합을 포함한다.
초기 산화적 처리는 과산화수소 및 전이 금속 또는 알칼리 토금속을 포함할 수 있다. FITDOG 프로세스를 이용하여 적용을 이해하기 위해, 산화 상태, 크기, 주기율표 족 및 배위수가 상이한 금속을 시험하였다. 상이한 금속들은 각각 FITDOG 반응에서 활성을 보였다. 이들 금속은 어느 다당류와도 작용하지만, 차별적인 중합도를 갖는 올리고당 제조를 위해 상이한 금속이 사용될 수 있다. 산화적 처리 후, 염기 처리가 수행된다. 본 방법은 천연 및 변형된 다당류를 비롯한, 다양한 분지화도를 갖고, 다양한 단당류 조성을 갖는 다당류로부터 올리고당을 생성할 수 있다. 상기 방법은 어느 공급원으로부터의 다당류와도 작용할 것이다. 예시적인 다당류 기질로는 아밀로스, 아밀로펙틴, 베타글루칸, 풀루란, 크실로글루칸, 아라비노갈락탄 I 및 아라비노갈락탄 II, 람노갈락투로난 I, 람노갈락투로난 II, 갈락탄, 아라비난, 아라비노크실란, 크실란 (예컨대, 비치우드 크실란), 글리코겐, 만난, 글루코만난, 커들란, 또는 이눌린 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 생성된 올리고당의 생성된 혼합물은 평균적으로 2-200, 예컨대, 2-100 또는 3-20 또는 5-50의 중합도를 가질 수 있다.
본 방법에 의해 생성된 올리고당의 생성된 혼합물은 다양한 용도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고당의 혼합물은 하나 이상의 프로바이오틱 박테리아의 성장을 선택적으로 자극시키는 프리바이오틱으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고당 조성물은 프리바이오틱 제제 (즉, 박테리아 부재) 또는 프로바이오틱 제제 (즉, 바람직한 박테리아, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 비피도박테리아 포함)로서 투여될 수 있다. 일반적으로, 인간 또는 동물이 섭취할 수 있는 임의의 식품 또는 음료는 프리바이오틱 및 프로바이오틱 올리고당 함유 조성물을 함유하는 제제를 제조하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 식품으로는, 본원에 기술된 프리바이오틱 및 프로바이오틱 조성물의 용이하고, 균일한 분산을 허용하는, 반액체 콘시스턴시를 갖는 것을 포함한다. 그러나, 다른 콘시스턴시 (예컨대, 분말, 액체 등) 또한 제한 없이 사용될 수 있다. 따라서, 상기와 같은 식품 품목으로는 제한 없이, 유제품, 예컨대, 치즈, 코티지 치즈, 요거트, 및 아이스크림을 포함한다. 영아/유아용인 것을 비롯한, 가공된 과일 및 채소, 예컨대, 사과 소스 또는 스트레이닝된 완두콩 및 당근 또한 본 발명의 올리고당과 함께 조합하여 사용하는 데 적합하다. 영아용 시리얼, 예컨대, 쌀로 또는 귀리로 만든 시리얼, 및 성인용 시리얼, 예컨대, 무실릭스(Musilix)는 모두 또한 올리고당과 함께 조합하여 사용하는 데 적합하다. 인간의 식용 식품 이외에도, 동물용 사료 또한 프리바이오틱 및 프로바이오틱 올리고당 함유 조성물로 보충될 수 있다.
대안적으로, 프리바이오틱 및 프로바이오틱 올리고당 함유 조성물은 음료를 보충하는 데 사용될 수 있다. 상기 음료의 예로는 제한 없이, 영아용 조제분유, 성장기 조제분유, 유아용 음료, 우유, 발효유, 과일 주스, 과일로 만든 음료, 및 스포츠 음료를 포함한다. 다수의 영아용 및 유아용 조제분유가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 카네이션 굿 스타프(Carnation Good Start) (네슬레 영양 부서(Nestle Nutrition Division: 미국 캘리포니아주 글렌데일)) 및 메이필드 데일리 팜즈(Mayfield Dairy Farms: 미국 테네시주 아테네)에 의해 생산된 뉴트리시 A/B(Nutrish A/B)와 같은 조제분유가 상업적으로 이용가능하다. 영아용 또는 아기용 조제분유의 다른 예로는 미국 특허 번호 5,902,617에 개시된 것을 포함한다. 조성물의 다른 유익한 제제로는 예컨대, 우유와 같은 동물 생산 우유의 보충제를 포함한다.
대안적으로, 프리바이오틱 및 프로바이오틱 올리고당 함유 조성물은 환제 또는 정제로 제제화될 수 있거나, 예컨대, 젤라틴 캡슐제와 같이, 캡슐제로 캡슐화될 수 있다. 정제 형태는 임의적으로 예를 들어, 락토스, 수크로스, 만닛톨, 소르비톨, 인산칼슘, 옥수수 전분, 감자 전분, 미정질 셀룰로스, 젤라틴, 콜로이드 이산화규소, 탈크, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산, 및 다른 부형제, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충화제, 습윤화제, 보존제, 향미제, 염료, 붕해제, 및 제약상 화합성을 띠는 담체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 로젠지 또는 캔디 형태는 향미료, 예컨대, 수크로스 중 상기 조성물을 포함할 수 있을 뿐만 아니라, 파스틸은 활성 성분 이외에도, 관련 기술분야에 공지된 담체를 함유하는, 예컨대, 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아 에멀젼, 겔 등과 같은 불활성 베이스 중에 조성물을 포함할 수 있다. 프리바이오틱 또는 프로바이오틱 올리고당 함유 제제는 또한 통상의 식품 보충제 충전제 및 증량제, 예컨대, 예를 들어, 쌀가루를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프리바이오틱 또는 프로바이오틱 올리고당 함유 조성물은 비-인간 단백질, 비-인간 지질, 비-인간 탄수화물, 또는 다른 비-인간 성분을 추가로 포함할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 소 (또는 다른 비-인간) 우유 단백질, 대두 단백질, 쌀 단백질, 베타락토글로불린, 유장, 대두유, 또는 전분을 포함한다.
프리바이오틱 및 프로바이오틱 올리고당 함유 조성물의 투여량은 개체의 요건에 의존하여 달라질 것이며, 예컨대, 연령 (영아 대 성인), 체중, 및 유익한 장 박테리아의 손실 이유 (예컨대, 항생제 요법, 화학요법, 질환 또는 연령)를 고려할 것이다. 본 개시내용과 관련하여, 개체에게 투여되는 양은 시간 경과에 따라 유익한 박테리아가 장내 군집형성을 확립하는 데 충분하여야 한다. 용량의 크기 또한 프리바이오틱 또는 프로바이오틱 올리고당 함유 조성물 투여와 동반될 수 있는 임의의 유해한 부작용의 존재, 성질, 및 정도에 의해 결정될 것이다. 일부 실시양태에서, 투여량 범위는 식품 보충제로서, 및 장관내 유익한 박테리아의 재확립에 효과적일 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고당 조성물의 투여량은 약 1 ㎍/L 내지 약 25 g/L의 올리고당 범위이다. 일부 실시양태에서, 올리고당 조성물의 투여량은 약 100 ㎍/L 내지 약 15 g/L의 올리고당이다. 일부 실시양태에서, 올리고당 조성물의 투여량은 약 1 g/L 내지 약 10 g/L의 올리고당이다. 예시적인 비피도박테리움 투여량은 1회 투약당 약 104 내지 약 1012 콜로니 형성 단위 (CFU)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가의 유익한 범위는 약 106 내지 약 1010 CFU이다.
프리바이오틱 또는 프로바이오틱 올리고당 함유 제제는 그를 필요로 하는 임의의 개체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 영아 또는 유아이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 개체는 예컨대, 3개월, 6개월, 9개월, 1세, 2세 또는 3세 미만인 개체이다. 일부 실시양태에서, 개체는 3-18세의 개체이다. 일부 실시양태에서, 개체는 성인 (예컨대, 18세 이상)인 개체이다. 일부 실시양태에서, 개체는 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75세 초과인 개체이다. 일부 실시양태에서, 개체는 면역 결핍인 개체 (예컨대, AIDS를 앓거나, 화학요법을 받고 있는 개체)이다.
본 발명의 프로바이오틱 조성물 중에 포함될 수 있는 예시적인 비피도박테리움으로는 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis), B. 롱검 아종 롱검(B. longum subsp. longum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 및 B. 슈도카테눌라툼(B. pseudocatenulatum)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 사용되는 비피도박테리움은 부분적으로 표적 소비자에 의존하게 될 것이다.
일부 적용은 다른 비피도제닉 인자를 본원에 기술된 제제 중에 포함하는 것이 유익할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러한 추가 성분으로는 프럭토올리고당, 예컨대, 라프틸로스(Raftilose) (롱-프랑(Rhone-Poulenc: 미국 뉴저지주 크랜버리)), 이눌린 (임페리얼 할리 코포레이션(Imperial Holly Corp.: 미국 텍사스주 슈가랜드)), 및 뉴트라플로라(Nutraflora) (골든 테크놀러지즈(Golden Technologies: 미국 콜로라도주 웨스트민스터)) 뿐만 아니라, 특히, 락토스, 크실로올리고당, 대두 올리고당, 락툴로스/락티톨 및 갈락토올리고당을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 적용에서, 다른 유익한 박테리아, 예컨대, 락토바실러스(Lactobacillus), 루미노코쿠스(Rumminococcus), 아커만시아(Akkermansia), 박테로이데스(Bacteroides), 페칼리박테리움(Faecalibacterium)이 제제 중에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 올리고당은 임의 종류의 미생물을 자극시키는 데 사용될 수 있다. 올리고당에 의해 자극받을 수 있는 미생물의 예로는 예를 들어, 토양 미생물 (예컨대, 균근 진균 및 박테리아, 및 토양 접종물로서 사용되는 다른 미생물, 예컨대, 아조스피릴럼 종(Azosprillum sp .)), 구강 박테리아 (예컨대, 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 고르도니이(Streptococcus gordonii), 스트렙토코쿠스 산구이스(Streptococcus sanguis), 및 S. 오랄리스(S. oralis)) 및 피부 박테리아 (예컨대, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 또한, 니트로소모나스(Nitrosomonas), 니트로소코쿠스(Nitrosococcus), 니트로소스피라(Nitrosospira), 니트로소시스티스(Nitrosocystis), 및 니트로솔로부스(Nitrosolobus), 니트로소비브리오(Nitrosovibrio)를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 암모니아 산화 박테리아를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고당 조성물은 그를 필요로 하는 인간 또는 동물에게 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 올리고당 조성물은 염증성 장 증후군, 변비, 설사, 결장염, 크론병, 결장암, 기능성 장 장애 (FBD), 과민성 장 증후군 (IBS), 과량의 술페이트 환원 박테리아, 염증성 장 질환 (IBD), 및 궤양성 결장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 병태를 앓는 사람 또는 동물에게 투여된다. 과민성 장 증후군 (IBS)은 복통 및 복부 불편감, 팽만감, 및 장 기능 변화, 변비 및/또는 설사를 특징으로 한다. 3개 군의 IBS가 있다: 변비 우세형 IBS (C-IBS), 교대형 IBS (A-IBS) 및 설사 우세형 IBS (D-IBS). 올리고당 조성물은 예컨대, 궤양 환자에서 억제시키거나, 또는 관해 기간을 연장시키는 데 유용하다. 올리고당 조성물은 임의 형태의 기능성 장 장애 (FBD), 및 특히 과민성 장 증후군 (IBS), 예컨대, 변비 우세형 IBS (C-IBS), 교대형 IBS (A-IBS) 및 설사 우세형 IBS (D-IBS); 기능성 변비 및 기능성 설사를 치료 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. FBD는 만성 또는 반-만성이고, 장 통증, 장 기능 장애 및 사회적 분열과 연관된 다양한 위장 장애에 대한 일반 용어이다.
또 다른 실시양태에서, 올리고당 조성물은 면역계의 자극을 필요로 하는 개체에게 및/또는 박테리아 또는 효모 감염, 예컨대, 칸디다증 또는 술페이트 환원 박테리아에 의해 유도되는 질환에 대한 내성을 촉진시키기 위해 투여된다.
실시예
실시예
1
해중합을 통해 다당류로부터 올리고당을 생성할 수 있는 능력이 관심을 끄는 해결 방안이다. 현재 다당류는 2가지 방식, 산 가수분해 및 글리코실 히드롤라제를 이용하는 효소적 처리로 해중합된다. 상기 두 기술 모두 그 만의 단점을 갖고 있는데, 산 가수분해는 다량의 단당류 및 극소량의 올리고당을 생산하는 경향이 있다. 한편, 효소적 처리는 다량의 올리고당을 생산할 수 있지만, 각 글리코실 히드롤라제는 연결 위치, 입체화학, 및 주변 환경의 단당류 배열에 따라 매우 특이적 부위에서만 절단할 수 있다. 이는 비록 특이적 다당류를 해중합할 수 있는 효소가 공지되어 있고, 이용가능할지라도, 천연 생성물에 존재하는 구조상 다양한 다당류를 대규모로 분해하지 못할 수도 있다는 것을 의미한다.
셀룰로스 및 산 함유 다당류 해중합에 관한 보고가 있지만, 펜톤 시스템을 이용하여 중성 다당류를 효과적으로 해중합할 수 있는 방법은 아직 없다. 추가로, 고수율로, 조 천연 생성물로부터 다량의 올리고당을 제조하기 위한 펜톤 시스템의 용도도 제시된 바 없다. 하기의 실시예는 두 다당류 단리물 모두로부터 및 천연 생성물로부터 고수율로 올리고당을 생성하기 위한, 분석 및 제조 규모의 방법 및 올리고당 기의 해리로 진행되는 펜톤의 개시(Fenton's Initiation Towards the Dissociation of Oligosaccharide Groups: FITDOG)의 적용, 둘 모두를 보여주는 것을 목표로 한다.
방법
물질
식품은 지역 슈퍼마켓에서 입수하였다. 아세트산나트륨, 과산화수소 (30% w/w), 수산화나트륨, 황산철(III) 오수화물, 및 빙초산은 모두 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다.
소규모의, 올리고당 기의 해리로 진행되는
펜톤의
개시 (
FITDOG
)
빙초산을 이용하여 pH 5로 조정된 95% (v/v) 아세트산나트륨 완충제, 5% (v/v) 과산화수소 (30% w/w), 및 65 nM 황산철(III)을 함유하는 용액을 제조하였다. 상기 혼합물을 와동시키고, 건조된 다당류 표준에 첨가하여 1 mg/ml의 최종 용액을 제조하였다. 반응물을 100℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 반응 후, 반응물 부피의 절반량의 2 M NaOH를 첨가하고, 와동시킨 후, 0.6%의, 초기 반응 부피의 진한 아세트산을 첨가하여 중화시켰다.
소규모의
FITDOG로
생성된 올리고당 정제
비다공성 흑연화 탄소 카트리지 (GCC-SPE)를 이용하여 올리고당을 단리시켰다. 카트리지를 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA) 중 80% 아세토니트릴 및 나노-순수(nano-pure water)로 세척하였다. 올리고당을 로딩하고, 5 칼럼 부피의 나노-순수로 세척하였다. 0.05% (v/v) TFA와 함께 40% 아세토니트릴을 이용하여 올리고당을 용출시켰다.
대규모의 올리고당 기의 해리로 진행되는
펜톤의
개시 (
FITDOG
)
식품을 동결건조시켜 완전히 건조시키고, KRUPS F203 그라인더(KRUPS F203 Grinder) (미국 뉴저지주 밀빌)에서 미세 분말로 분쇄시켰다. 빙초산을 이용하여 pH 5로 조정된 40 mM 아세트산나트륨 완충제로 이루어진 950 ml 용액을 빙수 칼럼 응축기가 장착된 2 ℓ의 둥근 바닥 플라스크 중에서 끓였다. 플라스크에 1.0 g의 분쇄, 동결건조된 식품, 32 mg의 황산철(III), 및 물 중 50 ml의 30% (w/w) 과산화수소를 플라스크에 첨가하였다. 용액을 교반 막대를 이용하여 20분 동안 반응시켰다. 절단을 유도하기 위해, 500 ml의 빙냉 2 M NaOH를 첨가하고 30초 동안 교반한 후, 61.5 ml의 빙냉 빙초산을 첨가하여 반응물을 중화시킨다.
대규모의
FITDOG로
생성된 올리고당 정제
0.45 ㎛ 폴리비닐리덴-플루오라이드 (PVDF) 필터를 통해 여과시킴으로써 응집된 철을 제거하였다. 콤비플래쉬 Rf200(CombiFlash Rf200) (텔레다인 이스코(Teledyne Isco)) 플래쉬 액체 크로마토그래프와 함께 자기 패킹된 50 g의 다공성 흑연화 탄소 (PGC) 플래쉬 액체 크로마토그래피 (플래쉬-LC) 칼럼을 사용하였다. 샘플을 7 ml/min 속도로 칼럼 상에 로딩하였다. 이원 용매 시스템을 사용하였고, 이는 A: 나노-순수 및 B: 아세토니트릴 (HPLC 등급)로 이루어졌다. 샘플을 10 ml/min으로 20분 동안 100% 용매 A로 세척한 후, 140분 동안에 걸쳐 0%에서 80% 용매 B 구배를 시작한 후, 이어서, 20분 동안 80% 용매 B의 등용매로 진행하였다. 40-100분째의 것을 제외하고, 용리제를 폐기하도록 지시하였으며, 상기 40-100분째의 것은 유리병 안으로 수집하였다. 수집된 용리제를 1시간 동안 회전식 증발기 상에서 건조시켜 아세토니트릴을 제거하였다. 잔류 액체는 동결건조기에서 증발시켰다.
매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석법 (
MALDI
-MS)에 의한 분석
샘플을 나노-순수 중에서 재구성하였다. 1 ㎕의 샘플을 스테인리스 스틸 MALDI 플레이트 상에 직접 플레이팅하였다. 여기에 0.3 ㎕의 0.01 M NaCl 및 0.7 ㎕의 25 mg/ml 2,5-디히드록시벤조산을 첨가하고, 피펫 팁 내에서 혼합하였다. 이어서, 샘플을 진공하에서 건조시켰다. 샘플을 브루커 울트라플렉스트렘(Bruker UltraFlextreme) MALDI-TOF/TOF 장치 상에서 진행시켰다. 장치를 양성 모드로 작동시켰고, 최대 레이저 출력의 95%를 이용하였다.
칩-
HPLC
-나노/
사중극자
비행 시간형
질량 분석법 (칩-
HPLC
-나노/Q-
TOF
MS)에 의한 분석
샘플을 나노-순수 중에서 재구성한 후, 칩-HPLC-나노/Q-TOF MS에 의해 분석하였다. 시스템은, 샘플 로딩을 위한 모세관 펌프 및 분석적 분리를 위한 나노 펌프인 2개의 펌프를 포함한다. 상기 시스템에서, 애질런트(Agilent) 1200 시리즈 HPLC를 칩 큐브 인터페이스를 통해 애질런트 6520 Q-TOF 질량 분석계에 커플링시킨다. 칩은 40 nl 농축 칼럼 및 75 ㎛ Х 43 mm 분석 칼럼을 함유하며, 상기 두 칼럼은 모두 PGC와 함께 패킹된 것이다. 3% (v/v) 아세토니트릴/물 + 0.1% 포름산을 이용하여 4 ㎕/min의 유속으로 샘플 로딩을 수행하였다. 이원 구배의 용매 A: (3% (v/v) 아세토니트릴/물 + 0.1 포름산) 및 용매 B: (90% 아세토니트릴/ 물 + 0.1% 포름산)를 이용하여 0.4 ㎕/min 유속으로 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 구배는 60분 동안 1% B에서 5% B로 2 min, 이어서, 5%에서 30%로 33 min, 이어서, 5 min에 걸쳐 30%에서 99%로, 이어서, 10 min 동안 99%에서 유지, 이어서, 99%에서 1%로 1 min, 이어서, 9 min 동안 1%에서 유지로 전개시킨 후, 다음 작업을 시작하였다.
데이터를 양성 모드로 수집하고, m/z 118.086 내지 2721.895 범위의 내부의 보정용 물질인 이온을 이용하여 보정하였다. 건조 가스를 325℃ 및 5 ℓ/min 유속으로 설정하였다. 단편, 스키머, 및 옥타폴(Octapole) 1 RF 전압을 각각 175, 60, 및 750 볼트로 설정하였다. 0.63 스펙트럼/초 속도로 단편화를 수행하였다. 충돌 에너지는 화합물 질량에 기초하였고, (충돌 에너지)=1.8*(m/z)-2.4로 표시하였다.
단당류 조성
건조된 버터넛 스쿼시 및 FITDOG 올리고당은 하기와 같이 단당류 조성을 갖게 되었다. 간략하면, 10 mg의 샘플을 138 ㎕의 나노-순수 중에서 재구성하였다. 대략 100 mg의 1.4 mm 스테인리스 스틸 비드를 첨가하고, 넥스트 어드밴스 스톰 24 불렛 블렌더(Next Advance Storm 24 Bullet Blender) (미국 뉴욕주 애버릴 파크)에서 2분 동안 비트 블래스팅하여 샘플을 가용화시키고, 100℃에서 1시간 동안 쿠킹하였다. 이어서, 68 ㎕의 진한 TFA를 첨가하여 4 M 용액을 제조하고, 100℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. ?칭하기 위해, 800 ㎕의 빙냉 나노-순수를 첨가하고, 용액을 1,000배로 희석시켰다. 50 ㎕의 희석된 용액을 진공하에서 건조시켰다. 이어서, 건조된 샘플을 3-메틸-1-페닐-2-피라졸린-5-온으로 유도체화하고, 건조시켰다. 이어서, 샘플을 나노-순수 중에서 재구성하고, 클로로포름으로 2회에 걸쳐 추출하고, 분석을 위해 수성층을 사용하였다. 애질런트 6495 QqQ MS와 커플링된 애질런트 1290 인피니티 II UHPLC(Agilent 1290 Infinity II UHPLC) 내로 샘플을 주입하였다. 분리는 애질런트 조르박스 이클립스 플러스(Agilent Zorbax Eclipse Plus) C18 칼럼 (2.1 mm Х 150 mm i.d., 1.8 ㎛ 입자 크기) 상에서 이루어졌다. 용매 시스템은 A: 5% 아세토니트릴/H2O 중 NH4OH를 사용하여 pH 8.2로 조정된 25 mM 아세트산암모늄으로 이루어졌다. 다른 모든 장치 파라미터는 하기와 같았다.
박테리아 소비
수개의 박테리아 종, 대개는 비피도박테리움 균주를 FITDOG 올리고당 풀을 대사시킬 수 있는 그의 능력에 대해 스크리닝하였다. 본 목표를 완수하기 위해, 후기 지수 증식기 동안 수확된 순수한 배양물을 사용하여 하기의 상이한 탄소원: 2% 글루코스 (양성 대조군), 2% 및 5% w/v의 버터넛 스쿼시 올리고당 (BSL)을 함유하는 기초 MRS 및 탄소 공급원을 함유하지 않는 (음성 대조군) 기초 MRS에 접종하였다. 배양물을 혐기성 조건하에 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션시키고, 매 30분마다 바이오테크 플레이트 판독기 모델 EON 120928C(Biotek plate reader Model EON 120928C) (바이오테크 인스트루먼츠 인크.(Biotek Instruments Inc.: 미국 버몬트주 위누스키))를 사용하여 성장에 대해 모니터링하였다. 30초 동안 진탕시킨 후, 600 nm에서 흡광도를 측정함으로써 성장 모니터링을 수행하였다.
결과
FITDOG
반응 조건의 최적화
상업적 크실로글루칸 (다당류) 표준을 이용하여 다양한 조건하에서 펜톤 반응을 최적화시켰다. 분석 규모의 FITDOG 방법을 이용하여 황산철(III) 및 과산화수소의 농도, 반응 시간, 온도, 반응 pH, 및 ?칭 NaOH 농도를 순차적으로 최적화시켰다. MALDI-TOF MS를 이용하여 올리고당 생성물을 모니터링하였다. MS 존재비를 이용하여 상대적인 올리고당 농도를 직접 수득하였다. MALDI TOF-MS 스펙트럼 (도 1)을 이용하여 각 생성물의 상대적인 존재비를 수득하였다.
1. Fe 2 (SO 4 ) 3 농도의 최적화
농도를 0.0065 nM 내지 65 nM로 달리하면서 황산철(III)을 최적화시켰다. 0.65 nM 미만일 때에는 올리고당 존재비가 관찰되지 않았다. 도 2에 제시된 바와 같이, 총 OS 존재비는 농도에 따라 증가하였다. 대략 10 nM Fe2(SO4)3 농도에서, 신호는 최대치에 도달하였고, 65 nM에서 약간 증가하였다. 이러한 이유에서, 후자의 농도를 제조에 사용하였다.
2. 완충제 pH의 최적화
아세트산나트륨 완충제를 사용하고, 1 pH 단위씩 증가시키면서 pH 2 내지 12에 상응하는 적절한 양의 산 및 염기 (아세트산 및 NaOH (aq))를 첨가하여 pH 조건을 최적화시켰다. pH 5 미만인 경우, 관찰가능한 양으로 제조되지 않았다. pH 5인 경우, 가장 큰 올리고당 존재비를 얻은 반면, 6을 초과한 경우에도 또한 존재비는 극소량의 존재비를 얻었다 (도 3). 그러므로, 본 발명자들은 최적의 값으로서 pH 5를 선택하였다.
3. 과산화수소 및 NaOH 농도
본 방법의 중요한 특징은 반응을 종결시키기 위해 염기성 NaOH 용액을 사용한다는 점이다. 본 단계는 풍부한 올리고당 생성물을 제조하는 데 중요하다. 조건을 최적화시키기 위해, NaOH 농도, H2O2 농도 및 올리고당의 존재비를 달리함으로써 전체 요인 설계를 사용하였다. NaOH의 농도는 0, 0.1, 1.0, 2.0, 및 3.0 M이었다. H2O2의 농도는 0.02, 0.12, 0.24, 및 0.48 M의 과산화수소였다. NaOH를 첨가하지 않았을 때에는 반응 혼합물 중 검출가능한 올리고당은 거의 없거나, 또는 전혀 없었다 (0.0 M, 도 4). 유사하게, H2O2 농도가 0.02 M 아래로 하락하였을 때, 검출가능한 올리고당은 관찰되지 않았다. 용액에 H2O2를 첨가하지 않았을 때, 검출가능한 올리고당 신호는 관찰되지 않았다 (도 4). 본 연구에 기초하여, 본 발명자들은 2.0 M의 NaOH 및 0.12 M의 H2O2가 매우 효과적이었다는 것을 발견하게 되었다.
4. 반응 시간 및 온도
또한 전체 요인 설계를 이용하여 시간 및 온도를 분석하였다. 0, 20, 40, 60, 및 120분인 시점을 조사하였다. 25, 50, 75, 및 100℃인 온도를 사용하였다. 75℃ 미만일 때에는 최소 올리고당 신호가 관찰되었다. 100℃ 및 반응 시간 20분일 때, 최고의 존재비가 관찰되었다 (도 5).
5. 다른 전이 금속의 효과
펜톤 타입의 반응은 Fe(III) Fe(II) 및 Cu(II) 함유 화합물을 이용하여 진행되는 것으로 나타났다. 앞서 최적화된 조건을 이용하여 황산철(III), 황산철(II), 및 염화구리(II)를 녹색 반으로 쪼개진 완두콩과 반응시켰다. 3개의 전이 금속 모두 올리고당을 생성시켰다 (도 6). 염화구리(II)는 높은 존재비로 길이가 3 내지 7개의 헥소스 길이인 올리고당을 생성시켰고, 여기서, Hex4가 가장 풍부한 올리고당이었다. 황산철(II) 또한 길이가 3 내지 7개의 헥소스 길이인 올리고당을 생성시켰지만, 염화구리(II) 샘플에서보다는 존재비는 10배 더 적었다. 황산철(III)은 길이가 3 내지 10개의 헥소스 길이인 올리고당을 생성시켰고, 여기서, 존재비는 염화구리(II)와 동일하거나, 또는 그보다 더 컸다. 상기 샘플은 또한 3개의 Hex3 이성질체, 및 2개의 Hex4 이성질체를 포함하는, 수개의 헥소스 이성질체를 생성시켰다. 본 데이터로부터 본 발명자들은 상이한 전이 금속 및 산화 상태가 다당류로부터 올리고당을 생성시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 본 발명자들은 또한 상이한 전이 금속이 상이한 올리고당 프로파일을 생성할 수 있으며, 이는 각각의 금속이 상이한 특이성을 갖고 있다는 것을 시사하는 것임을 발견하게 되었다.
펜톤
반응의 식품 다당류에의 적용
상이한 출발 다당류를 사용하였을 때 제조되는 올리고당의 유형을 알아보기 위해 수수, 병아리콩, 및 바나나 껍질을 FITDOG로 처리하였다. 앞서 기술된 방법을 사용하여 측정된 단당류 조성은 도 7에 제시되어 있다. 글루코스가 모든 식품에서 가장 풍부한 성분이지만, 바나나 껍질의 경우에는 크실로스 및 프럭토스의 존재비가 더 컸다. 병아리콩의 경우, 아라비노스 및 갈락토스의 존재비가 더 컸다. 수수는 주로 글루코스 (95.71%)를 함유하였다 (도 7). 이는 FITDOG로부터 유리된 헥소스 올리고당이 글루코스로 이루어진 것이라는 것을 시사하는 것이다.
액체 크로마토그래피-질량 분석법 크로마토그램은 3개의 다당류에 대한 결과를 요약한다 (도 8). 하기 표 1에는 피크가 그의 올리고당 조성과 함께 열거되어 있다. 각 크로마토그램은 피크 각각의 단당류 조성에 따라 상이한 뚜렷한 피크를 얻었다.
바나나 껍질 (상단 패널)은 주로 Hex3의 3개의 이성질체 (헥소스 삼당류 A, B, 및 S)를 포함하는 짧은 올리고머를 수득하였다. Hex 또는 헥소스는 글루코스 또는 프럭토스일 수 있지만, 글루코스일 가능성이 크다. 가장 풍부한 올리고당은 Hex5 (J)에 상응한다. Hex4 이성질체 또한 관찰된다 (F 및 H). 병아리콩은 Hex2HexA1 종 (D)을 갖는 것으로 나타났고, HexA는 헥수론산에 상응한다. 다른 풍부한 화합물 Hex4 (C, E, G), Hex5 (I), Hex6 (K), 및 Hex7 (N 및 P)이 관찰되었다. 수수 (하단 패널)는 낮은 존재비의 Hex3과 함께 Hex4 (C, E, 및 G)를 수득하였다. Hex5는 가장 큰 존재비를 갖는 종인 I에 상응하여 존재한 반면, K는 Hex6에 상응한다. L에서는 Hex5PentA1 (여기서, PentA는 펜투론산에 상응한다)로 구성된 혼합된 조합이 관찰되었다.
버터넛
스쿼시로부터의 올리고당의
프리바이오틱
활성
다양한 식품 다당류의 FITDOG로부터의 수개의 올리고당을 그의 프리바이오틱 활성에 대해 조사하였다. 버터넛 스쿼시로부터의 올리고당을 사용하는 예를 제공한다. 올리고당의 프로파일은 상기 수득된 것과 유사하였다. 본 실시예에서는, 버터넛 스쿼시의 펜톤 산화로부터 생성된 올리고당에서 B. 슈도카테눌라툼 MP80을 성장시켰다. 시험된 다른 균주와 달리, B. 슈도카테눌라툼 MP80은 2% 및 5% 버터넛 스쿼시 올리고당 용액, 둘 모두에서 성장할 수 있었다. 최종적으로 성장은 5% 용액 중에서 최대 OD 0.962에 도달하였다. 버터넛 스쿼시 올리고당에서의 성장이 음성 대조군 (최대 OD 0.378)보다 유의적으로 더 높았지만, 양성 대조군보다는 더 낮았다 (도 9). 다른 시험된 균주들은 버터넛 스쿼시 올리고당에서 성장하지 못하였는 바, 본 결과는 상기 올리고당이 특정 박테리아의 성장을 선택적으로 허용한다는 것을 나타내는 것이다.
표 1: 수개의 식품에 대해 FITDOG 처리하였을 때, 그로부터 관찰되는 가장 풍부한 화합물의 라이브러리. "X"는 화합물이 관찰된 식품을 표시하는 것이다.
실시예
2
하기 결과는 다당류의 복잡한 혼합물 및 순수한 다당류에서의 Fitdog 방법의 유용성을 예시한다. 다당류의 복잡한 혼합물은 버터넛 스쿼시를 포함한다 (3-200개로부터 올리고당이 제조된 것이라는 것에 주의한다 (도 29)). 본 방법은 효모 세포벽에 대해 사용될 수 있다 (도 28). 본 방법은 또한 크실란, 호밀 아라비노크실란, 리케난, 갈락토만난, 아밀로펙틴, 아밀로스, 람노갈락투로난 I, 크실로글루칸, 커들란, 갈락탄, 만난, 글루코만난, 낙엽송 아라비노갈락탄, 폴리갈락투론산, 이눌린을 비롯한, 정제된 다당류에 대해 작용한다 (도 10-24 및 27).
FITDOG 방법을 위해 상이한 금속이 사용되어 왔다. 그러한 금속으로는 Fe, Ni, Ca, Cu, 및 Mg를 포함한다. 이는 다양한 DP 분포를 갖는 올리고당을 생성한다 (도 25-26).
물질:
크실란, 호밀 아라비노크실란, 리케난, 갈락토만난, 아밀로스, 람노갈락투로난 I, 크실로글루칸, 커들란, 갈락탄, 만난, 글루코만난, 낙엽송 아라비노갈락탄, 폴리갈락투론산, 및 이눌린을 메가자임(Megazyme: 영국)으로부터 구입하였다. 아밀로펙틴은 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다.
아세트산나트륨, 과산화수소 (30% w/w), 수산화나트륨, 황산철(III) 오수화물, 황산철(II) 칠수화물, 황산구리(II) 칠수화물, 염화구리(I), 황산망가니즈(II), 황산코발트(II) 칠수화물, 황산마그네슘, 염화칼슘, 염화니켈(II), 및 빙초산 모두 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다.
방법:
올리고당 제조
빙초산을 이용하여 pH 5로 조정된 95% (v/v) 아세트산나트륨 완충제, 5% (v/v) 과산화수소 (30% w/w), 및 65 nM의, 연구 중인 금속 착물을 함유하는 용액을 제조하였다. 상기 혼합물을 와동시키고, 건조된 다당류 표준에 첨가하여 1 mg/ml의 최종 용액을 제조하였다. 반응물을 100℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 반응 후, 반응물 부피의 절반량의 2 M NaOH를 첨가하고, 와동시킨 후, 0.6%의, 초기 반응 부피의 빙초산을 첨가하여 중화시켰다.
올리고당 정제
비다공성 흑연화 탄소 카트리지 (GCC-SPE)를 이용하여 올리고당을 단리시켰다. 카트리지를 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA) 중 80% 아세토니트릴 및 나노-순수로 세척하였다. 올리고당을 로딩하고, 5 칼럼 부피의 나노-순수로 세척하였다. 0.05% (v/v) TFA와 함께 40% 아세토니트릴을 이용하여 올리고당을 용출시켰다.
본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 단지 예시를 위한 것이며, 그에 비추어 다양한 수정 또는 변형이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제안될 것이며, 이는 본 출원 및 첨부된 청구범위의 정신 및 범위 내에 포함되어야 함을 이해한다. 본원에서 인용되는 모든 공개문헌, 특허, 및 특허 출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
Claims (28)
- 반응 혼합물 중 다당류를 과산화수소 및 전이 금속 또는 알칼리 토금속과 반응시키는 단계; 이어서,
반응을 염기로 ?칭시키고/거나, 다당류 중의 글리코시드 연결을 염기로 절단하여 다당류로부터 올리고당의 혼합물을 생성하는 단계를 포함하는,
다당류로부터 올리고당을 생성하는 방법. - 제1항에 있어서, 반응 혼합물이 전이 금속을 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 전이 금속이 철 (예컨대, Fe3 +, Fe2 +), 구리 (예컨대, Cu2 +), 망가니즈, 코발트, 또는 몰리브데넘으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 반응 혼합물이 알칼리 토금속을 포함하는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 알칼리 토금속이 칼슘 또는 마그네슘으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 반응 혼합물 중 전이 금속이 적어도 0.65 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 반응 혼합물 중 전이 금속이 0.65 nM 내지 500 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 반응 혼합물 중 과산화수소가 적어도 0.02 M의 농도로 존재하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 반응 혼합물 중 과산화수소가 0.02 M 내지 1 M의 농도로 존재하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 염기가 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화칼슘인 방법.
- 제1항 또는 제10항에 있어서, 염기가 적어도 0.1 M의 농도로 존재하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제10항에 있어서, 염기가 0.1 M - 5.0 M의 농도로 존재하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 다당류가 아밀로스, 아밀로펙틴, 베타글루칸, 풀루란, 크실로글루칸, 아라비노갈락탄 I 및 아라비노갈락탄 II, 람노갈락투로난 I, 람노갈락투로난 II, 갈락탄, 아라비난, 아라비노크실란, 크실란, 글리코겐, 만난, 글루코만난, 커들란, 또는 이눌린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 다당류가 식물 또는 동물 공급원으로부터의 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 다당류가 박테리아, 진균 또는 조류 공급원으로부터의 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 다당류가 식물 물질 형태의 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 식물 물질이 바나나, 병아리콩 또는 수수 식물 물질인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고당의 혼합물로부터 하나 이상의 올리고당을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 반응 이전에, 다당류를 하나 이상의 다당류 분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 하나 이상의 다당류 분해 효소가 아밀라제, 이소아밀라제, 셀룰로스, 말타제, 글루카나제, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 올리고당의 혼합물, 또는 제18항의 정제된 하나 이상의 올리고당을 포함하는 조성물.
- 표 1의 올리고당, 또는 표 1의 2개 이상의 올리고당의 혼합물.
- 미생물을 프로바이오틱 미생물의 성장을 선택적으로 자극시키는 조건하에서 제21항의 올리고당의 혼합물을 포함하는 조성물, 또는 제22항의 혼합물의 올리고당과 접촉시키는 단계를 포함하는,
시험관내 또는 생체내에서 미생물의 성장을 자극시키는 방법. - 제23항에 있어서, 미생물이 프로바이오틱 미생물인 방법.
- 제24항에 있어서, 프로바이오틱 미생물이 동물의 장내 존재하고, 조성물이 동물에게 투여되는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 프로바이오틱 미생물이 동물에게 조성물과 별개로, 또는 조성물과 동시에 투여되는 것인 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 프로바이오틱 미생물이 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(Bifidobacterium pseudocatenulatum)인 방법.
- 제23항에 있어서, 미생물이 토양 미생물, 구강 미생물, 또는 피부 미생물인 방법.
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