CN106947004A - 一种低分子量肝素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低分子量肝素的制备方法,该方法通过超声、抗坏血酸和Fenton氧化反应联用,达到快速降解肝素的目的。超声能够强化Fenton反应中Fe3+的还原,还原生成的Fe2+可进一步与过氧化氢发生反应,产生羟基自由基;同时抗坏血酸亦可强化降解体系,促进肝素的降解。本发明所得的产品的重均分子量在4000‑5500Da,抗Xa因子活性为85‑105U/mg。
Description
技术领域
本发明涉及一种低分子量肝素的制备方法,特别涉及一种利用超声辅助氧化方法绿色、快速制备低分子量肝素的方法,属于多糖降解领域。
背景技术
肝素是一种由艾杜糖醛酸和葡萄糖胺组成的,具有双糖重复单元的长链粘多糖,属糖胺聚糖,且分子量在3-30kDa之间,重均分子量约15kDa左右。肝素首先发现于肝脏,也因此得名,广泛分布于在哺乳动物的组织中,如肝脏、肺、肠粘膜、心、脾脏、肾、胸腺等,其在医药方面作为抗凝血和抗血栓药物的应用备受关注。随着对其研究的不断深入,科学家还发现肝素具有抗炎、抗病毒、抗癌、调节血脂等诸多生物学功能。
低分子量肝素是通过对普通肝素降解得到的分子量较小的片段,具有生物利用率高、血浆半衰期长、口服易吸收、致出血倾向大大降低等诸多优点。目前常用的低分子量肝素制备方法包括肝素钠酶降解法、亚硝酸降解法、β-消除法、过氧化物降解法和过碘酸降解法,但由于酶法降解生产成本较高而缺乏竞争力,因此,市场上低分子量肝素制备多采用化学降解方法,易引起化学污染,且生产周期较长,如亚硝酸降解法在pH 2.3-3.0,需约3.5h的反应。该方法利用超声和抗化血酸催化Fe2+和过氧化氢的氧化反应,从而达到快速制备低分子量肝素的目的。
发明内容
本发明的目的在于改进目前低分子量肝素制备技术,提供了一种安全、快速的一种低分子量肝素的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种低分子量肝素的制备方法,包括以下步骤:
(1)取一定量的蒸馏水,加入适量HCl溶液调整PH在3-5之间,加入FeCl2·4H2O或FeSO4·7H2O和抗坏血酸,配置成含有1.0-5.0mmol/LFe2+和0.5-2.0mmol/L抗坏血酸的溶液A。
(2)取肝素溶于溶液A,使得肝素的浓度为4-20mg/mL,搅拌溶液至肝素完全溶解;
(3)将步骤2配置的肝素溶液转移至10-40℃环境中进行超声处理,超声强度为3-15W/mL,同时在溶液中加入8mol/LH2O2溶液,使金属离子与过氧化氢的摩尔比为1:10-1:25;
(4)超声处理后,加入亚硫酸氢钠,终止反应,然后通过阳离子交换树脂置换溶液中的金属离子;
(5)对步骤4处理后的溶液进行过滤,取滤液调整pH至5-8;
(6)将步骤5处理后的溶液转移至500Da的透析袋中,流水透析24h,纯水透析24h,透析后液体0.22μm的水膜,冻干,得到低分子量肝素。
进一步地,所述步骤1中,pH为3,Fe2+浓度为2mM,抗坏血酸浓度为1.0mmol/L。
进一步地,所述步骤3中,金属离子与过氧化氢的摩尔比为1:20。
进一步地,所述步骤5中,pH为6。
本发明所具备的优点:
1.本发明为肝素降解提供一种绿色、安全、快速降解方法,得率可达到75%以上,所得产品纯度较高、质量稳定、成本低。
2.降解工艺简单,反应时间短,所用树脂可重复利用,工艺条件环保无污染。
3.本发明所得的产品的重均分子量在4000-5500Da,抗Xa因子活性为85-105U/mg。
具体实施方式
本发明通过超声、抗坏血酸和Fenton氧化反应联用,达到快速降解肝素的目的。超声能够强化Fenton反应中Fe3+的还原,还原生成的Fe2+可进一步与过氧化氢发生反应,产生羟基自由基;同时抗坏血酸亦可强化降解体系,促进肝素的降解。羟基自由基造成肝素的氧化断裂,作用位点主要集中于未硫酸化的己糖醛酸,形成低分子量肝素。所得到的的肝素重均分子量在4000-5500Da,产物抗凝血保留,且副作用减小。
Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH- (1)
下面结合具体事例对本产品做进一步阐述。
实施例1:
(1)取30ml蒸馏水,加入3mol/L HCl溶液,调整PH至3,加入FeCl2·4H2O和抗坏血酸,配置成含有1mmol/L Fe2+和0.5mmol/L抗坏血酸的溶液A;
(2)取120mg/mL肝素溶解于30ml溶液中,搅拌充分溶解后,转移至超声管(内径3.4cm)中;
(3)将超声管置于10℃恒温槽中,并开启超声设备,同时加入8mol/LH2O2溶液,使金属离子与过氧化氢比为1:10,设置超声强度3W/mL,超声处理10min;
(4)超声处理后,加入过量亚硫酸氢钠,还原多余H2O2,终止反应;
(5)将终止反应后的溶液通过阳离子交换树脂,控制流速为0.5mL/min,充分置换其中的铁离子;
(6)将置换后的溶液过0.22μm的水膜,取滤液用2mol/LNaOH调整pH为6.0;
(7)将上述溶液转移至500Da的透析袋中,流水透析24h,纯水透析12h,后将其置于真空冷冻机中冻干。取肝素样品进行分子量及抗凝血活性测定,重均分子量为4876Da,抗Xa因子活性为96U/mg。
实施例2:
(1)取300ml蒸馏水,加入3mol/L HCl溶液,调整PH至3.5,加入FeCl2·4H2O和抗坏血酸,配置成含有3mmol/L Fe2+和1mmol/L抗坏血酸的溶液A;
(2)取3g肝素溶解于300ml溶液中,搅拌充分溶解后,转移至超声槽中;
(3)将其置于30℃恒温槽中,并开启超声设备,同时加入8mol/LH2O2溶液,使金属离子与过氧化氢比为1:18,设置超声强度10W/mL,超声处理10min;
(4)超声处理后,加入过量亚硫酸氢钠,还原多余H2O2,终止反应;
(5)将终止反应后的溶液通过阳离子交换树脂,控制流速为0.5mL/min,充分置换其中的铁离子;
(6)将置换后的溶液过0.22μm的水膜,取滤液用2mol/LNaOH调整pH为5;
(7)将上述溶液转移至500Da的透析袋中,流水透析24h,纯水透析12h,后将其置于真空冷冻机中冻干。取肝素样品进行分子量及抗凝血活性测定,重均分子量为4618,抗Xa因子活性为94U/mg。
实施例3:
(1)取3000ml蒸馏水,加入3mol/L HCl溶液,调整PH至5,加入FeCl2·4H2O和抗坏血酸,配置成含有5mmol/L Fe2+和2mmol/L抗坏血酸的溶液A;
(2)取60g肝素溶解于3L溶液中,搅拌充分溶解后,转移至超声槽中;
(3)将其置于30℃恒温槽中,并开启超声设备,同时加入8mol/LH2O2溶液,使金属离子与过氧化氢比为1:25,设置超声强度15W/mL,超声处理10min;
(4)超声处理后,加入过量亚硫酸氢钠,还原多余H2O2,终止反应;
(5)将终止反应后的溶液通过阳离子交换树脂,控制流速为0.5mL/min,充分置换其中的铁离子;
(6)将置换后的溶液过0.22μm的水膜,取滤液用2mol/LNaOH调整pH为8;
(7)将上述溶液转移至500Da的透析袋中,流水透析24h,纯水透析12h,后将其置于真空冷冻机中冻干。取肝素样品进行分子量及抗凝血活性测定,重均分子量为5319,抗Xa因子活性为89U/mg。
Claims (4)
1.一种低分子量肝素的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取一定量的蒸馏水,加入适量HCl溶液调整PH在3-5之间,加入FeCl2·4H2O或FeSO4·7H2O和抗坏血酸,配置成含有1.0-5.0mmol/LFe2+和0.5-2.0mmol/L抗坏血酸的溶液A。
(2)取肝素溶于溶液A,使得肝素的浓度为4-20mg/mL,搅拌溶液至肝素完全溶解。
(3)将步骤2配置的肝素溶液转移至10-40℃环境中进行超声处理,超声强度为3-15W/mL,同时在溶液中加入8mol/LH2O2溶液,使金属离子与过氧化氢的摩尔比为1:10-1:25。
(4)超声处理后,加入亚硫酸氢钠,终止反应,然后通过阳离子交换树脂置换溶液中的金属离子;
(5)对步骤4处理后的溶液进行过滤,取滤液调整pH至5-8;
(6)将步骤5处理后的溶液转移至500Da的透析袋中,流水透析24h,纯水透析24h,透析后液体0.22μm的水膜,冻干,得到低分子量肝素。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1中,pH为3,Fe2+浓度为2mM,抗坏血酸浓度为1.0mmol/L。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤3中,金属离子与过氧化氢的摩尔比为1:20。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤5中,pH为6。
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