CN109575156A - 一种低分子肝素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低分子肝素的纯化方法，将待纯化的低分子肝素溶解于纯化水中，加入阳离子交换树脂，形成混合液；搅拌形成的混合液，每隔固定的时间检测混合液pH值，直到pH值稳定，再继续搅拌半个小时；对搅拌液进行过滤，利用碱性物质将调节pH值至6‑8之间；进行浓缩；冷冻干燥，得到低分子肝素成品，本发明的技术原理是利用阳离子交换树脂吸附去低分子肝素中的糖丝氨酸和其他阳离子，如铵根或季铵离子和铁、镁等金属离子等，以获得稳定性高的低分子肝素，使用本发明的纯化方法生产低分子肝素，稳定性好，可长期存放，而且收率极高。
Description
技术领域
本发明涉及化工技术领域，具体为一种低分子肝素的纯化方法。
背景技术
自二十世纪三十年代起，普通肝素(UFH)就被用于血栓的预防和治疗。普通肝素是不同长度和分子量的硫酸粘多糖的混合物。随着分子大小的不同，其抗凝效果和药理学特性也有所差异。肝素主要来自于猪的小肠以及牛的肺组织。
低分子肝素(low-molecular-weight heparin，LMWH)是一类以普通肝素为起始物料经过分级或降解而得到的具有较低分子量的低聚糖混合物，它具有抗Xa活性，可抑制体内、体外血栓和动静脉血栓的形成，但不影响血小板聚集和纤维蛋白原与血小板的结合。低分子肝素最早于八十年代在欧洲应用于临床，由于在临床使用中具有比较明显的优势，如临床应用出血风险比普通肝素更低，LMWH逐渐取代了普通肝素的很多适应症，成为治疗或预防急性静脉血栓、急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物。
通过不同的解聚方法制成的不同品种的LMWHs，其药物动力学特性和抗凝活性有不同程度的差异，适应症也各不相同，在临床上不能相互代替，因此每种产品都可被认为是独一无二的。目前世界各地在用的LMWHs有：依诺肝素钠(enoxaparin),达肝素钠(dalteparin),那屈肝素钙(nadroparin),亭扎肝素钠(tinzaparin),舍托肝素钠(certoparin),瑞肝素钠(reviparin)，帕肝素钠(parnaparin)以及贝米肝素钠(bemiparin)等。
肝素和低分子肝素本身是稳定的，但由于普通肝素含有一定量的糖丝氨酸(glycoserine)和蛋白质，这类杂质在由普通肝素解聚制备的低分子肝素等肝素衍生产品中始终存在，由于含氨基物质的存在，低分子肝素原料和制剂的保存过程中，会发生复杂的美拉德反应(Maillard reaction)，美拉德反应又称为“非酶棕色化反应”，这是肝素类药品储存中发生颜色变化的主要原因之一，肝素类药品一旦发生颜色变化，将不能用于注射等医疗用途。法国赛诺菲-安万特公司专利EP1582531A1描述了一种通过强氧化剂消除糖丝氨酸的方法，但该方法反应条件剧烈，且易引入新杂质，存在明显的缺陷。
发明内容
针对背景技术中存在的问题，本发明提供了一种低分子肝素的纯化方法，采用易于工业化的方法，解决低分子肝素类药品的稳定性差的问题，尤其是变色问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种低分子肝素的纯化方法，包括以下步骤：
①、混合液制备：将待纯化的低分子肝素溶解于纯化水中，使得低分子肝素的浓度为1-8％(w/v)，加入阳离子交换树脂，形成混合液；
②、搅拌：搅拌由步骤①形成的混合液，每隔固定的时间检测混合液pH值，直到pH值稳定，再继续搅拌半个小时；
③、过滤：对步骤②的搅拌液进行过滤，利用碱性物质将调节pH值至6-8之间；
④、浓缩：对由步骤③得到的过滤液进行浓缩，浓缩浓度为12-20％，利用孔径为0.22微米的纤维素滤膜进行二级过滤；
⑤、冷冻干燥：对由步骤④得到的溶液进行冷冻干燥，得到低分子肝素成品。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤①中所述低分子肝素为重均分子量为2000-8000道尔顿的一类低分子肝素，为依诺肝素钠、那屈肝素钙、达肝素钠、贝米肝素钠中的至少一种。
作为本发明一种优选的技术方案，所述加入阳离子交换树脂的重量与低分子肝素的重量一样。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤③中所述的碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钙中的一种。
作为本发明一种优选的技术方案，所述阳离子交换树脂为Capto S，SP SepharoseFF，Toyopearl SP-650，Dowex 50wx8，Amberlite FPC22，Amberlite XAD4系列产品中的一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的技术原理是利用阳离子交换树脂吸附去低分子肝素中的糖丝氨酸和其他阳离子，如铵根或季铵离子和铁、镁等金属离子等，以获得稳定性高的低分子肝素。使用本发明的纯化方法生产低分子肝素，稳定性好，可长期存放，而且收率极高。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明提供一种依诺肝素钠的纯化方法，具体操作步骤如下：(1)、将100g依诺肝素钠粗品用2L纯化水溶解(浓度w/v＝5％)，然后加入100g预处理的Dowex 50wx8树脂(H型)，缓慢搅拌。
(2)、搅拌过程中，每隔5分钟检测溶液pH值，直至pH不再降低，继续搅拌30分钟，然后过滤，移除离子交换树脂，滤液用氢氧化钠溶液调节pH至6-8。
(3)、将步骤(2)得到溶液进行纳滤浓缩，至浓度为12-20％(按初始依诺肝素钠投料量计算)，然后用0.22微米的纤维素滤膜进行2级过滤。
(4)、将步骤(3)得到的澄清溶液进行冷冻干燥，得到依诺肝素钠精品。
将经过Dowex 50wx8处理前后的依诺肝素钠样品置于稳定性试验箱中，进行40℃加速试验，30天后，取样按中国药典测试澄清度和颜色，结果完全符合欧洲药典要求，具体结果总结如下：
实施例二：
本发明提供一种依诺肝素钠的纯化方法，具体操作步骤与实施例一类同，不同之处在于将Dowex 50wx8树脂(H型)替换成SP Sepharose FF树脂(H型)，将经过SP SepharoseFF处理前后的依诺肝素钠样品置于稳定性试验箱中，进行40℃加速试验，30天后，取样按中国药典测试澄清度和颜色，结果完全符合欧洲药典要求，具体结果总结如下：
实施例三：
本发明提供一种那屈肝素钙的纯化方法，具体操作步骤如下：(1)、将100g那屈肝素钙粗品用2L纯化水溶解(浓度w/v＝5％)，然后加入100g预处理的Dowex 50wx8树脂(H型)，缓慢搅拌。
(2)、搅拌过程中，每隔5分钟检测溶液pH值，直至pH不再降低，继续搅拌30分钟，然后过滤，移除离子交换树脂，滤液用氢氧化钙溶液调节pH至6-8。
(3)、将步骤(2)得到溶液进行纳滤浓缩，至浓度为12-20％(按初始那屈肝素钙投料量计算)，然后用0.22微米的纤维素滤膜进行2级过滤。
(4)、将步骤(3)得到的澄清溶液进行冷冻干燥，得到那屈肝素钙精品。
将经过Dowex 50wx8处理前后的那屈肝素钙样品置于稳定性试验箱中，进行40℃加速试验，30天后，取样按中国药典测试澄清度和颜色，结果完全符合欧洲药典要求，具体结果总结如下：
实施例四：
本发明提供一种那屈肝素钙的纯化方法，具体操作步骤与实施例三类同，不同之处在于将Dowex 50wx8树脂(H型)替换成Amberlite FPC22H树脂(H型)，将经过SPSepharose FF处理前后的那屈肝素钙样品置于稳定性试验箱中，进行40℃加速试验，30天后，取样按中国药典测试澄清度和颜色，结果完全符合欧洲药典要求，具体结果总结如下：
实施例五：
本发明提供一种达肝素钠的纯化方法，具体操作步骤如下：(1)、将100g达肝素钠粗品用2L纯化水溶解(浓度w/v＝5％)，然后加入100g预处理的Capto S树脂(H型)，缓慢搅拌。
(2)、搅拌过程中，每隔5分钟检测溶液pH值，直至pH不再降低，继续搅拌30分钟，然后过滤，移除离子交换树脂，滤液用氢氧化钠溶液调节pH至6-8。
(3)、将步骤(2)得到溶液进行纳滤浓缩，至浓度为12-20％(按初始达肝素钠投料量计算)，然后用0.22微米的纤维素滤膜进行2级过滤。
(4)、将步骤(3)得到的澄清溶液进行冷冻干燥，得到达肝素钠精品。
将经过Capto S处理前后的达肝素钠样品置于稳定性试验箱中，进行40℃加速试验，30天后，取样按中国药典测试澄清度和颜色，结果完全符合欧洲药典要求，具体结果总结如下：
实施例六：
本发明提供一种贝米肝素钠的纯化方法，具体操作步骤如下：(1)、将100g达肝素钠粗品用2L纯化水溶解(浓度w/v＝5％)，然后加入100g预处理的Toyopearl SP-650树脂(H型)，缓慢搅拌。
(2)、搅拌过程中，每隔5分钟检测溶液pH值，直至pH不再降低，继续搅拌30分钟，然后过滤，移除离子交换树脂，滤液用氢氧化钠溶液调节pH至6-8。
(3)、将步骤(2)得到溶液进行纳滤浓缩，至浓度为12-20％(按初始贝米肝素钠投料量计算)，然后用0.22微米的纤维素滤膜进行2级过滤。
(4)、将步骤(3)得到的澄清溶液进行冷冻干燥，得到贝米肝素钠精品。
将经过Toyopearl SP-650处理前后的贝米肝素钠样品置于稳定性试验箱中，进行40℃加速试验，30天后，取样按中国药典测试澄清度和颜色，结果完全符合欧洲药典要求，具体结果总结如下：
基于上述，本发明具有的优点在于：本发明的技术原理是利用阳离子交换树脂吸附去除低分子肝素中的糖丝氨酸和其他阳离子，如铵根或季铵离和铁、镁等金属离子等，以获得稳定性高的低分子肝素，使用本发明的纯化方法生产低分子肝素，稳定性好，可长期存放，而且收率极高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种低分子肝素的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
①、混合液制备：将待纯化的低分子肝素溶解于纯化水中，使得低分子肝素的浓度为1-8％(w/v)，加入阳离子交换树脂，形成混合液；
②、搅拌：搅拌由步骤①形成的混合液，每隔一定的时间检测混合液pH值，直到pH值稳定，再继续搅拌0.5-1小时；
③、过滤：对步骤②的搅拌液进行过滤，利用碱性物质将pH值调节至6-8之间；
④、浓缩：对由步骤③得到的过滤液进行浓缩，浓缩浓度为12-20％，利用孔径为0.22微米的纤维素滤膜进行过滤；
⑤、冷冻干燥：对由步骤④得到的溶液进行冷冻干燥，得到低分子肝素成品。
2.根据权利要求1所述的一种低分子肝素的纯化方法，其特征在于：所述步骤①中所述低分子肝素为重均分子量为2000-8000道尔顿的一类低分子肝素，为依诺肝素钠、那屈肝素钙、达肝素钠、贝米肝素钠中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种低分子肝素的纯化方法，其特征在于：所述加入阳离子交换树脂的重量与低分子肝素的重量一样。
4.根据权利要求1所述的一种低分子肝素的纯化方法，其特征在于：步骤③中所述的碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钙中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种低分子肝素的纯化方法，其特征在于：所述阳离子交换树脂为Capto S，SP Sepharose FF，Toyopearl SP-650，Dowex 50wx8，Amberlite FPC22，Amberlite XAD4系列产品中一种或多种。
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