DE4242813A1 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft sulfatierte Polysaccharide, die durch Meeresalgen erzeugt werden, die zur Klasse der Rhodophyceae gehören, und welche ausgestattet sind mit einer antiviralen Breitspektrumaktivität gegen DNA- und RNA-Viren, einschließlich hunane und murine Retroviren und insbesondere gegen den Humanimmunschwächevirus (HIV). Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zu deren Extraktion und Reinigung sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend diese.

Meeresalgen sind bezüglich der antiviralen Aktivität untersucht worden, hauptsächlich gegen das Herpes simplex- Virus und Influenza-Virus (Deig, E.F. et al. (1974) Antimicrob. Ag. Chemother. 6: 524-525; Richards, J.T. et al. (1978) Antimicrob. Agents Chemother. 14: 24-30; Blunden, G. et al. (1981) Bot. Marina 24: 267-272). Untersuchungen an wäßrigen Extrakten zeigten an, daß die Wirkstoffe sulfatierte Polysaccharide waren, die dadurch wirkten, daß sie zur Virusadsorption nötige Rezeptorstellen blockierten oder überzogen (Ehresmann, D.W. et al. (1977) J. Phycol. 13: 37-40), wobei deren antivirale Aktivität hauptsächlich in Beziehung stand mit dem Sulfatierungsgrad der Polysaccharide (Ehresmann, D.W. et al. (1979) Hoppe, H.A., Levring, T. and Tanaka, Y. (Eds) Marine Algae in Pharmaceutical Science, W. de Gruyter, Berlin, New York, 293-302).

In neurer Zeit hat der dringende Bedarf nach einer wirksamem Chemotherapie für das erworbene Inmunschwächesyndrom (AIDS), das durch HIV hervorgerufen wird, die Suche nach selektiven anti-HIV sulfatierten Polysacchariden gesteigert; z. B. zeigten lambda­ Karrageenan, Dextransulfat und Pentosanpolysulfat anti-HIV- Aktivität.

Polysaccharide vom Agarose-Typ werden durch Meeresalgen erzeugt, die zur Klasse der Rhodophyceae (rote Algen) gehören. Unter den Rhodophyten sind einige Arten wie Ceramium, Gelidium und Gracilaria die Hauptquellen von Agars, einer Familie von Polysacchariden vom Agarose-Typ, die sich im Grad der Substitution durch Methoxyl-, Sulfat- und Pyruvatgruppen unterscheiden (Duckworth, M. and Yaphe, W. (1971) Carbohydr. Res. 16: 189-197).

Polysaccharide vom Agarose-Typ sind zusammengesetzt aus abwechselnden wiederkehrenden Einheiten von β(1→4)D- Galactose und α(l→3)L-Galactose, deren letzterer 4-O- gebundener Zucker üblich als 3,6-Anhydridform oder manchmal als L-Galactose-6-sulfat vorkommt, von dem angenommen wird, daß er die biologische Vorstufe des Anhydro-L-galactose- Restes ist (Araki, C. (1966) Proc. Int. Seaweed Symp. 5: 3). Das Molekül mit dem niedrigsten Substitutionsgrad wird als Agarose bezeichnet und weist das höchste Gelierungspotential aller Polysaccharide vom Agarose-Typ auf (Kennedy, J.F., Griffiths, A.J. and Atkins, D.P. (1984) G.O. Phillips, D.S. Wedlock and P.A. Williams (Eds) Gums and Stabilisers for the Food Industry, Pergamon Press, Oxford, Vol. 2, 417).

Agar bildet üblicherweise weiche Gele, die hauptsächlich bei der Herstellung mikrobiologischer Medien oder in der Nahrungsmittelindustrie Verwendung finden, wohingegen Agarose, die spröde Gele bildet, in erster Linie biochemische Anwendung findet (Mc Lachlan, J. (1985) Plant and Soil 89:137). Extrakte aus der Zellwand der Agarophyten bestehen aus der besonders wertvollen Komponente Agarose und aus einer geladenen (hauptsächlich sulfatierten) polysaccharidischen Fraktion, die im allgemeinen Agaropektin genannt wird: Bei der Herstellung von Agar wird die hochsulfatierte Fraktion, die in kaltem Wasser löslich ist, verworfen.

Die vorliegende Erfindung stellt sulfatierte Polysaccharide bereit, die aus Meeresalgen der Klasse der Rhodophyceae (rote Algen) erhältlich und mit antiviraler Aktivität ausgestattet ist.

Die sulfatierten Polysaccharide (nachfolgend bezeichnet als ASP), die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellen, weisen ein gemeinsames Rückgrat des Agaroid- Typs auf, das aus wiederkehrenden Einheiten von sich abwechselnder β(1→4)D-Galactose und α(1→3)L-Galactose zusammengesetzt ist. Insbesondere nachdem sie durch Anionaustauschchromatographie durch Anwendung eines ansteigenden Natriumchloridgradient zu einer homogenen Beschaffenheit gereinigt, erschöpfend gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet sind, weisen sie die folgenden Eigenschaften auf:

• a) Elementaranalyse: 20 bis 35 Gew.% Kohlenstoff, 3,2 bis 5,5 Gew.% Wasserstoff, weniger als 1 Gew.% Stickstoff und mehr als 8 Gew.% Schwefel, berechnet als wasserfreie Verbindung;
• b) Molekulargewicht bis zu 10 000 kDa, gemessen durch Hochleistungsgrößenausschlußchromatographie;
• c) löslich in Wasser, in wäßrigen Phosphatpuffern bei pH 1 bis 13 und in wäßrigen Lösungen, enthaltend bis zu 20 Vol.% eines wasserlöslichen Alkohols, jedoch unlöslich in Benzol, Chloroform, Ethylether und in wäßrig­ alkoholischen Lösungen, enthaltend mehr als 80 Vol.% Methyl- oder Ethylalkohol und 1 g/l Natriumchlorid;
• d) löslich in Wasser in der Gegenwart von Bariumchlorid, aber nach dreistündiger Hydrolyse bei 120°C in wäßriger 2M Salzsäure entsteht ein Niederschlag aus Bariumsulfat bei Zugabe von Bariumchlorid;
• e) mehr als 90 Mol-% der gesamten Monosaccharid- Einheiten sind Galactose- und 3,6-Anhydrogalactose-Reste, die unsubstituiert oder substituiert sind;
• f) mehr als 30 Mol-% der gesamten Monosaccharid- Einheiten bestehen aus 4-O-gebundenen α-L-Galactopyranosid- Resten, die Substituenten in den Positionen 2, 3 und/oder 6 tragen können;
• g) mehr als 40 Mol-% der gesamten Monosaccharid- Einheiten bestehen aus 3-O-gebundenen β-D-Galactopyranosid- Einheiten die Substituenten in den Positionen 2, 4 und/oder 6 tragen können;
• h) mehr als 40 Mol-% der gesamten Monosaccharid- Einheiten bestehen aus 4-O-gebundenen α-L-Galactopyranosid- Einheiten, die Substituenten in den Positionen 2, 3 und 6 tragen können, plus 4-O-gebundenen 3,6-Anhydro-α-L- galactopyranosid-Resten, die einen Substituenten in Position 2 tragen können;
• i) Pyruvat(1-Carboxyethyliden)-Gruppen, die als zyklische Ketale gebunden sind, welche O-4 und O-6 der β-D- Galactopyranosid-Reste verbrücken, kommen als Substituenten in weniger als 10 Mol-% der gesamten Monosaccharid- Einheiten vor;
• j) das Molverhältnis der Methylethergruppen- Substituenten pro Monosaccharid-Einheit übersteigt 0,3:1 nicht;
• k) Sulfat-Halbestergruppen können als Substituenten in den Positionen 2, 4 und 6 der β-D-Galactopyranosid- Reste, in den Positionen 2, 3 und 6 der α-L- Galactopyranosid-Reste und in der Position 2 der 3,6- Anhydro-α-L-galactopyranosid-Reste vorhanden sein, und der Gesamtgrad der Sulfatierung ist immer größer als 0,6; und
• l) der Beitrag der Sulfat-Halbestergruppen in Position(en) 2 und 4 zum Gesamtsulfatierungsgrad ist immer größer als 0,3; sowie pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

Das ASP und die Salze davon können in reiner Form bereitgestellt werden. Sie können isoliert werden. Vorzugsweise weist das ASP einen D.S. von annähernd 0,9± 0,1 auf. Die Galactose- und 3,6-Anhydrogalactose-Reste (e) können durch 1 bis 3 Substituenten substituiert sein. Die Substituenten können ausgewählt sein aus Sulfat-Halbester-, Methylether-, Pyruvat(1-Carboxyethyliden)- und Zuckergruppen. Die Reste (f) bis (h) können durch 1 bis 3 Substituenten substituiert sein, wobei die Substituenten wiederum ausgewählt sind aus Sulfat-Halbester-, Methylether-, Pyruvat(l-Carboxyethyliden)- und Zuckergruppen. Die Zuckergruppen können Galactose- und/oder Xylose-Reste sein.

Das Agaroidgerüst von ASP kann deshalb einige außerhalb der Kette liegende Galactose-Reste (bis zu 5 Mol-%) als Seitenketten-Einheiten tragen, und bis zu 10 Mol-% der 4-O- gebundenen α-L-Galactopyranose-Reste können durch 4-O- gebundene α-D-Galactopyranose-Einheiten ersetzt sein.

Spuren von Xylose, die im gereinigten ASP 5 Mol-% nicht übersteigen, werden häufig nachgewiesen. Falls vorhanden, kommt Xylose als Seitenketten-Einheiten vor und kann durch Oxidation (KJO₄), anschließende Reduktion (NaBH₄) und milde Hydrolyse (H⁺) eliminiert werden. Das Vorliegen von Xylose wird nicht als ein unterscheidendes Merkmal angesehen, da die biologischen Eigenschaften von ASP im wesentlichen unbeeinflußt bleiben in der Gegenwart oder Abwesenheit dieser Komponente.

ASP verhält sich wie eine relativ homogene chemische Entität, ist aber polydispers, mit einem Verhältnis MW/MN gewöhnlich größer als 2, und MP liegt im Bereich von 100 bis 300 kDa. MW bezeichnet das gewichtsmittlere Molekulargewicht. MN bezeichnet das zahlendurchschnittliche Molekulargewicht. MP bezeichnet das Molekulargewicht und Peak-Maximum. MP kann daher das Molekulargewicht der Fraktion bezeichnen, die die größte Konzentration an sulfatiertem Polysaccharid enthält, ermittelt durch Hochleistungsgrößenausschlußchromatographie. Die Fraktionen können zu diesem Zweck einem Assayverfahren durch das Resorcin-Schwefelsäure-Verfahren unterzogen werden.

Ein Polysaccharid der Erfindung oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon können durch ein Verfahren hergestellt werden, wobei man:

• 1) rote Algen, Rückstände aus der Herstellung von Agars oder ungereinigte Agars mit einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert;
• 2) den Extrakt einer Veredelungsbehandlung unterzieht und an einer Säule eluiert oder fraktioniert ausfällt, um so das genannte Polysaccharid zu erhalten; und
• 3) falls gewünscht, das so erhaltene Polysaccharid in ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon überführt.

Die sulfatierten Polysaccharide der vorliegenden Erfindung können daher isoliert werden, indem man direkt von roten Algen mit der Befähigung zur Erzeugung von Agarose, von Rückständen der Herstellung von Agars (wäßrige Extrakte) oder, noch in beträchtlichen Mengen vorliegend, von allgemein gebräuchlichen handelsüblichen Agars, die nicht umfänglich gereinigt worden sind, ausgeht. Vorzugsweise wird ASP erhalten aus Algen, die unter Ruhebedingungen oder, jedenfalls, aus Extrakten oder Agars gesammelt werden, die aus altem Algengewebe hergestellt sind.

Auch ist das in Stufe (1) angewandte wäßrige Lösungsmittel vorzugsweise eine wäßrige Lösung von Phosphatpuffer oder NaCl, und die in Stufe (2) angewandte Veredelungsbehandlung stellt mindestens eine Behandlung dar, ausgewählt aus Zentrifugation, Filtration, Fällung mit einem organischen Lösungsmittel, Dialyse, Lyophilisierung und Ultrafiltration.

In der vorliegenden Erfindung werden zwei verschiedene bevorzugte Verfahren zur Verfügung gestellt, die sich beide zur selektiven Extraktion und Reinigung von ASP aus Agarophyten, Agars oder Rückständen der Herstellung von Agars eignen und gezielt darauf abgestellt sind.

Das erste beruht auf einer Anionaustauschchromatographie und wird auf wäßrige Rohextrakte angewandt: Wenn man von Algen ausgeht, wird der an Luft getrocknete Seetang zu einem feinen Pulver gemahlen, mit Aceton gewaschen, luftgetrocknet und bei Raumtemperatur mit 0,01 M wäßrigem Phosphatpuffer, pH 6,9, enthaltend 0,01 M EDTA-Na₂ und 0,1 M NaCl, extrahiert, um so einen wäßrigen Extrakt zu erhalten, der durch Filtration durch Glaswolle und Zentrifugation geklärt wird. Desgleichen wird, wenn man von Rückständen der Herstellung von Agars ausgeht, ein ähnlicher wäßriger Extrakt erhalten und geklärt. Diese wäßrigen Extrakte werden im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, durch Zentrifugation geklärt, durch 80%iges (V/V) Methanol ausgefällt, in Wasser erneut aufgelöst, durch Zentrifugation geklärt, gegen destilliertes Wasser (Schnittmenbran: 10 kDa) dialysiert und lyophilisiert, un so "wäßrige Rohextrakte" zu erhalten. Wenn man von Agar ausgeht, wird dieses in wäßrigem 0,05 M NaCl suspendiert und auf eine bei 30°C themostatisierte, ummantelte Säule gegossen. Durch eine peristaltische Pumpe und einen Außenbehälter, enthaltend weitere 0,05 M NaCl-Lösung, wird das Eluierungsmittel erschöpfend rezirkuliert. Das Eluat wird eingeengt und gefriergetrocknet, um so einen wäßrigen Rohextrakt aus Agar zu erhalten. Ein jeder der oben beschriebenen wäßrigen Rohextrakte wird in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, aufgelöst und auf eine Fractogel TSK DEAE-650M-Säule oder auf eine entsprechende Säule gegeben, welche in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, äquilibriert sind. Es wird eine Gradientelution, vom Ausgangspuffer bis zu einem 2 M NaCl in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, bei Raumtemperatur durchgeführt. Die eluierten Fraktionen werden gesammelt und sowohl bezüglich des Gesamtkohlenhydratgehalts (Phenol- Schwefelsäure-Verfahren) als auch der in-vitro-Aktivität gegenüber durch HSV-1 infizierten Zellen einem Monitorverfahren unterzogen. Die aktiven Fraktionen, die im allgemeinen im Bereich von 1 bis 1,5 M NaCl-Konzentrationen eluiert werden, werden zusammengefaßt, dialysiert oder ultrafiltriert (Schnittmembran: 10 kDa) und gefriergetrocknet, um so gereinigtes ASP zu erhalten.

Das zweite Verfahren der Extraktion und Reinigung von ASP beruht auf einer Fällung durch quaternäres Ammonium. Polyanionen sind aus wäßrigen Lösungen durch quaternäre Ammoniumdetergentien ausfällbar. Wir führten die fraktionierte Ausfällung sulfatierter Polysaccharide in einem definierten Bereich des Sulfatierungsgrades (D.S.) unter Verwendung von Cetyltrimethylammoniumbromid (CTA- Bromid, CTAB oder -Cetavlon-) durch, wobei Komplexe in Gegenwart unterschiedlicher Salz(NaCl)-Konzentrationen ausgefällt und/oder aufgelöst wurden. Das Ausgangsmaterial kann jede Quelle von "rohem wäßrigen Extrakt" von Agarophyten, Rückständen der Herstellung von Agars, namentlich "Agaropektinen", oder handelsüblichen Agars sein, wobei dieser Extrakt wie oben beschrieben erhalten wird. Wenn man von Agar ausgeht, kann dieses direkt mit wäßrigem 0,5 M NaCl bei Raumtemperatur unter Rühren extrahiert und dann durch Glaswolle filtriert werden. Andernfalls wird jeder "rohe wäßrige Extrakt" in wäßrigem 0,5 M NaCl aufgelöst. Wäßriges 6%iges (W/V) CTA-Bromid wird langsam der wäßrigen Lösung zugefügt, bis ein ausflockender Niederschlag von ASP-CTA gebildet wird. Das Vorhandensein von 0,5 M NaCl verhindert, daß Pektine und Polysulfate mit niedriger Ladungsdichte (D.S. <0,3) ausgefällt werden. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, in 4 M NaCl aufgelöst und durch Zentrifugation geklärt. Wasser wird langsam unter Vermischung zugefügt, bis die NaCl- Konzentration auf 1 M erniedrigt ist. Der homogene Niederschlag von ASP-CTA, der gebildet wird (D.S. <0,6), wird durch Zentrifugation gesammelt und in 4 M NaCl wieder aufgelöst. Methanol wird unter Rühren bis zu einer 84%igen (V/V) Konzentration zugefügt, um ASP als Natriumsalz auszufällen, wobei alles CTA und das meiste NaCl im Überstand verbleiben. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, in Wasser gelöst, durch Filtration vollständig geklärt und erneut durch 84%iges MeOH ausgefällt, um alles NaCl zu entfernen. Endwäschen mit 95%igem MeOH und 100%igem MeOH und Trocknung ergeben das gereinigte Natriumsalz von ASP.

Diese beiden Verfahren sind bevorzugt, das Zielprodukt ASP kann jedoch durch jedes andere Verfahren erhalten werden, das zur unterscheidenden Behandlung zwischen Polyanionen verschiedener Ladungsdichten befähigt und darauf gerichtet ist, nur Galactansulfatmoleküle mit einem D.S. größer als 0,6 zu sammeln.

Da sich das Zielprodukt als polydispers über einen MW- Bereich von 1 bis mehr als 5000 kDa erwies, untersuchten die hier auftretenden Erfinder den Einfluß der Kettenlänge auf die antivirale Aktivität von ASP.

Hochleistungsgrößenausschlußchromatographie wurde auf die wiederholte Sammlung von 18 ASP-Fraktionen unterschiedlichen Molkulargewichts angewandt, die durch Dialyse gewonnen, gefriergetrocknet und auf anti-HSV-1- Aktivität getestet wurden. Die Ergebnisse zeigten, daß, wie erwartet, die Aktivität mit Absinken des Molekulargewichts auch absinkt, aber, interessanterweise, sogar Fraktionen mit niedrigem M.W. (<10 kDa) besitzen noch inmer eine beachtliche Aktivität (HSV-1 CPE IC 50=0,6 bis 0,8 µg/ml); siehe Tabelle II.

Biologische Aktivität

Die antivirale Aktivität des oben beschriebenen Produkts ASP ist "in vitro" an respiratorischem syncytialen Virus, Semliki Waldvirus, Herpes simplex Virus vom Typ 1 (HSV-1) und Typ 2 (HSV-2) und Vaccinia Virus, gezüchtet in Monoschichten von Hep #2 Zellen, belegt worden; zusätzlich ist die antivirale Aktivität an AO Influenza Virus, gewachsen in Monoschichten von BHK 21 Zellen, an Moloney Sarcoma Virus (MSV) in Kulturen von murinen Balb/3TR Zellen und am Humanimnunschwächevirus (HIV) in Kulturen primärer humaner Lymphozyten beobachtet worden.

Die nachfolgend angegebenen Ergebnisse betreffen biologische Assayverfahren an ASP, Los 8682/54, es wurden jedoch fast identische Ergebnisse für jedes weitere Los von getestetem ASP erhalten.

Tabelle III zeigt die antivirale Aktivität von ASP gegen DNA-Viren, bewertet als TC IC50, CPE IC50 und als Selektivitätsindex (SI), welcher das Verhältnis von Zytotoxizität (TC IC50) zur Aktivität (CPE IC50) ist. Die Tests wurden im Vergleich zu Dextransulfat (M.W.: 8 kDa), einem bekannten sulfatierten Polysaccharid, das mit einer antiviralen Breitspektrumaktivität ausgestattet ist, durchgeführt. Die experimentellen Daten zeigen an, daß ASP in Gewebekulturen gut ertragen wird. Die TC IC50 an HEp2 Zellen ist 742 µg/ml, wohingegen CPE IC50 im Bereich von 0,1 bis 7,1 µg/ml liegt. ASP ist offenbar aktiver als Dextransulfat an allen getesteten Viren.

Ein Vergleich der antiviralen Aktivität von ASP an RNA- Viren mit derjenigen von Dextransulfat ist in Tabelle IV angegeben. Diese Ergenisse zeigen an, daß ASP ein besseres Leistungsvermögen als Dextransulfat auch gegen RNA-Viren besitzt. Dies wird auch durch die Meßergebnisse in Tabelle V bestätigt, die infektiöse Viren betreffen.

Die Wirksamkeit von ASP, Dextransulfat und Pentosanpolysulfat gegen MSV ist offenbar nahezu dieselbe (Tabelle VI). ASP zeigt auch eine beachtliche Aktivität gegen HIV (Tabelle VII).

In vorläufigen "in vivo"-Tests, ausgeführt an Mäusen, i.p. infiziert mit HSV-1, wurde ASP (25 bis 50 mg/kg) mit Acyclovir (25 oder 50 oder 100 mg/kg) verglichen. Die Ergebnisse zeigten, daß ASP, verabreicht (wie Acyclovir) zweimal täglich 3 Tage lang auf i.p. Wege, mindestens so wirksam wie die Vergleichsverbindung war. In vorläufigen Toxizitätstests der vorliegenden Substanz, in denen ASP auf i.v. Wege in einer Dosis von 50 mg/kg CD-1 Mäusen (männlich und weiblich) verabreicht wurde, blieben alle Mäuse im Beobachtungszeitraum von vierzehn Tagen nach Verabreichung am Leben. Auf der Grundlage dieser Behandlungsverfahren zeigte ASP keine signifikante Aktivität am peripheren und zentralen Nervensystem (Irwin′s Test). Kein Gegeneffekt wurde beobachtet, als Mäuse mit ASP zweimal täglich 3 Tage lang auf i.p. Wege mit einer Dosis von 50 mg/kg behandelt wurden. ASP ist ein sicheres Material, das eine niedrige Toxizität aufweist.

Verwendung

ASP oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon eignen sich für Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie. ASP weist antivirale Aktivität auf. ASP oder ein Salz davon können gegen DNA- und RNA-Viren, einschließlich menschlicher und muriner Retroviren, bei Menschen und anderen Säugetieren, z. B. gegen jene oben genannten Viren verwendet werden. Angesichts der Aktivität von ASP oder eines Salzes davon gegen HIV können ASP oder eines seiner Salze zur Behandlung von AIDS, AIDS-bezogenem Komplex und verwandten Syndromen verwendet werden. ASP oder ein Salz davon können verwendet werden, um den Zustand eines Patienten zu verbessern, wie eines menschlichen Patienten, der mit einem Virus infiziert ist. ASP ist ein sicheres Material, das nur niedrige Toxizität aufweist. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, enthaltend einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein entsprechendes Verdünnungsmittel sowie, als aktiven Bestandteil, ASP oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

Die bevorzugte Verabreichungsform von ASP an Mensch und Tiere als ein antivirales Arzneimittel ist der parenterale Weg, bevorzugter durch langsame i.v. Infusion. Die Dosierungsmenge von ASP gemäß der vorliegenden Erfindung ist variabel, abhängig davon, ob das Subjekt Mensch oder Tier ist, und von solchen Faktoren wie Alter, individuelle Unterschiede, Krankheitszustand usw., üblicherweise beträgt aber die Dosis beim Menschen 0,05 bis 5 mg/kg pro Tag, und diese Menge von ASP wird in eins bis drei Anteilen verabreicht. ASP kann auch mit geeigneten Hilfsstoffen kombiniert und in einer pharmazeutischen Formulierung für die Haut verabreicht werden.

Bei Verwendung von ASP als antivirales Arzneimittel kann es in Form der freien Säure oder in der Salzform vorliegen, z. B. Natrium, Kalium, Calcium und dgl., üblich und bevorzugt in der Form des Natriumsalzes. ASP kann in jeder gewünschten Form der Herstellung angeboten werden. Im Falle einer Injektion kann die Zusammensetzung solche Additive wie Stabilisierungsmittel, Puffermittel, Konservierungsmittel, isotonisierende Mittel usw. enthalten, und sie wird in Form einer Einheitsdosisampulle oder in Mehrfachdosisbehältern angeboten. Die Zusammensetzung kann die Form einer wäßrigen Lösung, einer Suspension, einer Lösung, einer Emulsion in einem oleaginosen oder wäßrigen Träger und dgl. annehmen. Die Präparation, die ASP als aktives Arzneimittel enthält, kann auch ein Pulver sein, das bei Gebrauch in einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie pyrogenfrei sterilisiertem Wasser oder Kochsalzlösung zu einer therapeutisch wirksamen Konzentration wieder aufgelöst wird.

ASP kann auch in Kombination mit einem oder mehreren weiteren bekannten antiviralen Arzneimitteln wie AZT, Acyclovir usw. ohne Erniedrigung der normalen Wirksamkeit verwendet werden. Eine solche kombinierte Verwendung ist in der Tat ein wirksames Mittel zur Behandlung der Krankheiten.

Die folgenden Präparationen und Beispiele erläutern die Erfindung. In den beigefügten Zeichnungen ist folgendes dargestellt:

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der DEAE-Chromatographie von AP1-Los 8682/36 (...) und ASP-Los 8682/54 (...). Die Elution erfolgte mit 70 ml/h unter Anwendung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, und eines Natriumchloridgradient (...). Auf der x-Achse ist das Volumen in ml angegeben. Auf der linksseitigen y-Achse ist die Absorption bei 485 nm angegeben. Auf der rechtsseitigen y-Achse ist die Natriumchloridkonzentration in M angegeben. Die Fraktionen wurden durch das Phenol-Schwefelsäure-Verfahren bestimmt.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Hochleistungsgrößenausschlußchromatographie von ASP-Los 8682/54. Auf der x-Achse ist das Molekulargewicht in kDa angegeben. Auf der y-Achse ist die Konzentration in Gew.% der Gesamtheit angegeben. Die Fraktionen wurden durch das Resorcin-Schwefelsäure-Verfahren bestimmt.

Die Fig. 3a und 3b zeigen die Infrarot-Spektren von ASP-Los 8682/54 bzw. ASP-Los 8682/54 als das Phenylcarbamoylderivat. Auf der x-Achse ist jeweils die Wellenzahl in cm^-1 aufgetragen.

Physiko-chemische Charakterisierungen von ASPs Die Elementaranalyse wurde wie üblich durchgeführt, mit der Schwefelbestimmung durch das Schoniger-Verfahren.

Der Neutralzuckergehalt wurde bestimmt durch ein Resorcin- Schwefelsäure-Verfahren (Monsigny, M., Petit, C. and Roche A.C. (1988) Anal. Biochem. 175: 525-530) und 3,6- Anhydrogalactose gemäß Yaphe and Arsenault (Yaphe, W. and Arsenault, G.P. (1965) Anal. Biochem. 13: 143-148).

Die Monosaccharid-Zusammensetzung wurde bestinmt nach saurer Hydrolyse (0,5 M TFA, 3 h, 130°C) sowohl durch Papierchromatographie (6:4:3 V/V/V n-Butanol:Pyridin:Wasser an Filtrak FN 11; Nachweis durch Anilinhydrogenphthalat, 5 min bei 105°C), durch Umkehrphasen-HPLC der Dansylderivate (Mopper, K. and Johnson, L. (1983) J. Chromatogr. 256: 27-38) als auch durch GC-Assay der Oximtrimethylsilylderivate (Vanlaeke, G., Cuppens, H., Leyssens, L. and Raus, J. (1989) J. of Pharm. and Biomed. Analysis 7: 1641-1649).

Die Isolierung von Galactose nach saurer Hydrolyse (0,5 M TFA, 3 h, 130°C), Neutralisation mit Bariumhydroxid und Einengung auf einen Sirup wurde durch Papierchromatographie unter Verwendung von Whatman 54 Filterpapier mit einem Butan-1-ol:Essigsäure:Wasser (4:1:5, Oberschicht)- Lösungsmittel durchgeführt. Das Verhältnis von D- zu L- Galactose wurde ermittelt durch das Verfahren von Schlegel (Schlegel, R.A., Gerbeck, C.M. and Montgomery, R. (1968) Carbohydr. Res. 7: 193-199), unter Verwendung von D- Galactoseoxidase von Sigma (Kat. Nr. G-3385).

Die Methylierungsanalyse wurde ausgeführt durch ein modifiziertes Hakomori-Verfahren (Harris, P.J., Henry, R.J., Blakeney, A.B. and Stone, B.A. (1984) Carbohydr. Res. 127: 59-73), reduktive Hydrolyse der permethylierten Polysaccharide (Stevenson, T.T. and Furneaux, R.H. (1991) Carbohydr. Res. 210: 277-298) und GLC-MS-Assay der teilmethylierten Aldononitrilderivate (Stortz, C.A., Matulewicz, M.C. and Cerezo, A.S. (1982) Carboydr. Res. 111: 31-39).

Die Infrarot-Spektren der ASPs wurden wie üblich aufgenommen unter Verwendung von KBr-Tabeletten. Zusätzlich wurden besser definierte Peaks, insbesondere im Bereich von 800 bis 850 cm^-1 in IR-Spektren der permethylierten (Harris, P.J., Henry, R.J., Blakeney, A.B. and Stone, B.A. (1984) Carbohydr. Res. 127: 59-73) oder perphenylcarbamoylierten (Hirase, S. and Watanabe, K. (1972) Bull. Chem. Soc. Japan 45: 1529-1533) Derivaten der ASPs erhalten.

Proton-entkoppelte 13C-NMR-Spektren von 50 mg/ml ASPs- Lösungen in D₂O bei 55°C wurden an einem Varian VRX-400-S Gerät bei 100,6 MHz mit einer Spektralweite von 24 KHz und einer Relaxationsverzögerung von 1,5 s aufgenommen.

Hochleistungsgrößenausschlußchromatographie (HPSEC)- Analysen von ASPs wurden an einem Hewlett-Packard 1090A Flüssigchromatograph, ausgerüstet mit einem Autosampler und Autoinjektor, durchgeführt. 25 µl von 10 mg/ml Lösungen von ASPs in der mobilen Phase wurden auf eine Shodex OHpak KB- 805 Säule (300×8 mm ID), versehen mit einer Shodex OHpak KB-800P Vorsäule (50×8 mm ID) und thermostatisiert bei 50.C, injiziert. Die mobile Phase, eine 10:90 (V/V) Mischung von Acetonitril:wäßriger 0,01 M Phosphatpuffer, pH 6,9, enthaltend 0,2 M NaCl, wurde mit 1 ml/min angeliefert, und es wurden Eluatfraktionen bekannter Größe gesammelt und bezüglich des Gesamtkohlenhydratgehalts durch ein Resorcin- Schwefelsäure-Mikroverfahren (Monsigny, M., Petit, C. and Roche A.C. (1988) Anal. Biochem. 175: 525-530) bestimmt.

Eine Serie von Keimlingen mit engen Molekulargewichtsverteilungen wurden zur Kalibrierung verwendet (Fishman, M.L., Damert, W.C., Phillips, J.G. and Barford, R.A. (1987) Carbohydr. Res. 160: 215-225).

Eine alkalische Behandlung von ASP, die darauf gerichtet war, alles alkali-labile Sulfat zu entfernen, wurde ausgeführt gemäß Rees (Rees, D.A. (1961) J. Chem. Soc. 5168-5171), und zwar wie folgt: 200 mg ASP wurden in 20 ml Wasser gelöst, es wurden 40 mg Natriumborhydrid zugefügt und das ganze zur Reduktion bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. 3 M NaOH (10 ml) wurden dann zusammen mit weiteren 100 mg NaBH₄ zugegeben und die Mischung 4 h lang bei 100°C unter mäßigem Rühren erhitzt. Die alkalische Lösung wurde unter Verwendung von Amberlite IR-200 (H⁺) Harz neutralisiert, erschöpfend gegen destilliertes Wasser dialysiert und das mit Alkali behandelte ASP schließlich durch Gefriertrocknung gewonnen.

Präparation A: Rohextrakt aus Gracilaria verrucosa, gesammelt im Februar

Gracilaria verrucosa, die zum Genus Gracilaria der Familie der Gracilariceae der Ordnung Gigartinales bei den Rhodophyceae gehört, wurde im Februar in der nördlichen Adria geerntet und sorgfältig vor Trockung an der Luft mit der Hand sortiert.

Der Seetang (200 g Trockengewicht) wurde zu einem feinen Pulver gemahlen, zweimal mit Aceton (jeweils 2 1, unter Rühren über Nacht) gewaschen, luftgetrocknet und in 3000 ml 0,01 M wäßrigem Phosphatpuffer, pH 6,9, enthaltend 0,01 M EDTA-Na₂ und 0,1 M NaCl, suspendiert. Die Extraktion wurde unter angemessenem Rühren bei Raumtemperatur über Nacht durchgeführt; die Seetangrückstände wurden durch Filtrieren über Glaswolle entfernt, das Filtrat im Vakuum auf ein Fünftel des ursprünglichen Volumens eingeengt und durch Zentrifugation weiter geklärt. Ausfällung aus dem blassen, gelbbraunen Überstand (600 ml) mit Methanol (2400 ml), Wiederauflösung in Wasser (500 ml), Zentrifugation, Dialyse gegen destilliertes Wasser und Lyophilisierung ergaben 25 g (Trockengewicht) Rohextrakt, bezeichnet mit E-GVF (Ausbeute 12,5% auf Trockengewichtsbasis; HSV-1 CPE IC50=4 µg/ml).

Präparation B: Rohextrakt aus Gracilaria verrucosa, gesammelt im September

Eine zweite Probe von Gracilaria verrucosa wurde im September in der nördlichen Adria geerntet und sorgfältig vor Trocknung an der Luft mit der Hand sortiert.

Der Seetang (200 g), verarbeitet wie beschrieben bei Präparation A, ergab 38 g Rohextrakt (E-GVS; Ausbeute 19% auf Trockengewichtsbasis; HSV-1 CPE IC50=8 µg/ml).

Präparation C: Rohextrakt aus Gracilaria dura

Gracilaria dura, die zum Genus Gracilaria der Familie der Gracilariceae der Ordnung Gigartinales bei den Rhodophyceae gehört, wurde im Sommer in der nördlichen Adria geerntet und sorgfältig vor Trocknung an der Luft mit der Hand sortiert.

Der Seetang (200 g), verarbeitet wie beschrieben bei Präparation A, ergab 35 g Rohextrakt (E-GD; Ausbeute 17,5% auf Trockengewichtsbasis; HSV-1 CPE IC50=6 µg/ml).

Präparation D: Rohextrakt aus Gelidium corneum

Gelidium corneum, die zur Familie der Gelidiaceae der Ordnung Gelidiales bei den Rhodophyceae gehört, wurde im Sommer in der nördlichen Adria geerntet und sorgfältig vor Trocknung an der Luft mit der Hand sortiert.

Der Seetang (200 g), verarbeitet wie beschrieben bei Präparation A, ergab 39 g Rohextrakt (E-GC; Ausbeute 19,5% auf Trockengewichtsbasis; HSV-1 CPE IC50=8 µg/ml).

Präparation E: Wäßriger Extrakt aus Agar

Agar (100 g von Bacto-Agar (TM) von Difco Laboratories, Michigan (USA)) wurde in 900 ml wäßrigem 0,05 M NaCl suspendiert und auf eine umnantelte Säule (50×5 cm I.D.) gegossen, die bei 30°C thermostatisiert war. Durch eine peristaltische Pumpe und einen äußeren Behälter, enthaltend weitere (500 ml) 0,05 M NaCl-Lösung, wurde das Eluierungsmittel bei 8 ml/min 7 h lang rezirkuliert, als die Rezirkulation abgeschaltet und frisches 0,05 M NaCl zugegeben wurden, bis 1600 ml Eluat gesammelt wurden. Das Eluat wurde eingeengt und gefriergetrocknet, was 15,9 g wäßrigen Extrakt (AE) (HSV-1 CPE IC50=8,6 µg/ml) ergab.

Beispiel 1: Reinigung von AE durch DEAE-Chromatographie

Aktives antivirales sulfatiertes Polysaccharid wurde aus wäßrigem Extrakt AE (Präparation E) durch DEAE- Chromatographie gereinigt. Für jeden Durchlauf wurden 3 g AE in 300 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, gelöst und auf eine 50×50 cm (1000 ml) Fractogel TSK DEAE-650M Säule, äquilibriert in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, gegeben. Eine Gradientelution, vom Ausgangspuffer bis 2 M NaCl in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, wurde bei 600 ml/h bei Raumtemperatur durchgeführt. Eluierte Fraktionen wurden gesammelt und sowohl bezüglich Gesamtkohlenhydratgehalt (Phenol-Schwefelsäure-Verfahren) als auch der in-vitro- Aktivität gegen HSV-1 infizierte Zellen einem Monitorver­ fahren unterzogen. Die aktiven Fraktionen, die im allgemeinen im Bereich von 1 bis 1,5 M in NaCl- Konzentrationen eluierten, wurden zusammengefaßt, dialysiert oder ultrafiltriert und gefriergetrocknet. Die Verarbeitung von AE (15,9 g) ergab 370 mg gereinigtes Produkt (Los 7987/44; D.S.=0,84; HSV-1 CPE IC50= 0,2 µg/ml).

Beispiel 2: Extraktion und Reinigung von sulfatierten Polysacchariden vom "Agaroid-Typ" mit einem D.S. <0,3 durch CTAB-Ausfällung (AP1)

454 g Bacto-Agar (TM), Difco, wurden in 6 1 wäßrigem 0,5 M NaCl, enthaltend 2 mM Natriumazid, suspendiert und 2 h lang bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Dem wäßrigen Extrakt (4400 ml), erhalten durch Filtration über Glaswolle, wurden 37 ml 5 M NaCl, 24 ml 2 M Natriumsulfat und 330 ml einer 6%igen (W/V) wäßrigen Lösung von CTAB unter Rühren zugefügt, wobei 30 min lang leicht erwärmt wurde (40°C), und man lief das ganze aggregieren, während es mindestens 2 h lang bei Raumtemperatur stand. Das Vorhandensein von 0,5 M NaCl verhinderte, daß Pektine und sulfatierte Polysaccharide niedriger Ladungsdichte (D.S.<0,3) ausgefällt wurden.

Der Niederschlag wurde durch kurze Zentrifugation gesammelt und in 640 ml 4 M NaCl gelöst, wobei bei 40°C über Nacht gerührt wurde. Die restliche Agarose und unlösliche Verunreinigungen wurden abzentrifugiert.

Natriumsulfat (28 ml, 2 M), CTAB (93 ml, 6%) und 4780 ml Wasser wurden nacheinander und langsam dem klaren Überstand (700 ml, aus der Wiederauflösung in 4 M NaCl) unter guter Vermischung zugefügt, wobei sich die Natriumchloridkonzentration auf 0,5 M erniedrigte und eine homogene Ausfällung begünstigt wurde. Nach Erwärmen (40°C, 30 min) unter Rühren und Stehen (2 h) bei Raumtemperatur wurde der Niederschlag gesamnelt durch Zentrifugation und in 430 ml 4 M NaCl (40°C, unter Rühren über Nacht) wieder aufgelöst.

Methanol (2350 ml) wurde langsam unter angemessenem Rühren der klaren Lösung (470 ml) zugefügt, um sulfatierte Polysaccharide als deren Natriumsalze auszufällen, wobei alles CTA und das meiste NaCl im Überstand (3000 ml, 84% MeOH) zurückblieben. Es wurde mindestens 2 h lang gerührt, als der Ionenaustausch bis zur Beendigung fortgeschritten war.

Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, in 220 ml Wasser (Gesamtvolumen 260 ml) gelöst, durch Filtration (0,45 µm) vollständig geklärt, und es wurde erneut in 84%igem MeOH (durch Zugabe von 1500 ml MeOH) ausgefällt, um alles NaCl zu entfernen. Endwäschen mit 95%igem MeOH (500 ml, zweimal) und 100%igem MeOH (400 ml, zweimal) und Trocknen ergaben die gereinigten Natriumsalze der sulfatierten Polysaccharide mit einem D.S.0,3 in 1,3% Ausbeute (6 g, Los 8682/36, oder "AP1"; D.S.=0,75; HSV-1 CPE IC50=0,2 µg/ml.

Beispiel 3: Präparation von "APS"

500 g "Agar Typ A" (Kat. Nr. A4550, Sigma Chemical Company, USA) wurden wie in Beispiel 2 beschrieben verarbeitet, was 4,6 g sulfatierte Polysaccharide (Los "APS"; D.S.=0,68; HSV-1 CPE IC50=0,4 µg/ml) ergab.

Beispiel 4: Präparation von "APA"

200 g "Agar-Agar" (Kat. Nr. 4 12 361, Carlo Erba, Italien) wurden fein pulverisiert und wie in Beispiel 2 beschrieben verarbeitet, indem alle Volumina herabgesetzt wurden, um dasselbe Verhältnis zwischen der Menge des Ausgangsmaterials und den Reaktionsteilnehmern aufrechtzuerhalten, was schließlich 2,8 g sulfatierte Polysaccharide (Los "APA"; D.S.=0,70; HSV-1 CPE IC50= 0,2 µg/ml) ergab.

Beispiel 5: Präparation von ASP-Los 7987/52B und Charakterisierungen

100 mg Los AP1 (Beispiel 2) wurden einer DEAE- Chromatographie unterzogen. Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde in herabgesetztem Maßstab durchgeführt, um eine 1,6×19 cm (40 ml) Säule zu verwenden. Das Elutionsprofil (feste Linie in Fig. 1) führte das Vorhandensein von zwei verschiedenen Arten sulfatierter Polysaccharide bei AP1 ans Licht, die definierte und unter­ schliedliche Ladungsdichten aufwiesen: "Peak A" (Los 7987/52 A; D.S.=0,38; HSV-1 CPE IC50 <20 µg/ml) und "Peak B" (Los 7987/52 B; D.S.=0,91; HSV-1 CPE IC50= 0,2 µg/ml).

Es sollte angemerkt sein, daß:

• - "Peak A" und "Peak B" müssen, da sie als Peaks eluiert wurden, die eigentlich getrennt sind zur Basislinie unter konstantem Gradient von NaCl, als Verbindungen unterschiedlicher Art betrachtet werden, und nicht als Teile eines einzigen Bereichs von Polysacchariden, die kontinuierlich bezüglich der Ladungsdichte schwanken.
• - "Peak B" (D.S.=0,91) ist hochaktiv gegen HSV-1, wohingegen "Peak A" (D.S.=0,38) inaktiv ist.
• - Beide weisen einen ähnlichen Molgehalt an Glactose (durch PC, HPLC und GC), wenig 3,6-Anhydrogalactose (bestimmt gemäß Yaphe, W. and Arsenault, G.P. (1965) Anal. Biochem. 13: 143-148), ein gemeinsames Rückgrat, das hauptsächlich aus wiederkehrenden Einheiten von sich abwechselnder β(1→ 4)D-Galactose und α(1→3)L-Galactose besteht (13C-NMR), und ein ähnliches HPSEC-Profil (Mp ca. 190 kDa) auf.
• - Die IR-Spektren der phenylcarbamoylierten oder methylierten Derivate der beiden Substanzen zeigten hinreichende Auflösungen im Bereich im von 800 bis 850 cm^-1 und erlaubten die Zuordnung der meisten, wenn nicht aller, Substitution durch Sulfat-Halbestergruppen in "Peak A" zu Galactose-6-sulfat (820 cm^-1), während Galactose-6-sulfat (820 cm^-1) und Galactose-2-sulfat (840 cm^-1), möglicherweise plus Galactose-4-sulfat (850 cm-1, Schulter), im "Peak B" nachgewiesen wurden. Ihre 13C-NMR- Spektren stimmten mit diesen Beobachtungen überein.
• - Als die alkalische Behandlung durchgeführt wurde, um alkali-labile Sulfatgruppen (nämlich 6-Sulfat) zu entfernen, ergab "Peak B" ein Produkt, das eine gewisse anti-HSV-1-Aktivität (CPE IC50=0,8 µg/ml) und alkali­ stabile Gruppen (2- und, möglicherweise, 4-Sulfat; D.S.= 0,47) beibehielt, wohingegen "Peak A" alle Sulfatgruppen verlor.

Beispiel 6: Präparation von ASP-Los 8682/54

Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde leicht modifiziert: Die zweite Ausfällung von sulfatierten Polysacchariden mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) wurde in der Gegenwart von 1 M NaCl (anstatt von 0,5 M NaCl) durchgeführt, wodurch verhindert wurde, daß sulfatierte Polysaccharide mit einem D.S. <0,6 ausgefällt wurden, um ein nur als "Peak B" codiertes ASP zu sammeln.

Wäßrige Extraktion aus Agar, erste Fällung mit CTAB in 0,5 M NaCl und Auflösung in 4 M NaCl wurden genau wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, ausgehend von 454 g Bacto-Agar (TM), Difco.

Natriumsulfat (14 ml, 2 M), CTAB (46 ml, 6%) und 2040 ml Wasser wurden nacheinander und langsam dem klaren Überstand (700 ml, aus der Wiederauflösung in 4 M NaCl) unter guter Vermischung zugefügt, wobei sich die Natriumchloridkonzentration herab auf 1 M erniedrigte und eine homogene Ausfällung begünstigt wurde. Nach Erwärmen (40°C, 30 min) unter Rühren und Stehen (2 h) bei Raumtemperatur wurde der Niederschlag, der aufwärts zentrifugiert, gesammelt und in 300 ml 4 M NaCl wieder aufgelöst (40°C, unter Rühren über Nacht).

Methanol (1685 ml) wurde langsam unter angemessenem Rühren der klaren Lösung (315 ml) zugefügt, um sulfatierte Polysaccharide als ihre Natriumsalze auszufällen, wobei alles CTA und das meiste NaCl im Überstand (2000 ml, 84% MeOH) verblieben. Es wurde mindestens 2 h lang gerührt, als der Ionenaustausch bis zur Beendigung fortgeschritten war.

Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, in 150 ml Wasser aufgelöst (Gesamtvolumen 180 ml), vollständig durch Filtration (0,45 µm) geklärt, und es wurde erneut in 84%igem MeOH (durch Zugabe von 1000 ml MeOH) ausgefällt, um alles NaCl zu entfernen. Endwäschen mit 95%igem MeOH (350 ml, zweimal) und 100%igem MeOH (300 ml) und Trocknen ergaben die gereinigten Natriumsalze von sulfatierten Polysacchariden mit einem D.S. 0,6 in 1,0% Ausbeute (4,4 g, Los 8682/54; D.S.=0,85; HSV-1 CPE IC50= 0,2 µg/ml).

Charakterisierungsbeispiel von ASP-Los 8682/54

Anmerkung: Falls nichts anderes angegeben wird, werden die Gehalte der Substituenten oder Monosaccharid-Reste nachfolgend in Mol-% ausgedrückt.

ASP-Los 8682/54 (Beispiel 6) weist einen D.S.=0,85, einen 3,6-Anhydrogalactose-Gehalt von 10,4% und 8,1% (bezogen auf Gewicht) an Wasser auf (Tabelle I). Es ist als Natriumsalz erhalten worden (Na: 7,5% Gew.%), befreit von überschüssigem Natriumchlorid (Cl: 0,1 Gew.%) in den letzten Herstellungsstufen.

Neben Zersetzungsprodukten der Säure-labilen 3,6- Anhydrogalactose wurde nur Galactose als Zuckerbestandteil in den Hydrolysaten nachgewiesen (gefunden: 58 Gew.%; berechnet: 59 Gew.%). Als Galactose aus den Hydrolysaten isoliert wurde, zeigte sie niedrige, positive Werte der spezifischen optischen Rotation, was einen Überschuß des D- Isomers anzeigt. Das Vorliegen des L-Isomers wurde durch die negativen Werte von (α)D bestätigt, gemessen nach Behandlung der isolierten Probe von Galactose mit D- Galactoseoxidase.

ASP-Los 8682/54 ist polydispers, wie gezeigt durch das HPSEC-Profil (Fig. 2), mit einem Mp im Bereich von 150 bis 240 kDa.

Das Infrarotspektrum des Produkts (3a) zeigte Absorptionen, die typisch sind für Sulfatester (1420 (w), 1370 (w) und 1250 cm^-1, zusammen mit einer unaufgelösten 800 bis 850 cm^-1 Bande) und für 3,6-Anhydrogalactose (930 cm^-1). Einige Information über die Stellen der Sulfatierung wurde erhalten aus dem IR-Spektrum von phenylcarbamoyliertem ASP- Los 8682/54 (Fig. 3 b), das zwei größere Banden bei 840 cm^-1 (2-Sulfat) und 820 cm^-1 (6-Sulfat) - letztere verstärkt durch eine Schulter bei 810 cm^-1 (3,6- Anhydrogalactose-2-sulfat) - und eine schwache Bande bei 850 cm^-1 (4-Sulfat), aber keine Absorption bei 860 cm^-1 (3- Sulfat) zeigte.

Der negative Wert der spezifischen optischen Rotation von ASP-Los 8682/54 ((α)D25: -15°; c=1,0, Wasser; konstant im Bereich von 20 bis 60°C) ist konsistent mit einem Agaroid­ gerüst, nämlich sich abwechselnden 3-O-gebundenen β-D- Galactopyranosyl-Resten und 4-O-gebunden α-L- Galactopyranosyl-Resten, und es unterscheidet sich somit von Karrageenanen, die positive Rotationen zeigen. Der niedrige, negative Wert der spezifischen Rotation von ASP ist verständlich, wenn man den niedrigen Anteil an 3,6- Anhydrogalactopyranose-Resten in Betracht zieht. Ferner spricht das Fehlen eines Anzeichens jeglicher Variationen oder Hystersis bei den (α)D-Temperatur-Profilen gegen das Auftreten von Doppel-Helix-Aggregaten in wäßrigen Lösungen von ASP-Los 8682/54 bei Raumtemperatur.

Das Agaroid-Rückgrat konnte ebenfalls klar unterschieden werden von demjenigen von Karrageenanen, besonders im Hinblick auf den anomeren Kohlenstoffbereich des 13C-NMR- Spektrums. Aus diesem Spektrum können einige chemische Charakteristika abgeleitet werden:

• - Methoxyl-Substitution (59,1 ppm) scheint abwesend oder, zumindest, nicht signifikant in diesem Los von ASP, was auch durch 1H-NMR bestätigt wurde.
• - Pyruvat-Substitution in den O-4- und O-6-(1- Carboxyethyliden-Gruppen)-Positionen einiger der β-D- Galactopyranose-Einheiten wurde gefolgert aus den Signalen bei 25,7 und 176,4 ppm und mit ca. 5% geschätzt.
• - Anomere Kohlenstoffsignale, obwohl nicht gut aufgelöst, sind konsistent mit einer Struktur, die aufgebaut ist durch wiederkehrende Einheiten von sich abwechselnder β(1→4)-D- Galactopyranose und α(1→3)L-Galactopyranose. Insbesondere sind die Zuordnungen die folgenden:

C-1(β-D)(30 bis 40%) bei 104,4 ppm, wenn α-L: GAL, 2-S- GAL, 6-S-GAL oder 2,6-DS-GAL
C-1(β-D) (10 bis 20%) bei 102,7 ppm, wenn α-L: 3,6-AN
C-1(α-L) (15 bis 25%) bei 101,6 ppm, wenn α-L: GAL oder 6- S-GAL,
C-1(α-L) (25 bis 35%) bei 99,2 ppm, wenn α-L: 2-S-GAL,
2,6-DS-GAL 3,6-AN oder 3,6-AN-2-S-GAL, worin
GAL = unsubstituierte Galactopyranose
2-S-GAL = Galactopyranose-2-sulfat
6-S-GAL = Galactopyranose-6-sulfat
2,6-DS-GAL = Galactopyranose-2,6-disulfat
3,6-AN = 3,6-Anhydrogalactopyraonse
3,6-AN-2-S-GAL = 3,6-Anhydrogalactopyranose-2-sulfat
(Sulfatierung in Position 3 wurde vernachläßigt auf Basis des IR-Spektrums).

• - Das Verhältnis der jeweiligen Integration für β- und α­ gebundene anomere Kohlenstoffatome beträgt in etwa 1:1.
• - Von den gesamten C-6 in den α-L und β-D-Einheiten tragen ca. 60% eine freie Hydroxylgruppe (Signal bei 61,5 ppm).

Weitere Information über die ASP-Struktur kam aus der Methylierungsanalyse, als die folgenden überwiegenderen Produkte identifiziert wurden:

• - 2,4,6-Tri-O-methylgalactose, stammend aus unsubstituierter 3-O-gebundener β-D-Galactopyranose,
• - 4,6-Di-O-methylgalactose, stammend aus 3-O-gebundenem β- D-Galactopyranose-2-sulfat,
• - 2,4-Di-O-methylgalactose, stammend aus 3-O-gebundenem β- D-Galactopyranose-6-sulfat,
• - 2,3,6-Tri-O-methylgalactose, stammend aus unsubstituierter 4-O-gebundener α-L-Galactopyranose,
• - 3,6-Di-O-methylgalactopyranose, stamnend aus 4-O- gebundenem α-L-Galactopyranose-2-sulfat,
• - 3-O-Methylgalactopyranose, stammend aus 4-O-gebundenem α- L-Galactopyranose-2,6-disulfat, zusammen mit Spuren von:
• - 2,6-Di-O-methylgalactose, stammend aus 3-O-gebundenem β- D-Galactopyranose-4-sulfat,
• - 4-O-Methylgalactose, möglicherweise stammend von 3-O- gebundenem β-D-Galactopyranose-2,6-disulfat
• - 2,3,4,6-Tetra-O-methylgalactose, nahelegend das Vorhandensein einiger Verzweigungspunkte.

Praktisch alle Reste auf Basis von 3,6-Anhydro-α-L- galactose (10%) wurden während der sauren Hydrolyse der permethylierten ASP abgebaut. Indem das Verhältnis der Gesamtheit an α-L- zu β-D-methylierten Resten mit ca. 4:5 geschätzt wurde, unter Zugrundelegung von 10% an 3,6- Anhydro-α-L-Resten, erhält man ein annäherndes 1:1- Verhältnis von 3-O-gebundenen β-D- zu 4-O-gebundenen α-L- Galactopyranosyl-Resten im ursprünglichen, unmethylierten Polysaccharid.

Unter Berücksichtigung aller aus Strukturanalysen erhaltenen Information kann davon ausgegangen werden, daß ASP-Los 8682/54 im Durchschnitt zusammengesetzt ist aus 3- O-gebundenen β-D-Galactopyranosyl-Resten, vorkommend als 1:2:4:3 pyruvylierte : 6-Sulfat : 2-Sulfat : unsubstituiert alternierend mit 4-O-gebundenen α-L-Galactopyranosyl- Resten, vorkommend als 3:2:2:3 2,6-Disulfat:2-Sulfat:3,6-Anhydro-2-sulfat: unsubstituiert.

Dieses Bild ist nur angenähert bezüglich der Verhältnisse und ebenso bezüglich einiger geringerer struktureller Details; z. B. ein gewisses Ausmaß an 4-Sulfat-Substitution ist wahrscheinlich vorhanden, wie aus dem IR-Spektrum zu schließen.

DEAE-Chromatograhie von ASP (Los 8682/54)

100 mg von Los 8682/54 (Beispiel 6) wurden einer DEAE- Chromatograhie unterzogen. Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde in kleinerem Maßstab durchgeführt, um eine 1,6×19 cm (40 ml) Säule zu verwenden. Das Elutionsprofil (gestrichelte Linie in Fig. 1) offenbarte nur das Vorliegen von als "Peak B" kodiertem ASP, wodurch belegt wurde, daß das Verfahren in Beispiel 3 sich maßgeschneidert eignet zur selektiven Extraktion und Reinigung von ASP.

Beispiel 7: Reinigung von ASP aus Algen-Rohextrakten

ASP wurde aus Algen-Rohextrakten durch CTAB-Fällung gereinigt, wobei das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren in kleinerem Maßstab durchgeführt wurde, im Hinblick auf die kleinere Menge an zu verarbeitendem Polysaccharid. E- GVF (25 g, Präparation A), E-GVS (38 g, Präparation B). E- GD (35 g, Präparation C) und E-GC (39 g, Präparation D) wurden getrennt jeweils in 500 ml wäßrigem 0,5 M NaCl gelöst und durch Zugabe von 2 M Natriumsulfat (3 ml) und 55 ml einer 6%igen (W/V) wäßrigen Lösung von CTAB und Rühren ausgefällt, wobei 30 min lang leicht erwärmt wurde (40°C), und man ließ das ganze aggregieren, während es mindestens 2 h lang bei Raumtemperatur stand. Die Fällungen wurden durch kurze Zentrifugation gesammelt und in 185 ml 4 M NaCl gelöst, wobei bei 40°C über Nacht gerührt wurde. Unlösliche Verunreinigungen wurden abzentrifugiert.

Natriumsulfat (4 ml, 2 M), CTAB (13 ml, 6%) und 583 ml Wasser wurden nacheinander und langsam den klaren Überständen (200 ml, aus der Wiederauflösung in 4 M NaCl) unter guter Vermischung zugefügt, wobei die Natriumchloridkonzentration herab auf 1 M erniedrigt und eine homogene Fällung begünstigt wurden. Nach Erwärmen (40°C, 30 min) unter Rühren und Stehen (2 h) bei Raumtemperatur wurden die Fällungen gesammelt und in 95 ml 4 M NaCl wieder aufgelöst (40°C, unter Rühren über Nacht).

Methanol (525 ml) wurde langsam unter angemessenem Rühren den klaren Lösungen (100 ml) zugefügt, um sulfatierte Polysaccharide als ihre Natriumsalze auszufällen, wobei alles CTA und das meiste NaCl in den Überständen (625 ml, 84% MeOH) zurückblieben. Es wurde mindestens 2 h lang gerührt, als der Ionenaustausch bis zur Beendigung fortgeschritten war.

Die Niederschläge wurden durch Filtration gesammelt, in 50 ml Wasser (Gesamtvolumen 60 ml) gelöst, durch Filtration (0,45 µm) vollständig geklärt, und es wurde erneut in 84%igem MeOH (durch Zugabe von 315 ml MeOH) ausgefällt, um alles NaCl zu entfernen. Endwäschen mit 95%igem MeOH (100 ml, zweimal) und 100%igem MeOH (100 ml) und Trocknen ergaben die gereinigten Natriumsalze von sulfatierten Polysacchariden mit einem D.S. 0,6, im einzelnen jeweils: "GVF" (1,24 g; Ausbeute 5,0% aus E-GVF oder 0,62% aus Trockenalgen; D.S.=0,92; HSV-1 CPE IC 50=0,2 µg/ml) "GVS" (1,04 g; Ausbeute 2,7% aus E-GVS oder 0,52% aus Trockenalgen; D.S.=0,82; HSV-1 CPE IC 50=0,2 µg/ml) "GD" (0,92 g; Ausbeute 2,6% aus E-GD oder 0,46% aus Trockenalgen; D.S.=0,85; HSV-1 CPE IC 50=0,14 µg/ml) "GC" (0,97 g; Ausbeute 2,5% aus E-GC oder 0,49% aus Trockenalgen; D.S.=0,87; HSV-1 CPE IC 50=0,2 µg/ml)

"In vitro"-Assay der antiviralen Aktivität und Zytotoxizität

Die Teste wurden im allgemeinen durchgeführt, indem man Monoschichten der permissiven Zellen durch tryptische Behandlung resuspendierte und die Suspension (4 bis 10×10⁴ Zellen/ml, in Minimal Essential Medium von Eagle, ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum) in 24 oder 96 Loch- Kulturplatten mit flachem Boden züchtete. Anteile von wäßrigen Lösung des Produkts der vorliegenden Erfindung wurden in zweifachen Reihenverdünnungen, im Duplikat, in den Löchern verteilt, und zwar zusammen mit entweder uninfizierten Zellen (für den Zytotoxizitätstest) oder mit Zellen, die mit 30 bis 100 I.C. 50 an Virus/Loch infiziert waren, für den antiviralen Aktivitätstest. Das Virus wurde 15 min nach Inkubation des Produkts mit den Zellen zugefügt.

Die Zytotoxizität wurde bewertet als die Konzentration, die erforderlich ist, un das Zellwachstum auf 50% herabzusetzen (TC IC50).

Die antivirale Aktivität wurde beobachtet als Herabsetzung des zytopathischen Effekts (CPE), als Transformierung von Foci bei Moloney Sarcoma Virus-Infektion, und durch Messung der Menge des HIV Kernproteins p24 (durch Elisa) und der Gesamtmenge der HIV-synthetisierten RNA (durch das Molekularhybridisierungsverfahren mit Nukleinsäuren). Sie wurde bestimmt als die Konzentration, die erforderlich ist, um die Virus-induzierte Zytopathogenizität auf 50% herabzusetzen (CPE IC50), als die Konzentration, die erforderlich ist, um MSV-induzierte Foci-Transformation mit 50% zu inhibieren (F IC50), und als die Konzentration, die erforderlich ist, um sowohl das HIV p24 als auch das HIV RNA un 50% herabzusetzen. Manchmal wurde auch die 50%ige Herabsetzung einer infektiösen Virusproduktion (IV IC50) getestet. Dies wurde ermittelt durch die Titration der Virusgehalte in Kryolysaten der infizierten behandelten und unbehandelten Kulturen.

Tabelle I

Weitere physikochemische Eigenschaften, die den Bereich von ASPs in der Tabelle gemeinsam sind, sind:

Na: 6,7 bis 7,6 Gew.-%
Cl: 0,1 Gew.-%
P: < 100 ppm

Galactose: 55 bis 59 Gew.-% (GLC-MS)

[α]D25: -5° bis -20° (c 1,0 Wasser)

M. W.: 1 bis <5000 kDa (Mp: 170 bis 260 kDa) (HPSEC)

Methylethergruppen: 0 bis 0,15 Mol per Monosaccharid-Einheit (13C-NMR)
Pyruvatgruppen: 0 bis 0,05 Mol per Monosaccharid-Einheit (13C-NMR)

Infrarot-Absorption (KBr):
3200 bis 3700 cm^-1 (OH-Gruppen)
2880 bis 2950 cm^-1 (CH₂- und CH-Gruppen)
1600 bis 1680 cm^-1 (OH-Gruppen)
1420 (schwach), 1370 (schwach) und 1250 cm^-1 (Sulfatester)
930 cm^-1 (3,6-Anhydrogalactose)
800 bis 850 cm^-1 (Sulfatester)

Löslichkeit:
größer als 50 mg/ml in Wasser,
unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Benzol, Chloroform Ethylether, Aceton, Methanol und Ethanol.

Tabelle I (Fortsetzung)

Die Produkte von Beispielen 2, 3 und 4 sind nicht vollständig zur Homogenität gereinigt, enthalten aber dennoch ASP als überwiegenden Bestandteil.

Die Produkte der Beispiele 1, 5, 6 und 7 bestehen aus gereinigtem ASP und sind bevorzugt.

• 1) Antivirale Aktivität gegen Herpes simplex Virus (HSV-1) als 50%ige Herabsetzung (IC50) des zytopathischen Effekts (CPE)
• 2) Grad der Sulfatierung (Durchschnittszahl an Sulfat- Halbestergruppen pro Monosaccharid-Einheit)
• 3) Molverhältnis von 3,6-Anhydrogalactose pro Monosaccharid-Einheit (%)

"In vitro"-Aktivitätsmeßergebnisse von Fraktionen von ASP-Los 8682/54, getrennt durch HPSEC
M. W.-Bereich (kDa)
HSV-1 CPE IC50 (µg/ml)
<4700
0,1
1550-4700	0,1
890-1550	0,1
690-890	0,2
550-690	0,2
430-550	0,2
340-430	0,1
260-340	0,2
200-260	0,3
150-200	0,2
105-150	0,2
71-105	0,4
46-71	0,3
28-46	0,6
16-28	0,4
8,3-16	0,6
4,0-8,3	0,8
<4,0	0,6

Tabelle III

"In-vitro" antivirale Aktivität von sulfatierten Polysacchariden auf Replikation von DNA-Viren

Tabelle IV

"In-vitro" antivirale Aktivität von sulfatierten Polysacchariden auf Replikation von RNA-Viren

Tabelle V

"In-vitro" antivirale Aktivität von sulfatierten Polysacchariden auf infektöse Viren

Tabelle VI

Inhibitorwirkung sulfatierter Polysaccharide auf MSV-induzierte Transformation von murinen Balb/3T3 Zellen

"In-vitro" anti-HIV Aktivität von ASP-Los 8682/54
Bewertete Parameter
50% Inhibitorkonzentration (µg/ml)
HIV p24
0,05
HIV RNA	1,5

Claims (8)

1. Sulfatiertes Polysaccharid, das ein gemeinsames Rückgrat des Agaroid-Typs hat, das zusammengesetzt ist aus wiederkehrenden Einheiten von sich abwechselnder β(1→4)D-Galactose und α(1→3)L-Galactose, und welches die folgenden Eigenschaften aufweist, nachdem es zur Homogenität durch Anionaustauschchromatographie durch Anwendung eines ansteigenden Natriumchloridgradient gereinigt, erschöpfend gegen detstilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet wurde:

• a) Elementaranalyse: 20 bis 35 Gew.% Kohlenstoff, 3,2 bis 5,5 Gew.% Wasserstoff, weniger als 1 Gew.% Stickstoff und mehr als 8 Gew.% Schwefel, berechnet als wasserfreie Verbindung;
• b) Molekulargewicht bis zu 10 000 kDa, gemessen durch Hochleistungsgrößenausschlußchromatographie;
• c) löslich in Wasser, in wäßrigen Phosphatpuffern bei pH 1 bis 13 und in wäßrigen Lösungen, enthaltend bis zu 20 Vol.% eines wasserlöslichen Alkohols, jedoch unlöslich in Benzol, Chloroform, Ethylether und in wäßrig-alkoholischen Lösungen, enthaltend mehr als 80 Vol.% Methyl- oder Ethylalkohol und 1 g/l Natriumchlorid;
• d) löslich in Wasser in der Gegenwart von Bariumchlorid, aber nach dreistündiger Hydrolyse bei 120°C in wäßriger 2M Salzsäure entsteht ein Niederschlag aus Bariunsulfat bei Zugabe von Bariumchlorid;
• e) mehr als 90 Mol-% der gesamten Monosaccharid- Einheiten sind Galactose- und 3,6-Anhydrogalactose- Reste, die unsubstituiert oder substituiert sind;
• f) mehr als 30 Mol-% der gesamten Monosaccharid- Einheiten bestehen aus 4-O-gebundenen α-L- Galactopyranosid-Resten, die Substituenten in den Positionen 2, 3 und/oder 6 tragen können;
• g) mehr als 40 Mol-% der gesamten Monosaccharid- Einheiten bestehen aus 3-O-gebundenen β-D- Galactopyranosid-Einheiten, die Substituenten in den Positionen 2, 4 und/oder 6 tragen können;
• h) mehr als 40 Mol-% der gesamten Monosaccharid- Einheiten bestehen aus 4-O-gebundenen α-L- Galactopyranosid-Einheiten, die Substituenten in den Positionen 2,3 und 6 tragen können, plus 4-O- gebundenen 3,6-Anhydro-α-L-galactopyranosid-Resten, die einen Substituenten in Position 2 tragen können;
• i) Pyruvat(l-Carboxyethyliden)-Gruppen, die als zyklische Ketale gebunden sind, welche O-4 und O-6 der β-D-Galactopyranosid-Reste verbrücken, kommen als Substituenten in weniger als 10 Mol-% der gesanten Monosaccharid-Einheiten vor;
• j) das Molverhältnis der Methylethergruppen- Substituenten pro Monosaccharid-Einheit übersteigt 0,3:1 nicht;
• k) Sulfat-Halbestergruppen können als Substituenten in den Positionen 2, 4 und 6 der β-D-Galactopyranosid- Reste, in den Positionen 2, 3 und 6 der α-L- galactopyranosid-Reste und in der Position 2 der 3,6- Anhydro-α-L-galactopyranosid-Reste vorhanden sein, und der Gesamtgrad der Sulfatierung ist inmer größer als 0,6; und
• l) der Beitrag der Sulfat-Halbestergruppen in Position(en) 2 und 4 zum Gesamtsulfatierungsgrad ist inmer größer als 0,3; sowie pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

2. Sulfatiertes Polysaccharid gemäß Anspruch 1, das einen Sulfatierungsgrad von 0,9±0,1 aufweist, sowie pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

3. Sulfatiertes Polysaccharid gemäß Anspruch 1 oder 2, mit einem Verhältnis MW:MN größer als 2:1 und einem MP im Bereich von 100 bis 300 kDa, sowie pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

4. Verfahren zur Isolierung eines sulfatierten Polysaccharids gemäß jedem der vorhergehenden Ansprüche oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, wobei man:

• 1) rote Algen, Rückstände aus der Herstellung von Agars oder ungereinigte Agars mit einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert;
• 2) den Extrakt einer Veredelungsbehandlung und Elution an einer Säule oder einer fraktionierten Fällung unterzieht, um so das genannte Polysaccharid zu erhalten; und
• 3) falls gewünscht, das so erhaltene Polysaccharid in ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon überführt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin das wäßrige Lösungsmittel eine wäßrige Lösung von Phosphatpuffer oder NaCl und die Veredelungsbehandlung mindestens eine Behandlung sind, ausgewählt aus Zentrifugation, Filtration, Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel, Dialyse, Lyophilisierung und Ultrafiltration.

6. Pharmazeutische Zusamnensetzung, enthaltend einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein entsprechendes Verdünnungsmittel und, als aktiven Bestandteil, ein sulfatiertes Polysaccharid oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie definiert in einem jeden der Ansprüche 1 bis 3.

7. Sulfatiertes Polysaccharid oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung als antivirales Mittel.

8. Sulfatiertes Polysaccharid oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon gemäß Anspruch 7 zur Verwendung bei der Behandlung von AIDS.