DE69722434T2

DE69722434T2 - Buttersäure-ester mit antiproliferativer wirkung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69722434T2
Application number: DE69722434T
Authority: DE
Inventors: Alberto Perbellini; Danila Coradini
Original assignee: Sigea SRL
Current assignee: Sigea SRL
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2017-11-27
Also published as: CA2272720C; CA2272720A1; IT1286510B1; AU5751598A; ATE241648T1; US6140313A; JP4256475B2; JP2001505940A; ITMI962505A0; ITMI962505A1; DE69722434D1; WO1998023648A1; EP0941253A1; EP0941253B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Teil- oder Gesamt-Buttersäureester von Polysacchariden mit hoher antiproliferativer Aktivität; diese Ester sind therapeutisch wirksam zur Behandlung und Verhinderung von Krankheiten, die durch eine abnorme Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie Neoplasmen und Synovialerkrankungen.
Stand der Technik
Die biologische Aktivität vieler Klassen von Polysacchariden wurde im Hinblick auf ihre Verwendung als Arzneimittel für die Behandlung verschiedener pathologischer Zustände ausgiebig untersucht. Unter diesen für die Therapie verwendeten Polysacchariden sind Heparine mit entweder hohem oder niedrigem Molekulargewicht als ein die Blutgerinnung hemmendes Mittel bekannt, während Dextrane als Plasma-Expander allgemein verwendet werden.
Kürzlich wurden neue biologische Aktivitäten von Polysaccharid-Verbindungen identifiziert, was es ermöglichte, eine breitere Verwendung dieser Polysaccharide in der Medizin vorherzusagen.
Unter den Polysacchariden, die die aktiven Verbindungen von Arzneimitteln, die zur Zeit in Verwendung sind, bilden, ist es wert, die Hyaluronsäure zu erwähnen, die für die Behandlung der Osteoarthrose und anderer pathologischer Zustände verwendet wird, da sie die Lymphozyten-Proliferation inhibieren kann (G. F. Peluso et al., Current Therapeutic Research, 47(3): 437–443, März 1990), wie auch Skleroglucan (als aktive Verbindung in einer Formulierung, die Sizofiran® genannt wird, kommerziell vermarktet), das als Immunstimulanz bei der Behandlung einiger Tumoren verwendet wird (Eric J. Lien, Prog. Drug. Disc., 34: 395–420, 1990).
Außerdem sind einige Arzneimittel mit polysaccharidischer Natur in einem fortgeschrittenen Stand der klinischen Entwicklung bekannt, wie z. B. Pentosan-Polysulfat, das für die Behandlung einiger Tumoren verwendet wird und etliche Derivate der Hyaluronsäure, die als Adjuvantien beim Heilprozeß und bei der Verhinderung von postchirurgischen Adhäsionen verwendet werden.
Ergebnisse von besonderer Bedeutung haben sich kürzlich bei der Suche nach neuen pharmakologischen Verwendungen von Polysacchariden ergeben.
Unter den vielen pharmakologischen Aktivitäten, die von einigen Familien der Polysaccharide ausgeübt werden, führt die antiproliferative Aktivität zu der Möglichkeit ihrer Verwendung als Antitumormittel, da sie die Entwicklung einiger Tumorzellinien inhibieren können. (A. Misaki et al., Carbohydrate Research, 92 (1981): 115–192).
Die Buttersäure ist eine Verbindung von natürlichem Ursprung, nicht toxisch, liegt in der Regel in Nahrungsmitteln und im Gastrointestinaltrakt als Produkt der bakteriellen Fermentation von komplexen Kohlehydraten vor. Von einem pharmakologischen Standpunkt aus betrachtet, übt diese Verbindung eine antiproliferative Aktivität aus, indem sie das Zellwachstum inhibiert und die Differenzierung einer großen Vielzahl neoplastischer Zellen induziert, wie deutlich dargestellt durch Experimente, die sowohl in vitro als auch in vivo bei verschiedenen Zellinien durchgeführt wurden. Die zellulären und molekularen Mechanismen, die der differenzierenden Aktivität der Buttersäure zugrunde liegen, sind noch nicht vollständig erhellt worden.
Insbesondere ist das Natriumsalz der Buttersäure ein bekannter Induktor der Zelldifferenzierung (A. Leder u. P. Leder, Cell, 5: 319, 1975). Obwohl es jedoch mit einem antiproliferativen Potential versehen ist, zeigt das Natriumsalz der Buttersäure den Nachteil, dass es nur eine sehr kurze Halbwertszeit aufweist, die seine Verwendung in vivo bis jetzt begrenzt hat und die Möglichkeit seiner Verwendung als Arzneimittel ausschließt, da es schwierig ist, ausreichende Plasma-Konzentrationen zur Ausübung einer therapeutischen Wirksamkeit zu erhalten.
Tatsächlich zirkuliert die aktive Verbindung, nachdem sie durch den intravenösen Weg verabreicht wurde, nur 5 bis 6 Minuten vor ihrer Verstoffwechslung.
Verschiedene Versuche zur Überwindung dieses Nachteils sind durchgeführt worden:

– ein chemischer Versuch, der auf die Stabilisierung des Moleküls durch Veresterung abzielt, um seinen Abbau zu verzögern und die biologische Aktivität zu verlängern. Einige einfache Ester der Buttersäure sind tatsächlich bekannt; unter diesen das Phenylbutyrat, das eine antineoplastische Aktivität bei Prostatakrebsmodellen ausübt (Proceedings of the American Association for Cancer Research, Band 37, März 1996, 498) und bei anderen Tumoren. In diesem Fall zielt die Veresterung einfach auf eine Erhöhung der Halbwertszeit im Plasma der aktiven Verbindung durch Umwandlung der aktiven Verbindung in ein Proarzneimittel ab, das durch Hydrolyse die Buttersäure in dem Zielorgan langsam freisetzt. Die Aktivität dieser Ester erweist sich jedoch immer als niedriger als diejenige der freien Säureform, da die Bioverfügbarkeit der aktiven Verbindung niedriger ist. Es haben sich in dieser Richtung keine ermutigenden Ergebnisse ergeben.

Eine interessante Alternative zu der Veresterung der Buttersäure und der Modifikation ihrer chemischen Struktur beinhaltet die Verkapselung in Liposomen, die einen besseren Schutz gegenüber dem Abbau und eine Trägerbildung der aktiven Verbindung selbst in höheren Konzentrationen bereitstellen kann (G. Storm et al., Biotherapy, 3: 25, 1991); selbst in diesem Fall sind die soweit erhaltenen Ergebnisse jedoch nicht vollständig zufriedenstellend und zwar aufgrund der niedrigen Einfangwirksamkeit, die von den Liposomenträgern ausgeübt wird. Die EP 0356275 beschreibt Glykosaminoglykane, worin die Hydroxyl- und Amingruppen unterschiedlich durch funktionelle acyclische oder sulfatierte Gruppen substituiert sind. Die US 5,185,436 beschreibt die Herstellung von Buttersäurederivaten, worin das aktive Molekül (n-Buttersäure) kovalent durch eine Esterbindung an einen atoxischen Träger gebunden ist.
Zusammenfassung
Die Anmelderin hat neue Polysaccharidderivate hergestellt, sowohl anionisch als auch neutral, die in überraschender Weise die abnorme Zellproliferation in einer deutlich höheren Menge inhibieren als die des korrespondierenden nicht modifizierten Polysaccharids (hiernach als Quellpolysaccharid bezeichnet). Eine neue Klasse von Buttersäureestern der Polysaccharide ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung. Diese Buttersäureester können ein oder mehr Substituenten an den Kohlenstoffatomen des glycosidischen Rings aufweisen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus den niederen Alkylen, -NH₂-, -NH-COR-, -OSO₃H, -OPO₃H₂, -COOH, -COO-(CH₂)_n-COOH, -COOR, -COR, -OR und -O-(CH₂)_n-O-COR, worin n = 1–4 und R = Alkyl-C₁-C₁₀ ist, wobei die Hydroxylgruppen dieser Polysaccharide teilweise oder vollständig mit Buttersäureresten verestert sind und wobei die zusätzlichen freien Hydroxylgruppen des glycosidischen Rests möglicherweise mit Dicarbonsäureresten verestert sind.
Vorzugsweise ist die Anzahl der Hydroxylgruppen, die mit Buttersäureresten verester sind, für jedes glycosidische Monomer höher als 0,001.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser Buttersäureester, einschließlich der Behandlung der Polysaccharide mit Buttersäureestern oder einer ihrer aktivierten Formen, möglicherweise in einem geeigneten Lösungsmittel und/oder in Gegenwart eines geeigneten Katalysators.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der obigen Buttersäureester als antiproliferatives Mittel und neue pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der obigen Buttersäureester als aktive Verbindung, zusammen mit Exzipientien und/oder Lösungsmitteln, die pharmazeutisch akzeptabel sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die oben erwähnten Zahlen in Bezug auf die antiproliferative Aktivität der Verbindungen gemäß Beispiel 3, 4, 6, 8 und 9 gemäß der vorliegenden Erfindung in graphischer Darstellung, wobei die prozentuale Inhibition der Tumorzellproliferation als Funktion der Konzentration der getesteten Verbindungen dargestellt wird (ausgedrückt als mg der Verbindung/ml der Gesamtlösung).
2 illustriert die obigen Zahlen in einer Darstellung, die die prozentuale Inhibition des Zellwachstums gegenüber der Konzentration der getesteten Verbindungen zeigt.
Diese Figuren zeigen, dass die Buttersäureester der Polysaccharide eine antiproliferative Aktivität ausüben, die in unerwarteter Weise höher ist als die Aktivität, die von einer Mischung der Bestandteile ausgeübt wird.
3 zeigt die antiproliferative Wirkung der Buttersäureester der Beispiele 3 und 4 auf das Wachstum einer MDA-MB231-Zellinie nach 6 Tagen Behandlung als Vergleich der Wirkung von Natriumbutyrat, das in den selben Konzentrationen und unter den selben experimentellen Bedingungen verwendet wird. Das Diagramm zeigt die prozentuale Inhibition des Zellwachstums gegenüber der Konzentration der getesteten Verbindungen (die (mM) Molarität ist bezogen auf die Konzentration des Butyrats der geprüften Verbindungen).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Eigenschaften und die Vorteile der neuen Buttersäureester der Polysaccharide, des Verfahrens für ihre Herstellung, ihrer therapeutischen Verwendung und der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die sie enthalten, gemäß der vorliegenden Erfindung, werden durch die folgende detaillierte Beschreibung besser erhellt. Gemäß einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Buttersäureestern für die Herstellung eines antiproliferativen Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung von Krankheiten, gekennzeichnet durch eine abnorme Zellproliferation. Diese Buttersäureester werden entweder aus vollständig oder teilweise butyrierten Polysacchariden hergestellt, wobei die Zahl der veresterten Hydroxylgruppen mit Buttersäureresten für jedes glycosidische Monomer vorzugsweise höher als 0,001 liegt. Die Buttersäurereste können im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% im Hinblick auf das Gesamtgewicht liegen; der Substitutionsgrad (DS) liegt vorzugsweise im Bereich von 0,001 bis 3 und noch bevorzugter bei 0,01 bis 1. Die Bezeichnung "Substitutionsgrad (DS)" bezeichnet die Anzahl der derivatisierten Hydroxylgruppen für jedes glycosidische Monomer des Polysaccharids.
Die möglichen zusätzlichen freien Hydroxylgruppen des glycosidischen Rests der Polysaccharide können mit Resten von C₂-C₉-Dicarbonsäuren verestert sein, vorzugsweise gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Bernsteinsäure, Weinsäure, Apfelsäure und Azelainsäure.
Die Buttersäureester haben ein durchschnittliches Molekulargewicht, das vorzugsweise höher als 2 × 10³ Dalton und noch bevorzugter im Bereich von 1 × 10⁴ bis 5 × 10⁶ liegt.
Die Bezeichnung "Polysacccharide" bezeichnet Verbindungen polysaccharidischer Natur, vorzugsweise natürlich, z. B. isoliert aus Quellen von natürlichem Ursprung, wie z. B. Bakterien, Pilzen, Flechten, höheren Pflanzen, Algen, Mikroalgen und Schalentieren; oder die natürlichen Polysaccharide können von Tieren erhalten werden (z. B. Brathähnchenkamm) und menschlichen Quellen (z. B. aus der Nabelschnur), wie auf dem Gebiet bekannt.
Diese Polysaccharide können entweder linear oder verzweigt sein, wobei das Grundgerüst und die möglichen Seitenketten vorzugsweise glycosidische Reste enthalten, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus D-Glukose, D-Ribose, D-Gulose, D-Xylose, D-Arabinose, D- und L-Mannose, D-Galactose, L-Fucose, L-Rhamnose, D-Uronsäure, D-Glukuronsäure, D-Mannuronsäure, D-Guluronsäure und D-Galacturonsäure.
Das Grundgerüst des Polysaccharids weist eine β(1→3) oder β(1→4)D-glycosidische Bindung auf oder noch bevorzugter glukosidische oder eine α-(1→3) oder α-(1→4) oder α-(1→6)-glycosidische Bindung.
Die Seitenketten bestehen vorzugsweise aus einzelnen D-glycosidischen Resten, gebunden in β(1→3) oder β(1→4), β(1→6) oder α-(1→4)-Konfiguration oder bestehen noch bevorzugter aus β(1→6)-Glykosylresten.
Das Polysaccharid kann ein β(1→3)-D-Glucan sein, wobei die Bezeichnung "Glucan" ein lineares Polysaccharid mit β(1→3)-D-Glucopyranose-Resten bedeutet; die Polysaccharide können β(1→3)-D-Glucane mit (1→6)-Seitenketten sein und sind vorzugsweise gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Skleroglucan, das ein β(1→3)-D-glucopyranosidisches lineares Grundgerüst mit einer β(1→6)-D-glucopyranosidischen Seitenkette pro alle 3 glycosidischen Einheiten der Hauptkette aufweist, Lentinan (β(1→3)-D-glucosidische Bindungen), Pachimaran (β(1→3)-D-glucosidische Bindungen), Curdlan (β(1→3)-D-glucosidische Bindungen und Pullulan (α-(1→3) und α-(1→6)-D-glucosidische Bindungen). Das Molekulargewicht dieser Glucane liegt vorzugsweise im Bereich von 1 × 10⁴ bis 1 × 10⁶.
Weiterhin können die Polysaccharide an den Kohlenstoffatomen des saccharidischen Rests ein oder mehr Substituenten aufweisen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus niederen Alkylen, -NH₂, -NH-COR, -OSO₃H, -OPO₃H₂, -COOK, -COO-(CH₂)_n-COOH, -COOR, -COR, -OR und -O-(CH₂)n-O-COR, worin n = 1–4 oder R = Alkyl-C₁-C₁₀. In diesem Fall können die Buttersäureester der Erfindung möglicherweise mit Kationen von Alkalimetallen (vorzugsweise Na und K), Erdalkalimetallen (vorzugsweise Ca und Mg) und Übergangsmetallen (vorzugsweise Cu, Zn, Ag und Au) versalzt sein. Die derivatisierten Polysaccharide können durch chemische Modifikation natürlicher Polysaccharide gemäß den auf dem Gebiet bekannten Verfahren erhalten werden.
Unter den carboxylierten Polysacchariden kann Hyaluronsäure, bestehend aus alternierenden Resten von D-N-Acetylglucosamin und D-Glucuronsäure in profitabler Weise verwendet werden. Das Molekulargewicht der Hyaluronsäure liegt zwischen 10⁴ und 2 × 10⁶.
Pektin ist ein weiteres Beispiel von carboxylierten Polysacchariden, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Pektin ist ein carboxyliertes Polysaccharid, bestehend hauptsächlich aus D-Galakturonsäure oder D-Galaktose. Die Carboxylgruppen von Pektin können teilweise in Form von Methylestern vorliegen. Das Molekulargewicht von Pektin variiert zwischen 2 × 10⁴ bis 4 × 10⁵.
Weitere Polysaccharide, die in der Erfindung nützlich sind, sind Alginsäure, bestehend aus (1→4)-α-L-Guluron- und β-D-Mannuronsäure, mit einem Molekulargewicht, das vorzugsweise höher ist als 10⁴ und vorzugsweise im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ liegt. Andere Beispiele werden durch die Heparine, Heparinoide und Karrageene (sulfatierte Polysaccharide aus Algen) dargestellt.
Ein natürliches Polysaccharid, das besonders geeignet ist zum Erhalt der Buttersäureester gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein sulfatiertes Polysaccharid, isoliert aus marinen Algen, Grateloupia doryphora (die zur Grateloupiacea-Familie gehören). Auch andere natürliche Polysaccharide, erhalten von anderen Algen als der Grateloupiacea-Spezies, mit D-Galaktoseresten mit (1→3)-Bindungen und mit sulfatierten Resten in den Stellungen 2, 3 und/oder 6 können profitabel verwendet werden. Das Molekulargewicht des Polysaccharids liegt vorzugsweise im Bereich von 10⁴ bis 5 × 10⁶.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung neue Buttersäureester eines Polysaccharids, wobei das Polysaccharid gewählt ist aus: Hyaluronsäure, β(→3)-D-Glucan oder sulfatierten Polysacchariden, extrahiert aus Grateloupia doryphora, wobei die Polysaccharide oben beschrieben sind und wobei die Hydroxylgruppen des Polysaccharids teilweise oder vollständig mit Buttersäureresten verestert sind.
Das Verfahren für die Herstellung der Buttersäureester gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet vorzugsweise natürliche Polysaccharide als Quell-Polysaccharide, Rohmaterialien, die einfach aus Quellen von natürlichem Ursprung isoliert werden können und in großen Mengen gefunden werden. Die Verbindungen der Erfindung können durch eine Veresterungsreaktion sowohl unter homogenen als auch heterogenen Bedingungen hergestellt werden, unter Umständen in Gegenwart eines Katalysators.
Die Veresterung kann durch Verwendung von Buttersäure oder einer ihrer aktivierten Formen, z. B. eines korrespondierenden Esters, Anhydrids und Acylhalogenids durchgeführt werden.
Dank der oben beschriebenen Veresterungsreaktion ist es möglich, Buttersäureester mit unterschiedlichen Substitutionsgraden (DS) durch Einstellung adäquater Temperaturen und Reaktionszeiten und durch Verwendung geeigneter molarer Verhältnisse zwischen den Reaktionsmitteln zu erhalten.
Die Buttersäureester der Polysaccharide gemäß der vorliegenden Erfindung üben eine hohe antiproliferative Aktivität aus, was sie für die Behandlung von Krankheiten geeignet macht, die durch eine abnorme Zellproliferation gekennzeichnet sind.
Ein Beispiel für diese Krankheiten wird durch die Neoplasmen dargestellt: die vorliegenden Verbindungen sind so für die Behandlung und Verhinderung von Tumoren geeignet. Die präventive Behandlung von Tumoren wird auf die Behandlung von Zuständen ausgedehnt, die gegenüber einer neoplastischen Degeneration empfänglich sind, wie entzündliche Intestinalerkrankungen, Divertikulose, die Crohn'sche Erkrankung, entzündliche Colitis, ulzerative Colitis; die Möglichkeit der neoplastischen Degeneration dieser Erkrankungen ist aus dem Stand der Technik bekannt (cf. J. Cell. Biochem. Suppl., 1992, 16G: 47–50; Dis. Colon Rectum, 1991, 34(2), 174–180).
Ein anderes Anwendungsbeispiel wird durch die Behandlung der Synovial-Zellproliferation dargestellt. Dieser Zustand liegt bei einer Anzahl von artikulären Erkrankungen vor, wie der rheumatoiden Arthritis, der juvenilen Arthritis und der Psoriasis-Arthritis. Die Proliferation der Gelenkzellentzündungen führt zu einer Degeneration des artikulären Knorpels, der Knochen und der Sehnen (J. Immunol. 1993, 151(9), 4908–4917). Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können die synoviale Zellproliferation effektiv umkehren, und dadurch der Entwicklung der obigen Störungen entgegenwirken.
Weitere Zustände, die durch eine abnorme Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. Psoriasis, Hyperkeratose, Prostata-Hyperplasie oder Erkrankungen des Gastrointestinaltraks können durch Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt und verhindert werden.
Für die obigen Buttersäureester ist die systemische Verabreichung entweder oral oder parenteral, topisch oder transdermal empfehlenswert. Diese Ester werden vorzugsweise durch die folgenden Verabreichungswege verabreicht: oral, intravenös, intraperitoneal, intraartikulär, intramuskulär, subkutan, rektal, intravaginal.
Die therapeutisch effektive Dosis variiert gemäß dem Verabreichungsweg wie auch der Schwere der Pathologie. Weiterhin variiert sie in Bezug auf Alter, Gewicht und allgemeinem Gesundheitszustand des Patienten.
Die therapeutisch wirksame Dosis variiert vorzugsweise von 0,2 bis 500 mg/kg/Tag für die Tage 1 bis 15.
Im Fall von intravenösen Injektionen wird der Buttersäureester vorzugsweise in Dosierungen von 0,2 bis 50 mg/kg/Tag für 8 bis 12 Tage verabreicht. Wenn intraperitoneal injiziert wird, wird der Buttersäureester vorzugsweise in Form einer Lösung oder wässrigen Suspension und noch bevorzugter in einem physiologischen Puffer in einer Menge von 1 bis 100 mg/kg/Tag und noch bevorzugter 10 bis 50 mg/kg/Tag für 8 bis 12 Tage verabreicht. Schließlich wird bei oraler Verabreichung der Buttersäureester vorzugsweise in einer Menge von 300 bis 500 mg/kg/Tag für 8 bis 12 Tage verabreicht.
Die neuen Buttersäureester der Erfindung, erhalten durch teilweise oder gesamte Veresterung mit Buttersäure der freien Hydroxylgruppen der Saccharidreste der Polysaccharide zeigen einen überraschenden Anstieg der antiproliferativen Aktivität der Quellpolysaccharide und der Buttersäure, bekannt auf dem Gebiet für ihre anti-neoplastische Aktivität. Die antiproliferative Aktivität, die von den neuen Buttersäureestern der Erfindung ausgeübt wird, ist überraschend höher als die theoretische Summe der Wirkungen beider Bestandteile, was die unerwartete Synergie der Wirkung der Buttersäure und des Polysaccharids beweist, die aneinander durch eine Esterbindung gebunden sind. Daher unterscheiden sich die neuen Derivate von den einfachen Estern der Buttersäure, die auf dem Gebiet bekannt sind, und die lediglich als Pro-Arzneimittel verwendet werden, um die Halbwertszeit der Buttersäure zu verlängern.
In den unten gezeigten Beispielen wurde die biologische Aktivität der neuen Buttersäureester der Erfindung und ihre anti-proliferative Aktivität auf verschiedene Tumorlinien getestet.
Schließlich umfaßt die vorliegende Erfindung neue pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der Buttersäureester der Erfindung. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen liegen vorzugsweise in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen für die systemische, intravenöse, intraperitoneale, intraartikuläre, hypoderme, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung vor. In diesem Fall können die Formulierungen direkt vor der Verwendung durch Löslichmachen oder Suspension der Ester der Erfindung in Form von Lyophilen in geeigneten Verdünnungsmitteln hergestellt werden.
Für die orale Verabreichung werden feste Präparationen, wie Körnchen, Tabletten, Pillen oder Kapseln wie auch halbfeste Formen, wie Gels, bevorzugt. Daneben können die obigen Formulierungen die Buttersäureester in Kombination mit anderen Anti-Tumor-Arzneimitteln von allgemeiner klinischer Verwendung. enthalten, wie z. B. 5-Fluoruracil, Cisplatin und Cyclophosphamid, die in polychemotherapeutischen Protokollen verwendet werden können.
Einige illustrative, jedoch nicht begrenzende Beispiele für die Herstellung und Aktivität der Buttersäureester gemäß der vorliegenden Erfindung werden hiernach angegeben.
Beispiel 1
Isolierung von sulfatiertem Polysaccharid aus Grateloupia doryphora
5 g Grateloupia doryphora, gesammelt in der nördlichen adriatischen See, in trockener und gemahlener Form wurden in 500 ml Milli-Q® Wasser unter Rühren für 16 Stunden bei 25°C suspendiert. Die Extraktionsmischung wurde einer Filtration im Vakuum durch eine 1,2 μm Faserglasmembran unterzogen. Die erhaltene Lösung wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann getrocknet und 2 g des Endprodukts wurden erhalten. Die physikochemischen Eigenschaften des von Grateloupia doryphora erhaltenen sulfatierten Polysaccharids sind wie folgt beschrieben:
Molekulargewichts-Bestimmung: das Molekulargewicht des erhaltenen Polysaccharids wurde gemäß dem hiernach beschriebenen Verfahren bestimmt.
20 mg des Polysaccharids wurden in einen 10 ml Kolben eingewogen; dieser Kolben wurde auf 2/3 des Gesamtvolumens mit 0,15 M NaCl aufgefüllt, die Lösung wurde einem magnetischen Rühren bei Raumtemperatur, bis zu ihrer vollständigen Löslichmachung unterzogen und dann wurden 0,15 M NaCl zu einem Endgesamtvolumen von 10 ml zugefügt. Die erhaltene Lösung wurde dann auf 0,45 μm Filtern (MILLEXD-Filtereinheiten, Millipore, Nr. SLHA 025 NB, 1996) gefiltert, direkt auf einen Satz von Größenausschluß-chromatographischen Säulen injiziert (TSK-G600 PW_x1, TSK-G500 PW_x1 und TSK-G3000 PW_x1, Tosohaas, jeweils Nr. 08024, 08023 und 08021, 1995). Die Molekulargewichte der eluierten Fraktionen von den Säulen wurden dann durch den RI410 (Waters) Brechindex erhalten.
Für die Bestimmung des Molekulargewichts und der Molekulargewichtsverteilung wurde eine "breite Standard"-Kalibrierung (basierend auf einem Standard-Polysaccharid) verwendet. Das Acquise- und Computersystem (Chromstar, Rev. 3.13, Bruker Spectro) wurde auf einem PC 486 IBM kompatibel implementiert. Das durchschnittliche Molekulargewicht des Polysaccharids betrug 251.000, während die Refraktions- und Polydispersitäts-Indizes bei 4,2 lagen.
¹H-NMR: die Struktur des erhaltenen Polysaccharids, wie oben beschrieben, wurde durch NMR bestimmt. Die folgenden, sich wiederholenden dimeren Strukturen wurden identifiziert: 3→[O-β-D-Galactopyranosyl-4-sulfat-(1→4)-O-α-D-galactopyranosyl-3,6-anhydro]→1; 3→[O-β-D-Galactopyranosyl-4-sulfat-(1→4)-O-α-D-galactopyranosyl-3,6-anhydro-2- sulfat]-→1; 3-→[O-β-D-Galactopyranosyl-4-(1→4)-O-α-D-galactopyranosyl-3,6-anhydro]-→1; 3→[O-β-D-Galactopyranosyl-4-(1→4)-O-α-L-galactopyranosyl-3,6-anhydro]→1.
Sulfatierungsgrad-Bestimmung: Der Sulfatierungsgrad des wie oben beschrieben erhaltenen Polysaccharids wurde gemäß dem folgenden colorimetrischen Verfahren bestimmt.
Es wurde Milli-Q® Wasser verwendet.
Das A-Reagenz (Pufferlösung von BaCl₂) wurde durch Vermischen von 10 ml Essigsäure 2 M in Wasser, 2 ml BaCl₂ × 2H₂O, 0,01 M, in Wasser und 8 ml NaHCO₃, 0,02 M in Wasser erhalten und durch schlieflliche Zugabe von EtOH abs. bis zu 100 ml.
Das B-Reagenz (Lösung aus Natriumrhodizonat) wurde durch Lösen von 5 mg Natriumrhodizonat (Fluka, Nr. 71940, 1995) in 20 ml Wasser durch Zugabe von 100 mg Ascorbinsäure und durch Zugabe von EtOH abs. bis zu einem Volumen von 100 ml hergestellt.
Die A- und B-Reagenzien-Lösungen wurden im Dunklen für 30 Minuten vor ihrer Verwendung gehalten.
Für die Bestimmung der in der Verbindung vorliegenden Sulfatmenge wurden geeignete Standardlösungen von SO₄ ²- in H₂SO₄ zu 96% und eine Leerlösung, hergestellt mit Wasserverwendet. Eine Kalibrierungskurve wurde durch Vermischen von 2 ml EtOH abs., 1 ml A-Reagenz und 1,5 ml B-Reagenz mit der Standardlösung von SO₄ ²- und mit der Leerlösung erhalten. Nach einem Rühren ließ man die Lösungen im Dunklen bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Die Absorption bei 520 nm wurde dann aufgezeichnet, wobei die Leerprobe als Null betrachtet wurde und zwar durch ein UV-VIS CARY 3E Spektrophotometer (Varian).
Vor der Durchführung der quantitativen Analyse der Sulfatgruppe in dem Polysaccharid durchlief das Polysaccharid eine Hydrolyse.
Ein Pyrex-Glas-Bakelit-versiegeltes Teströhrchen, enthaltend 3,00 mg Polysaccharid in 1 ml HCl, wurde für 4 Stunden bei einer Temperatur von 120°C in einem Ofen gehalten und es wurde eine vollständige Hydrolyse der Sulfatgruppen erhalten.
Mehrere Messungen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Hydrolyse durchgeführt wurden, bewiesen, dass eine verlängerte Erwärmung für 3 bis 4 Stunden ausreicht, um eine vollständige Hydrolyse der Sulfatgruppen zu erhalten.
Nach dieser Zeit wurde die Probe in einen Rotations-Evaporator übertragen. Die Badtemperatur wurde bei ungefähr 50°C gehalten, um das HCl zu eliminieren. Die erhaltene Lösung wurde dann mit Wasser versetzt, um eine endgültige Konzentration der hydrolysierten Probe von 2 mg/ml zu erhalten.
Nach Behandlung der hydrolysierten Probe mit den Reagenzien A und B wie für die Sulfatproben, die für die Kalibrierungsprobe verwendet wurden, beschrieben, wurde die Absorption bei 520 nm abgelesen und die Sulfatmenge wurde unter Verwendung des Winkelkoeffizienten der Kalibrierungskurve bestimmt.
Die obige Analyse ergab, dass der Gehalt der Sulfatgruppen bei 31% G/G lag.
Beispiel 2
Herstellung des Buttersäureesters von Hyaluronsäure mit einem Subistitutionsgrad DS von 0,08
0,2 g Hyaluronsäure (4 × 10⁴ MW) wurden in einen 250 ml Rundbodenkolben abgewogen, versehen mit einer Rührvorrichtung und in 25 ml deionisiertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit 0,23 ml HCl angesäuert und nach 5 Minuten wurden 0,132 ml Collidin zugefügt. Nach 5 Minuten wurde die Lösung auf ein Volumen von ungefähr 15 ml unter Vakuum konzentriert. 60 ml wasserfreies DMF wurden dann zugefügt und das System wurde auf ungefähr 40% des anfänglichen Volumens konzentriert. Die letzten zwei Schritte wurden noch mal wiederholt. Die Mischung wurde mit 40 ml DMF verdünnt, gefolgt von einer Zugabe von 0,2 ml Pyridin und 0,163 ml Buttersäureanhydrid. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und nach 18 Stunden gestoppt. Die Lösung durchlief eine Konzentration im Vakuum und dann wurden 50 ml deionisiertes Wasser zugefügt. Der pH der Lösung wurde dann auf ungefähr 6,5 bis 7 mit wässrigem NaHCO₃ eingestellt, gefolgt von einer Dialyse gegen deionisiertes Wasser (4 × 2 l). Das Produkt wurde durch Gefriertrocknen gewonnen und es wurden 0,135 g Buttersäurederivat erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften der butyrierten Hyaluronsäure, erhalten wie oben beschrieben, sind die folgenden:
¹H-NMR: Zusätzlich zu den typischen Signalen der Hyaluronsäure können einige 0,90 ppm, 1,62 ppm und 2,39 ppm Signale nachgewiesen werden, die jeweils den Protonen der Methyl- und Methylengruppen des Butyrats zugeordnet werden.
Der Veresterungsgrad wurde auf der Basis des NMR-Spektrums geschätzt; die Prozentzahl der Buttersäureester wurde dann durch Integration des Signals bestimmt, bezogen auf die Methylgruppe im Hinblick auf das Signal der N-Acetylgruppe der Hyaluronsäure. Folgend auf dieses Verfahren waren 16% der sich wiederholenden disaccharidischen Einheiten der Hyaluronsäure durch Buttersäurereste substituiert mit einem korrespondierenden DS von 0,08.
Beispiel 3
Herstellung des Buttersäureesters non Hyaluronsäure mit einem Substitutionsgrad DS von 0,2
1,5 g Hyaluronsäure (4 × 10⁴ MW) wurden in einen 1 1 Rundbodenkolben gewogen, ausgerüstet mit einer Rührvorrichtung und gelöst in 50 ml deionisiertem Wasser. Die Lösung wurde mit 1,71 ml HCl, 2 N, angesäuert und nach 5 Minuten wurden 0,993 ml Collidin zugefügt. Nach 5 Minuten wurde die Lösung auf ungefähr die Hälfte des Volumens im Vakuum konzentriert. 190 ml wasserfreies DMF wurden dann zugefügt und das System wurde auf ungefähr 50 bis 60 ml herabkonzentriert. Weiterhin wurden 100 ml wasserfreies DMF zugefügt. Die Lösung wurde wiederum konzentriert. Die Mischung wurde dann mit weiteren 100 ml DMF verdünnt, gefolgt von einer Zugabe von 2,85 ml Pyridin und 1,76 ml Buttersäureanhydrid. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und nach 20 Stunden beendet. Die Lösung durchlief eine Konzentration im Vakuum und dann wurde der Rest in 150 ml deionisiertem Wasser suspendiert. Der pH der Lösung wurde dann auf ungefähr 6,5 mit wässrigem NaHCO₃ eingestellt und die Lösung wurde gegen deionisiertes Wasser (5 × 2 l) deionisiert. Das Produkt wurde durch Gefriertrocknen gewonnen und 1,04 g des Derivats wurden erhalten. Die physiochemischen Eigenschaften der butyrierten Hyluronsäure, wie oben beschrieben, sind die Folgenden:
¹H-NMR: Zusätzlich zu den typischen Signalen der Hyaluronsäure können einige 0,90 ppm, 1,62 ppm und 2,39 ppm-Signale nachgewiesen werden, die jeweils den Protonen der Methyl- und Methylengruppen des Butyrats zugeordnet werden.
Durch Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens waren 40% der sich wiederholenden disaccharidischen Einheiten der Hyaluronsäure mit Buttersäureresten substituiert mit einem korrespondierenden DS von 0,2.
Beispiel 4
Herstellung des Buttersäureesters von Hyaluronsäure mit einem D5 von 0,075
Eine Lösung von 2,0 g Hyaluronsäure (4 × 10⁴ MW) wurde in einen 1 lRundbodenkolben in 60 ml deionisiertem Wasser abgewogen. Die Lösung wurde mit 2,30 ml HCl 2 N angesäuert und nach 5 Minuten wurden 1,32 ml Collidin zugefügt. Die Lösung wurde auf ungefähr ein halbes Volumen konzentriert und dann wurden weiterhin 300 ml wasserfreies DMF zugefügt um eine volle Lösung des Polysaccharids zu erhalten. Die Lösung wurde auf ungefähr 80 ml konzentriert; es wurden weitere 200 ml DMF zugefügt und die Lösung wurde wiederum konzentriert. Das oben beschriebene Verfahren wurde dann wiederholt. Nach weiterer Zugabe von DMF (60 ml) zu der auf diesem Weg erhaltenen Mischung wurden 3,8 ml Pyridin und 1,634 ml Buttersäureanhydrid zugefügt und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 16 Stunden durchgeführt. Die Lösung wurde dann im Vakuum getrocknet und der erhaltene Rest wurde mit 120 ml deionisiertem Wasser zum Erhalt eines dichten Sirups gewonnen, um dann in 50 ml deionisiertem Wasser suspendiert zu werden. Der pH der Lösung wurde dann auf ungefähr 6,5 bis 7 mit wässrigem NaHCO₃ eingestellt und die Lösung wurde gegen deionisiertes Wasser (5 × 1 l) dialysiert. Das Produkt wurde nach Gefriertrocknen gewonnen und 1 g des Produkts wurden erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften der butyrierten Hyaluronsäure wie oben beschrieben sind die Folgenden:
¹H-NMR: Zusätzlich zu den typischen Signalen der Hyaluronsäure können einige 0,90 ppm, 1,62 ppm und 2,39 ppm Signale nachgewiesen werden, die jeweils den Protonen der Methyl- und Methylengruppen des Butyrats zugeordnet werden.
Durch Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens waren 15% der sich wiederholenden disaccharidischen Einheiten der Hyaluronsäure mit Buttersäureresten substituiert mit einem korrespondierenden DS von 0,075.
Beispiel 5
Herstellung des Buttersäureesters von Hyaluronsäure mit einem D5 von 0,06
Eine Lösung, enthaltend 1,5 g Hyaluronsäure (MW 4 × 10⁴) in 60 ml deionisiertem Wasser wurde 5 Minuten in einem Rundbodenkolben gerührt, ausgerüstet mit einer Rührvorrichtung und dann wurden 1,71 ml HCl 2 N zugefügt. Nach weiteren 5 Minuten wurden 0,99 ml Collidin zugefügt und die resultierende Mischung wurde auf ungefähr die Hälfte des Volumens konzentriert. Nach Zugabe von 250 ml wasserfreien DMF wurde die Lösung auf ungefähr 80 ml konzentriert und es wurden weitere 200 ml DMF zugefügt; die Lösung wurde dann wiederum durch Wiederholung des Verfahrens konzentriert und eine schließliche Zugabe von 150 ml wurde durchgeführt.
2,85 ml Pyridin und 1,22 ml Buttersäureanhydrid wurden der Lösung zugefügt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden durchgeführt. Die Mischung wurde unter Vakuum konzentriert und dann wurden 150 ml deionisiertes Wasser zugefügt. Der pH wurde auf ungefähr 6,5 mit NaHCO₃ eingestellt. Die Lösung wurde gegen deionisiertes Wasser (5 × 1 l) dialysiert und gefriergetrocknet; 1,32 g des Produkts wurden gewonnen.
Die physikochemischen Eigenschaften des Butyrats von Hyaluronsäure, erhalten wie oben beschrieben, sind die Folgenden:
¹H-NMR: Zusätzlich zu den typischen Signalen der Hyaluronsäure können einige 0,90 ppm, 1,62 ppm und 2,39 ppm Signale nachgewiesen werden, die jeweils den Protonen der Methyl- und Methylengruppen des Butyrats zugeordnet werden.
Durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurden 12% der sich wiederholenden disaccharidischen Einheiten der Hyaluronsäure durch Buttersäurereste substituiert (DS 0,06).
Beispiel 6
Herstellung des Buttersäureesters von Hyaluronsäure mit DS 0,25
0,75 g Hyaluronsäure (MW 4 × 10⁴) wurden in einen Rundbodenkolben abgewogen, ausgerüstet mit einer Rührvorrichtung und in 40 ml deionisiertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit 0,465 ml HCl 4 N angesäuert und nach 10 Minuten wurden 0,31 ml Collidin und 70 ml DMF zugefügt. Die resultierende Mischung wurde auf 90% des Volumens konzentriert. Nach Zugabe von weiteren 70 ml wasserfreien DMF wurde die Lösung auf 50% des Volumens konzentriert. Das Verfahren wurde zweimal wiederholt. 70 ml Reagenz wurden jedes Mal zugefügt. 40 ml DMF, 3 ml Pyridin und schließlich 1,22 ml Buttersäureanhydrid wurden dann in der Reihenfolge der Mischung zugefügt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und nach 17 Stunden beendet. Nach einer Zugabe von 3 ml Pyridin und 0,56 Bernsteinsäureanhydrid wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 6 Stunden gehalten und dann für eine Zeitspanne von 16 Stunden auf 70°C erwärmt. Die Lösung wurde dann im Vakuum konzentriert und der Rest wurde dann in Wasser gelöst. Der pH der Lösung wurde auf 6 bis 6,5 mit wässrigem NaHCO₃ eingestellt und die Lösung wurde gegen deionisiertes Wasser (5 × 2 l) dialysiert. Das Produkt wurde nach einem Gefriertrocknen gewonnen und es wurden 0,8 g des Derivats erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften des Hyaluronsäurederivats, verestert mit Buttersäure und Bernsteinsäureanhydrid, wie oben beschrieben erhalten sind die Folgenden:
¹H-NMR-spektrum: Zusätzlich zu den typischen Signalen der Hyaluronsäure können 0,90 ppm., 1,62 ppm und 2,39 ppm Signale nachgewiesen werden, die jeweils den Protonen der Buttersäuregruppen zugeordnet werden können.
Durch Verwendung des in Beispiel 2 beschriebene Verfahrens erwiesen sich 50% der sich wiederholenden disaccharidischen Einheiten der Hyaluronsäure als mit Buttersäureresten substituiert (DS 0,25), während 70% der sich wiederholenden disaccharidischen Einheiten succinyliert war (DS 0,35).
Beispiel 7
Herstellung des Buttersäureesters von Hyaluronsäure mit einem DS von 0,3 durch das Homogen-Phasen-Verfahren
Hyaluronsäure (0,10 g) mit einem MW von 4 × 10⁴ wurde in 10 ml DMSO suspendiert und einige Tropfen HCl (37%) wurden zugefügt, um den pH auf einen Wert von 4 bis 5 einzustellen. Die Mischung wurde dann unter magnetischem Rühren bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Auflösung gehalten. Dann wurden 0,40 g Dimethylaminopyridin und 1,14 ml Buttersäureanhydrid der Lösung zugefügt und die Mischung wurde unter konstantem Rühren für 18 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Der pH der Lösung wurde dann auf ungefähr 5 bis 6 mit wässrigen NaHCO₃ angehoben und die Lösung wurde gegen deionisiertes Wasser (5 × 1 l) dialysiert. Die Lösung wurde schließlich gefriergetrocknet und 0,04 g des Buttersäurederivats wurden in Form eines Lyophilisats erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften der butyrierten Hyaluronsäure, wie oben beschrieben erhalten, sind die Folgenden:
¹H-NMR: Zusätzlich zu den typischen Signalen der Hyaluronsäure können einige 0,90 ppm, 1,62 ppm und 2,39 ppm Signale nachgewiesen werden, die jeweils den Protonen der Methyl- und Methylengruppen des Butyrats zugeordnet werden.
Der Veresterungsgrad wurde auf der Basis des NMR-Spektrums bestimmt: die Prozentzahl der Buttersäureester wurde dann durch Integration des Signals bestimmt, bezogen auf die Methylgruppe, im Hinblick auf das Signal der N-Acetlygruppe der Hyaluronsäure. Auf der Basis dieses Spektrums ist der DS 0,3.
Beispiel 8
Herstellung des Buttersäureesters eines Polysaccharids, isoliert aus Grateloupia doryphora mit DS 0,1
0,2 g des sulfatierten Polysaccharids, isoliert aus Grateloupia doryphora wie beschrieben in Beispiel 1, wurden in deionisiertem Wasser (10 ml) in einem Rundbodenkolben gelöst, ausgerüstet mit einer Rührvorrichtung und 0,117 ml HCl 4 N wurden der Lösung, abgekühlt auf 5°C, zugefügt. Die Lösung wurde unter Rühren 5 Minuten gehalten und es wurden weitere 0,99 ml Collidin zugefügt. Nach 15 Minuten wurden weiterhin 30 ml wasserfreies DMF zugefügt und die erhaltene Lösung wurde auf ungefähr 30% des anfänglichen Volumens konzentriert. Nach weiterer Zugabe von 30 ml DMF wurde die Lösung unter Rühren bei einer Temperatur von 5°C für eine Stunde gehalten und 2 ml Pyridin und 0,175 ml Buttersäureanhydrid wurden zugefügt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und nach 42 Stunden beendet. Sie wurde dann konzentriert, um eine dichte Mischung zu erhalten.
Dieser Sirup wurde dann in 75 ml deionisiertem Wasser für 45 Minuten gelöst. Nach Einstellung des pH's auf 6 mit NaHCO₃ wurde die Lösung gegen deionisiertes Wasser (2 × 2 l, 1 × 1 l) dialysiert und schließlich gefriergetrocknet. 0,19 g des Produkts wurden gewonnen.
Die physikochemischen Eigenschaften der Butyrats des sulfatierten Polysaccharids, erhalten aus Grateloupia doryphora, erhalten wie oben beschriebenn, sind die Folgenden:
¹H-NMR-Spektriun: Der Substitutionsgrad wurde durch Integration der Signale im Bereich von 5,5 und 5,0 ppm durchgeführt, zugeschrieben den anomeren Protonen der saccharidischen Reste in α-Konfiguration und dem Signal bis ungefähr 1,0 ppm, zugeschrieben den Methylprotonen von Butyrat. Aus dem Verhältnis zwischen den Integralen ist es möglich festzuhalten, dass die Reste der Buttersäure mit 20% im Hinblick auf die sich wiederholenden saccharidischen Einheiten in α-Konfiguration vorliegen (DS 0,1).
Kolorimetrische Analyse:
Diese Analyse ergab eine Menge der sulfatierten Gruppen von 31% G/G, wie bei dem in Beispiel 1 hergestellten Quell-Polysaccharid.
Beispiel 9
Herstellung des Buttersäureesters von Skleroglucan
0,5 g Skleroglucan (MW 7 × 10⁵) wurden in 75 ml wasserfreiem DMF in einem Rundbodenkolben gelöst, versehen mit einer Rührvorrichtung. Die erhaltene Mischung wurde für eine Stunde bei einer Temperatur 50°C erwärmt und wurde dann unter Rühren bei der Temperatur von 70°C für 3 Stunden erhalten. Die Lösung wurde auf 55°C abgekühlt und dann wurden 0,25 ml Pyridin und 0,15 g Bernsteinsäureanhydrid zugefügt. Die erhaltene Mischung wurde unter Rühren bei einer Temperatur von 55°C für 64 Stunden gehalten. Die Mischung wurde dann zum Erhalt eines dichten Sirups konzentriert, der dann in 75 ml deionisiertem Wasser wieder suspendiert wurde. Nach Einstellung des pH's auf 6 mit NaHCO₃ wurde die Mischung gegen deionisiertes Wasser (4 × 2 l) dialysiert. Die auf diesem Weg erhaltene Lösung wurde dann filtriert und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde in 20 ml Wasser in 60 Minuten in einem Rundbodenkolben, versehen mit einer Rührvorrichtung, gelöst. Nach Zugabe von 0,65 ml HCl 2 N wurde die Lösung wenn und opaque und wurde unter Rühren 5 Minuten gehalten. Dann wurde 1 ml Pyridin zugefügt und man ließ die Lösung 10 Minuten bei einem pH von 4 bis 5 rühren. Es wurden 75 ml wasserfreies DMF zugefügt und die Mischung wurde auf ein Volumen von 72 ml konzentriert. Das Verfahren wurde einmal wiederholt und 70 ml der Lösung wurden entfernt. Nach Zugabe von 30 ml DMF und 2 ml Pyridin wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 15 Minuten gehalten. 0,38 ml Buttersäureanhydrid wurden zugefügt und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden durchgeführt. Nach einer Konzentration wurde der Rest in Wasser wieder suspendiert und sein pH wurde auf 6,9 mit wässrigem NaHCO₃ eingestellt. Die auf diesem Weg erhaltene Mischung wurde gefriergetrocknet und dann eingefroren. 0,196 g des Produkts wurden erhalten.
Tests auf die biologische Aktivität
Beispiel 10
Test auf die in vitro antiproliferative Aktivität
Material und Methoden
Die antiproliferative Aktivität der Buttersäureester der Erfindung wurde an verschiedenen Tumorzellinien getestet und insbesondere:

– MCF7: Zellen von hormonabhängigem Brust-Karzinom;
– MDA-MB231: Zellen von hormonabhängigem Brust-Karzinom;
– IGROVI: Zellen von Ovarkarzinom;
– HeLa: Zellen aus Cervix-Karzinom;
– CaLu: Zellen aus Lungen-Karzinom;
– HT29: Zellen aus Colon-Karzinom.

Die obigen Zellen wurden als Monolayer auf DMEM/F12 Dulbecco-modifiziertem Eagle's Medium (Sigma Chemical Co., St. Louis), supplementiert mit 2% V/V FCS (foetales Kälberserum) in einer T-75 cm² Kunststofflasche (Corning Industries, Corning, NY), gehalten bei einer Temperatur von 37°C, unter feuchter Atmosphäre, enthaltend 5% CO₂ gezüchtet. Sie werden wöchentlich in ein frisches Medium übertragen. Vor dem Beginn der Experimente wurden die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase aus den Kolben mit einer 0,05% Trypsin- und 0,02% EDTA-Lösung entfernt. Die Zellen wurden dann in Schalen mit 12 Vertiefungen ausgesät (50.000 Zellen/Vertiefung) auf DMEM/F12 Medium, supplementiert mit 2% FCS. Die Zellen wurden dann 24 Stunden gezüchtet, um die Adhäsion zu unterstützen und das Medium wurde dann entfernt und durch das experimentelle Medium ersetzt. Die Zellen wurden dann 6 bis 9 Tage auf einen DMEM/F12-Medium, supplementiert mit 2% FCS, gehalten und verschiedene Konzentrationen der Verbindungen der Beispiele 2 und 4 gemäß der vorliegenden Erfindung wurden zugefügt. Ein Vergleichstest wurde mit Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 4 × 10⁴, zugefügt mit den selben Konzentrationen, durchgeführt.
Die HeLa- und CaLu-Zellen wurden wie oben für die anderen Zellinien beschrieben behandelt, unter Verwendung des DMEM/F12-Mediums, supplementiert mit 10% FCS und 1% Glutamin im HeLa-Fall und das RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 10% FCS und 1% Glutamin im Fall von CaLu anstelle des DMEM/F12-Mediums, supplementiert mit 2% FCS.
Die antiproliferative Aktivität wurde durch colorimetrische Bestimmung der DNA-Gehaltsvariation (Burton-Verfahren) bestimmt, was proportional zur Zahl der Zellen ist und auf der colorimetrischen Reaktion zwischen Biphenylamin und den Indolgruppen der durch Temperatur denaturierten DNA basiert.
Ergebnisse
Tabelle 1 zeigt die Wachstumsprozentzahl der Zellinie des MCF7 Brust-Karzinoms in Gegenwart der Buttersäureester der Polysaccharide gemäß der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf unbehandelte Zellen (Kontrolle), nach 6 Tagen Behandlung. Jeder Wert ergibt sich aus dem Mittel von 4 Tests (wurde nach 4 Tests gemittelt) gemäß dem faktoriellen Ziehen (factorial drawing) 4 × 4.
Die Molarität der Buttersäureester der Erfindung wird auf die Molarität des Butyrats, das in dem Ester selbst vorliegt, bezogen. Soweit die Hyaluronsäure betroffen ist, ist die Molarität dieselbe wie die Molarität der Verbindung gemäß Beispiel 2, wo dieselbe Menge an Hyaluronsäure vorliegt.
Aus den oben dargestellten Zahlen ergibt sich deutlich, dass die Buttersäureester gemäß der vorliegenden Erfindung eine hohe antiproliferative Aktivität im Hinblick auf die Kontrolle und im Hinblick auf die nicht veresterte Hyaluronsäure ausüben können.
Tabelle 2 zeigt die Wachstumsprozentzahl der Zellinien von MCF7 Brust-Karzinom in Gegenwart der Buttersäureester gemäß der vorliegenden Erfindung nach 6 Behandlungstagen im Hinblick auf nicht behandelte Zellen (Kontrolle), im Hinblick auf das nicht butyrierte natürliche Polysaccharid, extrahiert aus Grateloupia doryphora gemäß Beispiel 1 und im Hinblick auf das nicht veresterte Skleroglucan, das als Quell-Produkt für die in Beispiel 9 beschriebene Synthese verwendet wird.
Selbst in diesem Fall wurde jeder Wert nach 4 Tests Bemittelt, placiert auf die Schale gemäß dem faktoriellen Ziehen 4 × 4. Die Konzentrationen der getesteten Verbindungen sind als mg der Verbindung pro ml der Gesamtlösung ausgedrückt.
Die Zahlen zeigen, dass die oben erwähnten Buttersäureester eine hohe antiproliferative Aktivität im Hinblick auf die Leerprobe, das Polysaccharid gemäß Beispiel 1 und das Skleroglucan ausüben.
1 zeigt die oben beschriebenen Zahlen im Hinblick auf. die antiproliferative Aktivität der Verbindungen gemäß Beispiel 3, 4, 6, 8 und 9 gemäß der vorliegenden Erfindung in graphischer Form durch Nachweis der prozentualen Inhibition der Tumorzell-Proliferation als Funktion der Konzentration der getesteten Verbindungen (ausgedrückt als mg der Verbindung pro ml der Gesamtlösung).
Weiterhin zeigt Tabelle 3 die Werte von IC50 (notwendige Konzentration zur Inhibition des Zellwachstums um 50%) der Buttersäureester gemäß der vorliegenden Erfindung nach 6 Behandlungstagen von unterschiedlichen Tumorzellinien. Die Konzentrationen der Ester der Erfindung sind sowohl als Molaritäten des in dem Ester selbst vorliegenden Butyrats (mM) als auch als mg der Verbindung pro ml der Gesamtlösung (mg/ml) ausgedrückt.
Beispiel 11
In vitro antiproliferative Aktivität des Butyrats von Hyaluronsäure wie beschrieben in Beispiel 2 im Hinblick auf Einzelbestandteile (Hyaluronsäure und Buttersäure) und ihre physikalische Mischung
Material und Methoden
Zellen der MCF7-Linien des hormonabhängigen Brust-Karzinoms, behandelt und kultiviert wie beschrieben in Beispiel 10, wurden für 6 Tage auf einem DMEM/F12-Medium, supplementiert mit 2% FCS in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen des Buttersäureesters gemäß Beispiel 2 gemäß der vorliegenden Erfindung, seiner Bestandteile, d. h. Hyaluronsäure (MW 4 × 10⁴), mit Buttersäure und der physikalischen Mischung von Hyaluronsäure und Buttersäure gehalten.
Die antiproliferative Aktivität wurde gemäß dem Burton-Verfahren wie beschrieben in Beispiel 10, bestimmt.
Ergebnisse
Tabelle 4 zeigt die antiproliferative Aktivität des Butyrats der Hyaluronsäure wie beschrieben in Beispiel 2 auf das Wachstum der MCF7-Zellinien nach 6 Behandlungstagen im Vergleich zu der Wirkung von Hyaluronsäure, von Natriumbutyrat und der physikalischen Mischung beider Komponenten, verwendet mit denselben Konzentrationen und unter denselben experimentellen Bedingungen.
Die oben berichteten Zahlen geben die Prozentzahl der Inhibition des Zellwachstums im Hinblick auf die nicht behandelten Zellen (Kontrolle) an. Die Molaritäten (mM) werden im Hinblick auf die Molaritäten der überprüften Verbindungen angegeben; für die Hyaluronsäure zeigt die Molarität dieselbe Quantität der Hyaluronsäure in dem Buttersäureester wie beschrieben in Beispiel 2 an, wo der Molaritätswert auf die Butyratkonzentration bezogen ist.
2 illustriert die oben beschriebenen Zahlen in einer Darstellung, die die prozentuale Inhibition des Zellwachstums gegenüber der Konzentration der getesteten Verbindungen zeigt.
Diese Zahlen zeigen, dass die Buttersäureester der Polysaccharide eine anti-proliferative Aktivität ausüben können, die unerwartet höher ist als die durch die Mischung der Bestandteile ausgeübte Aktivität.
Beispiel 12
In vitro anti-proliferative Aktivität der Buttersäureester gemäß Beispiel 3 und 4 im Hinblick auf Natriumbutyrat Materialien und Methoden Zellen des Brust-Karzinoms der hormonabhängigen MDA-MB231-Linie, behandelt und kultiviert wie beschrieben in Beispiel 10, wurden 6 Tage auf DMEM/F12-Medium, supplementiert mit 2% FCS, in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von Buttersäureestern wie in Beispiel 3 und 4 gemäß der vorliegenden Erfindung und von Natriumbutyrat gehalten.
Die anti-proliferative Aktivität wurde gemäß dem Burton-Verfahren, wie beschrieben in Beispiel 10, bestimmt.
Ergebnisse
3 zeigt die anti-proliferative Wirkung des Buttersäureesters der Beispiele 3 und 4 auf das Wachstum der MDA-MB231-Zellinie nach 6 Behandlungstagen als Vergleich zur Wirkung von Natriumbutyrat, verwendet in denselben Konzentrationen und unter denselben experimentellen Bedingungen. Das Diagramm zeigt die prozentuale Inhibition des Zellwachstums gegenüber der Konzentration der getesteten Verbindungen (die (mM) Molarität bezieht sich auf die Konzentration des Butyrats in den überprüften Verbindungen).

Claims

Buttersäureester eines Polysaccharids, worin die Hydroxygruppen des Polysaccharids teilweise oder vollständig mit Buttersäureresten verestert sind, wobei das Polysaccharid ausgewählt ist aus Hyaluronsäure, β(1→3)-D-Glucan und sulfatiertem Polysaccharid, extrahiert aus Grateloupia doryphora.
Buttersäureester gemäss Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass das Polysaccharid an den Kohlenstoffatomen des glycosidischen Rings mindestens einen Substituenten aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -NH₂, -NH-COR, -OSO₃H, -OPO₃H₂, -COOH, -COO-(CH₂)_n-COOH, -COOR, -COR, -OR und O-(CH₂)_n-O-COR, worin n = 1 bis 4 und R = C_1-10-Alkyl.
Buttersäureester gemäss Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die freien Hydroxylgruppen des glycosidischen Rests des Polysaccharids mit einem oder mehreren Dicarbonsäureresten verestert sind.
Buttersäureester gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicarbonsäurereste C_2-9-Reste sind.
Buttersäureester gemäss Anspruch 4, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die Dicarbonsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Bernsteinsäure, Weinsäure, Äpfelsäure und Azelainsäure.
Buttersäureester gemäss Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die Anzahl der mit Buttersäureresten veresterten Hydroxygruppen für jedes glycosidische Monomer höher als 0,001 ist.
Buttersäureester gemäss Anspruch 6, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die Anzahl der mit Buttersäureresten veresterten Hydroxygruppen zwischen 0,001 und 3 liegt.
Buttersäureester gemäss Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die Anzahl der mit Buttersäureresten veresterten Hydroxygruppen zwischen 0,01 und 1 liegt.
Buttersäureester gemäss Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass das durchschnittliche Molekulargewicht des Buttersäureesters höher als 2 × 10³ liegt.
Buttersäureester gemäss Anspruch 9, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass das durchschnittliche Molekulargewicht des Polysaccharids, extrahiert aus Grateloupia doryphora zwischen 1 × 10⁴ und 5 × 10⁶ liegt.
Buttersäureester gemäss Anspruch 9, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass das durchschnittliche Molekulargewicht des β(1→3)-D-Glucans zwischen 1 × 10⁴ und 1 × 10⁶ liegt.
Buttersäureester gemäss Anspruch 9, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass das durchschnittliche Molekulargewicht der Hyaluronsäure zwischen 1 × 10⁴ und 2 × 10⁶ liegt.
Buttersäureester gemäss Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass das β(1→3)-D-Glucan weiterhin β(1→6)-glucosidische Reste enthält.
Buttersäureester gemäss Anspruch 13, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass das Glucan Scleroglucan ist.
Verfahren zur Herstellung eines Buttersäureesters eines Polysaccharids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beschrieben, umfassend die Behandlung des Polysaccharids mit Buttersäure oder einer ihrer aktivierten Formen, in einem homogenen oder heterogenen System, möglicherweise in einem geeigneten Lösungsmittel und/oder in Gegenwart eines geeigneten Katalysators.
Verwendung des Buttersäureesters eines Polysaccharids, dessen Hydroxygruppen teilweise oder vollständig mit Buttersäureresten verestert sind, für die Herstellung eines antiproliferativen Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung von Krankheiten, gekennzeichnet durch abnorme Zellproliferation.
Verwendung gemäss Anspruch 16, wobei die Proliferation neoplastische Zellen oder synoviale Zellen und Zellen des Gastrointestinaltrakts involviert.
Verwendung gemäss Anspruch 16, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass der Buttersäureester über die folgenden Verabreichungswege verabreicht wird: oral, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, intraartikulär, rektal, intravaginal, subkutan oder topisch.
Verwendung gemäss Anspruch 16, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass der Buttersäureester in Dosierungen im Bereich von 0,2 bis 500 mg/kg/Tag für eine Zeitspanne von 1 bis 15 Tagen verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als Wirkstoff eine therapeutisch effektive Menge von mindestens einem Buttersäureester eines Polysaccharids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beschrieben, in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Hilfsmitteln und/oder Verdünnungsmitteln.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 20, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie oral in Form von Körnchen, Tabletten, Pillen oder als Gel verabreicht werden kann.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 20, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie über die folgenden Verabreichungswege verabreicht werden kann: systemisch, intravenös, intraperitoneal, intraartikulär, subkutan oder intramuskulär, in Form einer wässrigen Lösung oder Suspension.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 20, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie auch ein oder mehrere Antikrebsmittel beinhaltet.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 23, wobei das Antitumormittel gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 5-Fluoruracil, Cisplatin und Cyclophosphamid.