DE69813855T2

DE69813855T2 - Oligosaccharidderivate und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69813855T2
Application number: DE69813855T
Authority: DE
Inventors: Masato Minato-ku NAGAOKA; Hideyuki Minato-ku SHIBATA; Itsuko Minato-ku KIMURA; Shusuke Minato-ku HASHIMOTO
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1998-08-21
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2018-08-22
Also published as: CA2301893A1; JPH1160590A; EP1020474B1; ATE238327T1; US6645940B2; CN1275129A; PT1020474E; AU8748298A; DK1020474T3; US6518249B1; KR20010040236A; EP1020474A4; US20030109489A1; WO1999010360A1; EP1020474A1; ES2197492T3; AU728628B2; DE69813855D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligosaccharid-Derivat und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Spezieller betrifft die Erfindung ein Oligofucose- oder Oligorhamnose-Derivat, das für die Verhütung und Behandlung von Entzündung und Ulzeration der Mukosa von gastrischen Organen, wie Magen und Duodenum, wirksam ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Herkömmliche Antiulkus-Mittel schließen diejenigen zur Steuerung der Magensaftsekretion ein, wie H₂-Blocker und Protonenpumpen-Inhibitoren. Für den Zweck der aktiven therapeutischen Behandlung von Gastritis und gastrischen Mukosazellen ist in letzter Zeit die Verwendung von Prostaglandinen oder basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktoren untersucht worden. Diese Arzneimittel stellen einerseits effiziente therapeutische Wirkungen bereit. Andererseits verursachen jedoch diese Arzneimittel potentiell den Beginn eines Ulkus, speziell das Wiederauftreten von Ulkus, für das eine spezielle Bakterienart, Helicobacter pylori, verantwortlich ist. Deshalb wird bemerkt, dass gastrische Ulcera im wesentlichen einschließlich der Desinfektion der bakteriellen Spezies behandelt werden sollten (Masahiro Asaka, "Helicobacter pylori und Krankheiten der gastrischen Mukosamembran", Sentan-Igaku-Sha (Top Medicine Press), 1. Juli 1995).
Es ist zusätzlich bekannt, daß mikrobielle Zellen gewisser Arten von Bifidobakterien oder Milchsäurebakterien und Polysaccharide oder Oligosaccharide, die aus diesen mikrobiellen Zellen hergestellt sind, Phaeophyceae Chordariales nemacystus oder grüner Tang (Monostroma nitidum) nicht nur bei der Verhütung einer Ulzeration, sondern auch bei der Förderung der Heilung derselben wirksam sind und so als Antiulkus-Mittel nützlich sind (JP-A-6-247861; JP-A-7-138166). Die Polysaccharide und Oligosaccharide umfassen hauptsächlich Fucose und/oder Rhamnose. Speziell übt Fucoidan, ein Fucose-Polymer, Wirkungen aus, um die Ulkus-Bildung zu verhüten und das Heilen einer Ulzeration zu fördern, und übt zusätzlich die Wirkung aus, die Anhaftung von H. pylori zu inhibieren. Nichtsdestoweniger sind diese Polysaccharide und Oligosaccharide als solche bezüglich ihrer Antiulkus-Aktivität nicht zufriedenstellend. Weiter ist es schwierig, diese Polysaccharide und Oligosaccharide in homogenem Zustand, einschließlich der Homogenität ihrer Molekulargewichte, zu gewinnen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Hauptziel der Erfindung, ein Oligosaccharid-Derivat mit hoher Homogenität und größeren Antiulkus-Wirkungen als denjenigen der oben erwähnten herkömmlichen Polysaccharide bereitzustellen, und ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung derselben bereitzustellen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Oligosaccharid-Derivat bereitgestellt, das durch die folgende allgemeine Formel: Y₁-OCH(CH₂NHR) ₂ dargestellt wird, in der Y₁ eine Oligofucose mit einer Polymerisationszahl von 2 bis 20 darstellt, worin die Hydroxylgruppen in Form von Sulfatester partiell modifiziert sein können oder nicht, und R eine Phenylgruppe, eine Höheralkylphenylgruppe, eine Höheralkylgruppe oder -(CH₂)_n-NHX darstellt, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und X eine Höheralkanoylgruppe oder eine Alkylaminogruppe mit oder ohne Substituenten darstellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein Oligosaccharid-Derivat bereitgestellt, das durch die folgende allgemeine Formel: Y₂-OCH(CH₂NHR)₂ dargestellt wird, in der Y₂ eine Oligorhamnose mit einer Polymerisationszahl von 2 bis 20 darstellt, worin die Hydroxylgruppen in Form von Sulfatester partiell modifiziert sein können oder nicht, und R eine Phenylgruppe, eine Höheralkylphenylgruppe, eine Höheralkylgruppe oder -(CH₂)_nNHX darstellt, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und X eine Höheralkanoylgruppe oder eine Alkylaminogruppe mit oder ohne Substituenten darstellt.
Die Oligosaccharid-Derivate weisen verschiedenen Eigenschaften einschließlich einer ausgezeichneten Antiulkus-Wirkung auf.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharid-Derivats bereit, welches die Schritte umfaßt: Überführen des Zuckerrestes am reduzierenden Ende der Oligofucose oder Oligorhamnose durch oxidativen Abbau in eine Aldehydgruppe, Erzeugen einer Schiff-Base, indem man die Aldehydgruppe mit entsprechenden Alkylaminen und/oder Allylaminen reagieren läßt, und Reduzieren der Schiff-Base, um ein Oligosaccharid-Derivat zu erhalten.
Das heißt, im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird Fucoidan (Fucose-Polysaccharid) oder Rhamnan (Rhamnose-Polysaccharid) durch eine Säurebehandlung zu einem Oligosaccharid (einem Oligomer, das etwa 3 bis 20 Moleküle Fucose oder Rhamnose umfaßt) modifiziert, und dann wird das Oligosaccharid einer Oxidation mit Periodat, einer Umsetzung mit entsprechenden Aminen und einer reduzierenden Behandlung unterzogen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Inhibitor für H. pylori bereitgestellt, welcher das Oligosaccharid-Derivat, nämlich das Oligofucose-Derivat und/oder Oligorhamnose-Derivat gemäß der vorliegenden Endung, umfaßt.
Gemäß noch einem werteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel zur Verhütung und therapeutischen Behandlung von gastrischem Ulkus bereitgestellt, wobei das Mittel das Oligosaccharid-Derivat, nämlich das Oligofucose-Derivat und/oder Oligorhamnose-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung, umfaßt.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharid-Derivats die folgenden Schritte 1 bis 8.
Schritt 1: Unter Verwendung von bekannten Extraktionsverfahren werden Polysaccharide aus Meeresalgen (wie Phaeophyceae Chordariales nemacystus, Hydrilla, Fucus und Monostroma nitidum) extrahiert, welche Fucoidan, Rhamnan oder Rhamnansulfat enthalten.
Schritt 2: Die gewonnenen Polysaccharide werden in eine etwa 0,075 N bis 0,1 N Chlorwasserstoffsäure- oder Trifluoressigsäure-Lösung gelöst; die Mischung wird 10 bis 20 Minuten bei 100°C erwärmt, um die Polysaccharide zu der Form von Oligosacchariden zu modifizieren. Nach der Behandlung wird die resultierende Reaktionsmischung mit Natriumhydroxid neutralisiert, gefolgt von der Zugabe von NaBH₄ zu der neutralisierten Mischung für eine reduktive Behandlung über 16 Stunden bei Umgebungstemperatur oder 4°C.
Schritt 3: Die Lösung der Oligosaccharide in der Alditol-Form, wie durch die Verfahren des Schritts 2 gewonnen, wird durch Dialyse (ein fraktionierendes Molekulargewicht von 500) oder Elektrodialyse oder unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes entsalzt.
Schritt 4: Zu der in Schritt 3 gewonnenen Lösung wird Natriummetaperiodat für eine Umsetzung in einem Gefäß zugesetzt, das etwa eine Stunde lang in einem Eisbad eingetaucht ist. Hierbei kann ein Oligosaccharid mit einer solchen Struktur, daß Zucker, außer den Zuckern an den reduzierenden Enden oder den nicht-reduzierenden Enden, nicht oxidiert werden, beispielsweise (1 → 3) Oligosaccharid, der Umsetzung zufriedenstellend über eine längere Zeitspanne unterzogen werden. Ethylenglycol mit einem Volumen im Überschuß über Periodsäure wird der Reaktionslösung für eine zusätzliche Reaktion über etwa eine Stunde zugesetzt. Die resultierende Lösung wird auf die gleiche Weise wie im Schritt 3 einer Entsalzung unterzogen. Durch das Verfahren kann ein Oligosaccharid-Derivat (in Flüssigkeit) mit einer Aldehydgruppe am Ende gewonnen werden.
Schritt 5: Essigsäure wird der Lösung aus Schritt 4 bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugesetzt, welche bei Umgebungstemperatur über 20 Stunden einer Reaktion unterzogen wird. Die Reaktionslösung wird gegen eine Dialysemembran mit einem fraktionierenden Molekulargewicht von 500 dialysiert; die innere Dialyse-Rückstandslösung wird gefriergetrocknet, um ein gewünschtes Oligosaccharid zu gewinnen. Zusätzlich kann die Oligosaccharid-Fraktion durch Dialyse entsalzt werden. Alternativ kann die Oligosaccharid-Fraktion durch Chromatographie auf einer Aktivkohle-Säule und durch Gelfiltration fraktioniert und entsalzt werden, um eine Fraktion mit einem geeigneten Molekulargewicht herzustellen.
Schritt 6: Die im Schritt 5 gewonnene Oligosaccharid-Fraktion wird in einer wäßrigen Lösung gelöst, die 40% bis 50% Propanol enthält, gefolgt von der Zugabe von Allylaminen oder Alkylaminen für eine Umsetzung über 2 Stunden bei 45°C, um eine Schiff-Base herzustellen. In diesem Fall kann jede Substanz (Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid usw.), die Oligosaccharide und Alkylamine lösen kann, zufriedenstellend als Lösungsmittel verwendet werden. Dann kann irgendein Alkylamin und irgendein Allylamin ohne spezielle Beschränkung zur Verwendung in der Reaktion zufriedenstellend ausgewählt werden; Aniline mit oder ohne Substituenten und höhere Alkylamine mit oder ohne Substituenten werden bevorzugt, wobei die Substituenten beispielsweise Alkylgruppen, Alkanoylaminogruppen und Alkylaminogruppen einschließen.
Schritt 7: Volan-Trimethylamin wird zu der in Schritt 6 gewonnenen Lösung gegeben, um die Schiff-Base über 20 Stunden bei 45°C zu reduzieren. Zusätzlich zu Volan-Trimethylamin können Reduktionsmittel, die den Zweck erfüllen (beispielsweise Volan-Dimethylamin, NaCNBH₃, NaBH₄ usw.) geeignet verwendet werden.
Schritt 8: Nach Beendigung der Reduktion im Schritt 7 wird das Lösungsmittel mittels eines Verdampfers und dergleichen abdestilliert; durch anschließende Verteilung der resultierenden Lösung in einem Lösungsgemisch Chloroform : Methanol : Wasser = 2 : 1 : 1 wird die resultierende wäßrige Phase gesammelt. Durch Spülen der wäßrigen Phase mit Chloroform und Gefriertrocknen der wäßrigen Phase kann ein Oligosaccharid-Derivat gewonnen werden, das einen Oligosaccharidalkylamin-Komplex umfaßt.
Abhängig von den Eigenschaften des Alkylamins können geeignete Lösungsmittel gewählt und für die Verteilung und Extraktion verwendet werden.
Es wurde verifiziert, daß das Oligosaccharid-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung die Wirkung ausübt, die Anhaftung von H. pylori als verursachender Bakterienspezies von gastrischem Ulkus zu inhibieren, sowie die Wirkung, durch Essigsäure induziertes Ulkus therapeutisch zu behandeln.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das pharmazeutische Mittel zur Verhütung und therapeutischen Behandlung von gastrischem Ulkus in geeignet ausgewählten pharmazeutischen Dosierungsformen hergestellt werden, die in einer geeignet gewählten Menge verabreicht werden können. Im allgemeinen wird jedoch das pharmazeutische Mittel mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger in flüssiger oder fester Form gemischt, gefolgt von der Zugabe von Lösungsmitteln, Dispergiermitteln, Emulgatoren, Puffern, Stabilisatoren, Trägem, Bindemitteln, Zerfallsmitteln und Gleitmitteln und dergleichen, und die resultierende Mischung wird als Tabletten, Granalien, Pulver, pulverförmige Formulierungen, Kapseln und dergleichen zur Verwendung formuliert. Die Dosis des pharmzeutischen Mittels liegt geeignet im Bereich von etwa 0,1 bis 10 mg/kg, vorzugsweise von 0,3 bis 3 mg/kg pro Tag bei den meisten Erwachsenen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein ¹³C-NMR-Schaubild des Oligofucosedodecylanilin-Derivats (OFDAD);
2 zeigt das IR-Schaubild des Oligofucosedodecylanilin-Derivats (OFDAD); und
3 zeigt ein Flußdiagramm des Verfahrens, ein Ulkus mit Essigsäure zu induzieren.
BESTE WEISE ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Beispiel 1 (Herstellung des Oligofucose-Derivats)
(1-1) Extraktion von Fucoidan und Herstellung von Fucose-Oligosaccharid.
Cladosiphon okamuranus Tokida, entsalzt in deionisiertem Wasser, wurde in einem Verhältnis von 1 kg Algen pro 1 l deionisiertes Wasser suspendiert. Die Suspension wurde unter Verwendung von Salzsäure auf pH 2 eingestellt. Die resultierende Suspension wurde erwärmt und 10 Minuten bei 100°C extrahiert, dann wurden die Algen durch Mull filtriert und gewonnen; das Filtrat wurde 60 Minuten lang bei 9.000 UpM zentrifugiert, um unlösliche Materialien zu verwerten.
Der resultierende Überstand wurde unter Verwendung von NaOH neutralisiert, gefolgt von der Zugabe von Natriummetaperiodat auf eine Endkonzentration von 0,2 M, um kontaminierende Algininsäure zu zersetzen, und darauf folgte eine Umsetzung im Dunkeln über 20 Stunden; und dann wurde Ethylenglycol zu der Reaktionsmischung gegeben, um die Reaktion zu beenden. Natriumborhydrid wurde zu der resultierenden Lösung auf eine Endkonzentration von 0,2 M für eine Umsetzung bei Umgebungstemperatur über 16 Stunden gegeben. Die Lösung wurde durch Ultrafiltration (fraktionierendes Malekulargewicht von 5.000) konzentriert und anschließend dialysiert. Unter Verwendung von Salzsäure wurde die innere Dialyse-Rückstandslösung auf pH 2 eingestellt und 10 Minuten unter Erwärmen bei 100°C behandelt. Die resultierende Lösung wurde dialysiert und gefriergetrocknet, um Fucoidan zu gewinnen (4 g/l kg nasse Algen).
Das Fucoidan wurde auf eine Endkonzentration von 200 mg/ml gelöst, gefolgt von der Zugabe von Salzsäure (oder Trifluoressigsäure) auf eine Endkonzentration von 0,075 bis 0,1 M. Die resultierende Mischung wurde 10 Minuten bei 100°C erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde mit NaOH neutralisiert, gefolgt von der Zugabe von NaBH₄ in einem Verhältnis von 200 mg pro Gramm Fucoidan für eine Reaktion bei 4°C über 20 Stunden. Die Reaktionslösung wurde unter Verwendung von Essigsäure auf pH 6 eingestellt und durch eine Elektrodialyse-Apparatur (Microacilyzer^TM mit einer Membran AC220; hergestellt von Asahi Chemicals, Co.) entsalzt. Nach dem Entsalzen wurde NaIO₄ auf eine Endkonzentration von 0,2 M zu der Probenlösung für eine Umsetzung in einem Gefäß gegeben, das eine Stunde in ein Eisbad eingetaucht wurde. Ethylenglycol mit einer Menge, die 2 Äquivalenten Periodat entsprach, wurde zu der Reaktionslösung für eine anschließende Reaktion in dem Gefäß gegeben, das eine Stunde in das Eisbad eingetaucht wurde. Die Reaktionslösung wurde durch eine Dialysemembran mit einem fraktionierenden Molekulargewicht von 500 (hergestellt von Spectrum Co.) dialysiert; die resultierende innere Dialyse-Rückstandslösung wurde gefriergetrocknet, um eine Oligosaccharid-Probe (mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 1.000 bis 3.000 oder einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 8 bis 14) zu gewinnen.
(1–2) Oxidation von Fucose-Oligosaccharid mit Periodsäure
NaIO₄ wurde zu 100 ml einer 2%-igen Lösung eines Fucose-Oligosaccharids auf eine Endkonzentration von 0,2 M für eine Umsetzung in einem Gefäß gegeben, das über eine Stunde in ein Eisbad eingetaucht wurde. Ein gleiches Volumen Ethylenglycol wurde zu der Reaktionslösung für eine Reaktion in dem Gefäß gegeben, das eine Stunde in das Eisbau eingetaucht wurde. Die resultierende Reaktionslösung wurde auf eine 500 ml-Säule geladen, die mit Aktivkohle (Aktivkohle für die Chromatographie; hergestellt von Wako Pure Chemicals, Co., Ltd.) gepackt war; und dann wurden nichtadsorbierte Materialien in 3 l Wasser eluiert. 3 l 35%-iges Ethanol wurden in die Säule gegeben, um die adsorbierte Fraktion zu gewinnen. Die Fraktion wurde mit einem Verdampfer konzentriert, um ein Oligosaccharid in Aldehyd-Form zu gewinnen (mit einer Ausbeute von etwa 25%).
(1–3) Umsetzung mit Aminen und Reduktion
Das wie oben in (1–2) hergestellte Aldehyd-Derivat des Oligosaccharids wurde in 50% n- Propanol/Wasser auf ein Endverhältnis von 50 mg/ml gelöst, gefolgt von der Zugabe von Dodecylanilin in einem Verhältnis von 10 mg/ml für die anschließende Umsetzung über 2 Stunden bei 45°C; und zu der resultierenden Reaktionsmischung wurde anschließend ein Volan-Dimethylamin-Komlplex auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml für eine 20-stündige Reaktion bei 45°C gegeben. Die resultierende Reaktionslösung wurde unter verringertem Druck zu einem Festkörper getrocknet. Nach anschließender Zugabe eines Lösungsgemisches aus Chloroform : Methanol : Wasser = 2 : 1 : 1 zu dem resultierenden festen Rückstand wurde die resultierende wäßrige Phase gesammelt, zu der ein gleiches Volumen Chloroform zum Abtrennen und Spülen gegeben wurde. Das Verfahren wurde zweimal wiederholt. Die resultierende wäßrige Phase wurde gefriergetrocknet, um das Oligofucosedodecylanilin-Derivat, OFDAD, zu gewinnen (mit einer Ausbeute von etwa 64%). Die Struktur des Derivats wurde auf der Grundlage der analytischen Ergebnisse durch Methylierungsanalyse und NMR als die folgende Formel 1 bestimmt. Weiter sind die Hydroxylgruppen an der Position 4 in den Fucose-Resten teilweise als Sulfatester modifiziert. 1 zeigt ein ¹³C-NMR-Schaubild des Oligofucosedodecylanilin-Derivats, OFDAD, und 2 zeigt ein IR-Schaubild des Oligofucosedodecylanilin-Derivats, OFDAD.
Anstelle von Dodecylanilin wurden Alkylamine, wie Hexylanilin, Anilin oder Laurylamin für eine ähnliche Reaktion wie in (1–3) verwendet; die Reaktionslösung wurde ähnlich abgetrennt, um Oligofucose-Derivate, wie das Oligofucosehexylanilin-Derivat (OFHAD) der Formel 2, das Oligofucoseanilin-Derivat (OFAN) der Formel 3 und das Oligofucoselaurylamin-Derivat (OF-LA) der Formel 4, zu gewinnen.
Beispiel 2 (Herstellung von Oligorhamnose-Derivat)
(2–1) Herstellung von Rhamnose-Oligosaccharid
Getrocknete Algen von grünem Tang (Monostroma nitidum) wurden in Wasser mit einem 10-fachen Volumen suspendiert und 2 Stunden bei 100°C erwärmt, um Rhamnansulfat herauszulösen. Die resultierende Lösung wurde zentrifugiert, um feste Materialien zu verwerfen, gefolgt von der Zugabe von Ethanol, um Polysaccharide zu fällen und zu sammeln, die dann in Wasser gelöst wurden; die resultierende Lösung wurde einer Dialyse unterzogen, um niedermolekulare Komponenten zu entfernen; Rhamnansulfat wurde in der resultierenden inneren Dialyse-Rückstandslösung gewonnen. Anschließend wurde Salzsäure zu der inneren Dialyse-Rückstandslösung, die Rhamnansulfat enthielt, auf eine Endkonzentration von 0,01 N gegeben, und die resultierende Mischung wurde bei 100°C erwärmt, um die Entschwefelung zu induzieren. Anschließend wurde die resultierende Lösung wieder dialysiert, um Rhamnan in der inneren Dialyse-Rückstandslösung zu gewinnen.
Auf ähnliche Weise, wie oben für Fucoidan beschrieben, wurde das Rhamnan einer Zersetzung mit schwachen Säuren, einer Reduktion und einer Periodat-Oxidation unterzogen, um ein Oligosaccharid-Derivat in Aldehyd-Form zu gewinnen (mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 1.000 bis 1.500).
(2–2) Umsetzung mit Amin-Derivat
Die Fraktion wurde auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, an Dodecylanilin konjugiert, um das Oligorhamnosedodecylanilin-Derivat (OR-DA) der Formel 5 zu gewinnen (mit einer Ausbeute von etwa 10%).
Außer den Derivaten der Formeln 1 bis 5, die wie oben in den Beispielen 1 und 2 hergestellt wurden, wurden durch das oben erwähnte Verfahren die Derivate hergestellt, die in den folgenden Formeln 6 bis 10 angeführt sind.
Beispiel 3 (Antiulkus-Wirkungstest 1)
Die Antiulkus-Wirkung des in Beispiel 1 gewonnenen Oligofucosedodecylanilins bei Acetat- induziertem Ulkus wurde getestet. 3 zeigt ein Flußdiagramm der Verfahren, ein Ulkus mit Essigsäure zu induzieren. Die Experimente und die Wirksamkeitsbestimmung wurden wie in 3 gezeigt durchgeführt. 30 μl 20%-ige Essigsäure wurden direkt in die Mägen von 8 Wochen alten SD-Ratten am Tag 1 injiziert; an den Tagen 2 bis 9 wurde diesen Ratten 1 ml der Probenlösung einmal täglich oral verabreicht. Während des Testzeitraums wurde Futter und Wasser nach Belieben bereitgestellt.
Nach der Enddosierung ließ man diese Ratten fasten; die Mägen dieser Ratten wurden resektiert und in Formalin fixiert. Der Ulkus-Index wurde bestimmt, indem man den kurzen Durchmesser und den langen Durchmesser jeder Ulkus-Läsion maß, um das Heilungsverhältnis zu überprüfen. Wenn eine Wirkung bei einem 5%-Signifikanzniveau oder weniger (p ≤ 0,05) im Vergleich mit einer Kontrollgruppe beobachtet wurde, wurde die Wirkung als signifikant bestimmt. Hierbei wurde das Heilungsverhältnis in % wie folgt bestimmt:
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1
Beispiel 4 (Antiulkus-Wirkungstest 2)
Ein ähnlicher Test der Antiulcus-Wirkung wurde unter Verwendung der in Beispiel 1 gewonnenen Oligofucosealkylamin-Derivate anstelle der obigen Testlösung durchgeführt. Spezieller wurden Oligofucosehexylanilin und Oligofucoselaurylamin als Probelösungen für die gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 verwendet, um die Wirkungen von Oligofucosehexylanilin und Oligofucoselaurylamin gegen Acetat-induziertes Ulkus zu überprüfen.
Die Ergebnisse sind nachstehend in den Tabellen 2 und 3 gezeigt.
TABELLE 2
TABELLE 3
Beispiel 5 (Antiulkus-Wirkungstest 3)
Um die Wirkung von Oligofucosedodecylanilin zu überprüfen, durch NSAIDS und dergleichen induziertes Ulkus zu verhüten, wurde dessen Wirkung überprüft, um die Wirkung zu testen, Indometacin- induzierte Krankheiten zu verhüten.
Was die speziellen Verfahren dafür betrifft, wurde Oligofucosedocecylanilin, gelöst in 1 ml einer 0,5%-igen Carboxymethylcellulose-Lösung, Ratten oral verabreicht, die 18 Stunden (Futter) und 2 Stunden (Wasser) gefastet hatten. Einer Kontrollgruppe wurde nur die Carboxymethylcellulose-Lösung verabreicht. 2 Stunden nach der Probendosierung wurde diesen Ratten 1 ml 50 mg/ml Indometacin verabreicht, um Schäden an der gastrischen Mukosa zu induzieren 2 Stunden nach der Schädigungsinduktion wurden die Mägen dieser Ratten resektiert und in Formalin fixiert, um die Länge und Breite einer Läsion mit Schaden (blutende Läsion) zu messen und die Fläche zu bestimmen, wodurch das Unterdrückungsverhältnis des Auftretens von Schaden berechnet wird. So wurde die Wirkung von Oligofucosedodecylanilin bewertet, Indometacin-induzierten gastrischen Schaden zu verhüten. Die (Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 4 gezeigt.
TABELLE 4
Beispiel 6 (Überprüfung der Wirkungen, die Anhaftung von N. pylori zu inhibieren und die Proliferation zu inhibieren)
H. pylori hat in den letzten Jahren als verursachende bakterielle Spezies für gastrisches Ulkus Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Es wird vorgeschlagen, daß, da die Häufigkeit eines Rezidivs von gastrischem Ulkus bei Patienten hoch ist, die mit der bakteriellen Spezies infiziert sind, aber bei Patienten niedrig ist, die mit einem desinfizierenden Verfahren für die bakterielle Spezies unter Verwendung von hohen Dosen von Antibiotika behandelt wurden, die Desinfektion der bakteriellen Spezies in Bezug auf die Verhütung eines Rezidivs von gastrischem Ulkus von hoher Bedeutung ist. Im praktischen Sinn führen die therapeutischen Richtlinien für Ulkus in den europäischen Ländern und in den USA die Desinfektion der bakteriellen Spezies. an; in Japan wird von jetzt an für ein therapeutisches Mittel für Ulkus ebenfalls eine Auswirkung auf die bakterielle Spezies gefordert, da das Verhältnis der Infektion mit der bakteriellen Spezies im Laufe des Alterns zunimmt.
Die bakterielle Spezies kann wirksam durch die therapeutische Behandlung mit einer hohen Dosis von Antibiotika und Protonenpumpen-Inhibitoren in Kombination desinfiziert werden, aber es ist erwünscht, daß eine im wesentlichen andere therapeutische Behandlung im Hinblick auf das Entstehen von resistenten Bakterien entwickelt wird. Was den Mechanismus der Infektion mit der bakteriellen Spezies betrifft, wandert die bakterielle Spezies aus der gastrischen Mukosaschicht über eine Geiselbewegung zu gastrischen Epidermiszellen, wo das Bakterium spezifisch den Fucose-Rest der Louise-b-Typ-(Leb)-Zuckerketten an den gastrischen Epidermiszellen erkennt und an ihnen haftet. Ein Bericht teilt mit, daß Sialinsäure, Sulfatid und Laminin an der Anhaftung des Bakteriums beteiligt sind, aber es wird angenommen, daß Fucose als signifikante Erkennungsstelle für die spezifische Anhaftung an gastrischen Epidermiszellen fungiert.
Es wird angegeben, daß Fucoidan, das von Phaeophyceae Chordariales nemacystus abstammt, nicht nur Antiulkus-Wirkungen ausübt, sondern auch den Prozeß des Anhaftens inhibiert. Da es vorausgesagt wurde, daß das Oligosaccharidalkylamin-Derivat für die Verhütung der Infektion mit H. pylori und des Rezidivs von gastrischem Ulkus zusätzlich zu der Förderung der Ulkus-Heilung dienen könnte, falls das Oligosaccharidalkylamin-Derivat die Anhaftung von H. pylori hemmen könnte, wurde dessen Wirkung bezüglich der Inhibierung der Anhaftung überprüft. Weiter wurde auch die Wirkung bezüglich der Inhibierung der Proliferation überprüft.
Was die speziellen Verfahren betrifft, wurde das reduzierende Ende einer Zuckerkette vom Leb-Typ gemäß dem Verfahren von P. W. Tang et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., Band 132, 1985, S. 474–480) mit Periodat oxidiert, um ein Oligosaccharid mit dem resultierenden oxidierten Ende herzustellen. Das Oligosaccharid wurde an Diaminohexan konjugiert und anschließend auf einer Mikroplatte (Covalink Plate^TM; hergestellt von NUNC Co.) zur Verwendung bei der Fixierung von Aminogruppen fixiert. Auf die Platte wurde eine Stunde lang bei Umgebungstemperatur Biotin-markierter N. pylori zur Reaktion gegeben. Dann ließ man das Oligofucosedodecylanilin-Derivat auf geeignete Weise gleichzeitig anwesend sein. Die Reaktionslösung wurde in einem Puffer gespült, um nicht anhaftende Bakterien zu entfernen.
Anschließend wurden 100 μl einer 50 μg/ml Streptoavidin-Lösung für eine (Reaktion bei Umgebungstemperatur über eine Stunde zu jeder Vertiefung gegeben, wobei das Streptoavidin selektiv an das Bakterium band, das in den Vertiefungen verblieben war. Überschüssiges Streptoavidin wurde durch Spülen entfernt. Dann wurden 100 μl einer Peroxidase-markierten Biotin-Lösung zu 2,5 μg/ml zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 30-minütiger Reaktion bei Umgebungstemperatur wurde der Überschuß des Enzym-markierten Biotins entfernt. Durch die Verfahren band sich das Enzym-markierte Biotin selektiv an das biotinylierte Bakterium. Die Enzymaktivität wurde nachgewiesen und getestet, indem man 100 μl einer Substrat-Lösung (ABTS-Peroxidase-Substratsystem; hergestellt von KPL Co.) für eine 10-minütige Reaktion dazugab. Der Assay wurde durch Messen der Extinktion bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen. Da die gemessene Extinktion die Menge des Bakteriums anzeigt, welche die Zuckerkette vom Leb-Typ erkennt und an diese bindet, zeigt das Verhältnis der Abnahme der Extinktion aufgrund der Zugabe von Oligofucosedodecylanilin das Verhältnis der Inhibierung der Anhaftung an.
Bei gleichzeitiger Anwesenheit des Oligofucosedodecylanilin-Derivats innerhalb eines Bereichs von 10 bis 100 μg/ml verringert die Erhöhung des zugegebenen Oligofucosedodecylanilin-Derivats die Extinktion, wie nachstehend in Tabelle 5 gezeigt, welche die Ergebnisse der Inhibierungsaktivität des Oligofucosedodecylanilin-Derivats auf die Anhaftung von N. pylori an der Zuckerkette vom Leb-Typ veranschaulicht. So ist angezeigt, daß die Bindung zwischen N, pylori und der Zuckerkette; vom Leb-Typ durch das Oligofucosedodecylanilin-Derivat inhibiert wird.
TABELLE 5
Anschließend wurde die Wirkung von Oligofucosedodecylanilin bezüglich der Inhibierung der Proliferation von W. pylori überprüft. Ein klinisch isolierter Stamm H. pylori 6–34 (1,5 × 10⁸ CFU/ml), der in einem Brucellen-Kulturmedium kultiviert wurde, das 0,1% β-Cyclodextrin enthielt, wurde mit einem Volumen von 100 μl in 1 ml des gleichen Kulturmediums suspendiert, gefolgt von der Zugabe von 10 μl der Proben(Oligofucosedodecylanilin)-Lösung für eine Kultivierung über 72 Stunden. Die Wirkung wurde wie folgt beurteilt: Beruhend auf der Trübung (OD 600 nm) der Probenlösung zu der Trübung der Kontrollgruppe wurde das Verhältnis der Inhibierung der Proliferation durch die folgende Formel bestimmt. Demgemäß betrug das Verhältnis der Inhibierung der Proliferation 71,8%.
Wie es oben beschrieben wurde, wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein pharmazeutisches Mittel bereitgestellt, das eine Wirkung, welche die Ulkus-Heilung fördert, und eine Wirkung aufweist, welche die Anhaftung von H. pylori inhibiert, und das für die Prophylaxe und therapeutische Behandlung von Magenschleimhautentzündung, die potentiell zu Ulkus oder Krebs fortschreitet, wirksam ist. Eine sehr geringe Dosis der oben erwähnten Substanz übt eine heilende Wirkung bei Magenulkus und die Wirkung aus, einen Mukosa-Schaden zu verhüten; und zusätzlich kann die Substanz leicht als ein Oligosaccharid hergestellt werden, das bezüglich physikochemischer Eigenschaften und der Aktivität homogener ist als Polysaccharide. Demgemäß kann die Substanz ohne weiteres als Arzneimittel verwendet werden.

Claims

Oligosaccharid-Derivat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Formeln

worin n = 2 bis 20.
Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharid-Derivats gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren umfaßt: Umwandeln des Zucker-Restes an dem reduzierenden Ende von Oligofucose oder Oligorhamnose durch oxidativen Abbau in eine Aldehydgruppe; Erzeugen einer Schiff-Base durch Reagierenlassen der Aldehydgruppe mit mindestens einem aus entsprechenden Alkylaminen and Allylaminen; und Reduzieren der Schiff-Base, um ein Oligosaccharid-Derivat zu erhalten.
Inhibitor für Helicobacter pylori, der ein Oligosaccharid-Derivat nach Anspruch 1 enthält.
Prophylaktisches oder therapeutisches Behandlungsmittel für Magengeschwür, das ein Oligosaccharid-Derivat nach Anspruch 1 enthält.