PT104888B

PT104888B - Biopolímero bacteriano contendo fucose

Info

Publication number: PT104888B
Application number: PT104888A
Authority: PT
Inventors: Manuel Freitas Oliveira Rui; Filomena Andrade De Freitas Maria; D' Ascensão Carvalho Fernandes De Miranda Reis Maria; Manuel Delgado Alves Vítor
Original assignee: 73100 - Setenta E Três Mil E Cem, Lda
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2020-09-10
Also published as: RU2012124803A; CA2782989A1; JP2013513397A; EP2513325A2; MX344228B; PT104888A; AU2010331906B2; PL2513325T3; JP5969390B2; HUE050490T2; AU2010331906A1; BR112012014626A2; KR101919395B1; RU2573574C2; MX2012006944A; DK2513325T3; WO2011073874A2; CN102971432A; ES2806933T3; EP2513325B1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DIZ RESPEITO A UM BIOPOLÍMERO PRODUZIDO POR VIA MICROBIANA E QUE CONTÉM FUCOSE NA SUA COMPOSIÇÃO. ESTE BIOPOLÍMERO CONSISTE NUM POLISSACÁRIDO NO QUAL A FUCOSE REPRESENTA PELO MENOS 10% DA SUA COMPOSIÇÃO, POSSUINDO COMO COMPONENTES NÃO SACARÍDEOS GRUPOS ACILO, NOMEADAMENTE, ACETATO, PIRUVATO E SUCCINATO. OUTRO DOS ASPECTOS DA PRESENTE INVENÇÃO DIZ RESPEITO AO PROCESSO DE OBTENÇÃO DO BIOPOLÍMERO, SENDO ESTE OBTIDO POR CULTIVO DE MICRORGANISMOS, EM PARTICULAR A PARTIR DE CULTURAS DE ENTEROBACTER A47 (DSM 23139), UTILIZANDO COMO FONTE DE CARBONO PREFERENCIAL O GLICEROL E/OU MISTURAS CONTENDO GLICEROL. O POLÍMERO DA PRESENTE INVENÇÃO PODE SER UTILIZADO, EM VÁRIOS TIPOS DE APLICAÇÕES INDUSTRIAIS, COMO POR EX. NAS INDÚSTRIAS FARMACÊUTICA, COSMÉTICA E AGRO-ALIMENTAR, E NO TRATAMENTO DE RESÍDUOS INDUSTRIAIS, COMO POR EX. NA RECUPERAÇÃO DE ÓLEOS E METAIS.

Description

DESCRIÇÃO

BIOPOLIMERO BACTERIANO CONTENDO FUCOSE

Domínio técnico da invenção

A presente invenção diz respeito a um biopolimero produzido por via microbiana e que contém fucose na sua composição. Adicionalmente, a presente invenção concerne ao método de obtenção do referido biopolimero bem como à cultura microbiana responsável pela sua obtenção. Desta forma, a presente invenção é aplicável em vários tipos de indústrias, como por ex. nas indústrias farmacêutica, cosmética e agroalimentar, e no tratamento de resíduos industriais, como por ex. na recuperação de óleos e metais.

Estado da Técnica

Os polissacáridos são biomateriais poliméricos de elevado peso molecular (ΙΟ⁴ —10⁷) , formados pela polimerização de unidades repetitivas de monossacáridos. Possuem uma grande diversidade estrutural, resultante da diversidade na estrutura da unidade repetitiva, do tipo de ligações glicosídicas envolvidas e do grau de ramificação. Muitos polissacáridos possuem componentes não sacarídeos, tais como grupos acilo, como por ex. acetato, succinato e piruvato, e grupos inorgânicos, como por ex. grupos fosfato ou sulfato (Sutherland, 2001) .

Por outro lado, os polissacáridos formam, frequentemente, estruturas terciárias unidas por ligações intra ou intermoleculares, não covalentes, que conferem maior rigidez às moléculas e desempenham um papel importante nas propriedades do polímero no estado sólido e em solução (Kumar et al, 2007) .

Devido as suas propriedades físicas e químicas, nomeadamente a sua capacidade de retenção de água, reologia e/ou formação de filmes, os polissacáridos são utilizados numa grande variedade de aplicações alimentares e industriais, incluindo têxteis, tintas, papel, produtos farmacêuticos e cosméticos, como agentes emulsionante (Moreno et al, 1998) . Por vivos, geralmente não biodegradáveis. Estas polissacáridos biomateriai sustentável.

, estabilizantes ou espessantes serem obtidos a partir de seres apresentam toxicidade e são caracteristicas tornam os adequados a um desenvolvimento

As principais aplicações dos polissacáridos comercializados, tanto de origem natural, como, por ex. alginato, carrageno, goma de Guar, pectinas, xantano e gelano, como de derivados semi-sintéticos, como por ex. metilcelulose, carboximetilcelulose e hidroxipropilguar, baseiam-se na sua capacidade de modificar as propriedades físicas de sistemas aquosos (hidrocolóides - compostos capazes de modificar as propriedades físicas de sistemas aquosos), sendo utilizados principalmente na indústria alimentar, seguida pelas indústrias petrolífera e farmacêutica. Alguns destes polissacáridos, como por ex. alginato, pectinas, pululano, derivados de amido e de celulose, possuem a capacidade para formar filmes biodegradáveis pelo que são utilizados no fabrico de embalagens, recipientes e películas, e em várias aplicações agro-alimentares, farmacêuticas ou industriais.

Actualmente, os polissacáridos utilizados industrialmente são maioritariamente obtidos a partir de plantas, como por ex. a goma de Guar e a goma-arábica, de algas, como por ex. o alginato e o carrageno, ou de crustáceos, como por ex. a quitina, representando os polissacáridos obtidos por via microbiana, como por ex. o xantano, o gelano e o alginato bacteriano, apenas uma pequena fracção do mercado de biopolimeros (Canilha et ai, 2005) . No entanto, nos últimos anos, verificou-se um interesse crescente na identificação e no isolamento de novos polissacáridos microbianos que possam competir com os polissacáridos tradicionais devido às suas melhores propriedades físico-químicas, nomeadamente, uma maior actividade emulsionante e floculante, maior resistência a solventes orgânicos, actividade biológica, por ex. como anticancerígenos ou imunoestimuladores, e, também, propriedades reológicas, como por ex. viscosidade mais elevada para menores concentrações em polímero, maior estabilidade quando sujeito a gamas alargadas de temperatura, pH e força iónica (Kumar et al, 2007; Sutherland, 2001) .

A produção de polissacáridos por via microbiana apresenta vantagens em relação à sua obtenção a partir de plantas, algas ou animais, visto os microrganismos exibirem taxas de crescimento mais elevadas e a manipulação das respectivas condições de cultivo ser muito mais fácil (Moreno et al, 1998) . As plantas, as algas e os animais têm ciclos de vida de um ou mais anos, sendo o ciclo de produção, geralmente, anual. Por outro lado, as taxas de crescimento dos microrganismos são da ordem das horas ou alguns dias, enquanto as das plantas, algas e animais são da ordem de meses ou anos.

O principal factor limitante da produção comercial de polissacáridos por via microbiana relaciona-se com o custo elevado dos substratos utilizados, sobretudo açúcares, em particular glucose, amido e sacarose. Nesses bioprocessos, o substrato representa cerca de 20-40% dos custos de produção (Kumar and Mody, 2009).

Assim, a procura de substratos mais baratos e com rendimentos comparáveis é determinante para a redução dos custos de produção. 0 glicerol, um subproduto de vários processos industriais, principalmente do processo de produção de biodiesel, é um bom candidato, visto ser produzido em quantidades crescentes e muito superiores ao consumo das suas aplicações tradicionais, devido ao forte desenvolvimento da indústria do biodiesel nos últimos anos. Para esta indústria, ou para qualquer outra que tenha o glicerol como subproduto, este constitui actualmente um produto com baixo valor comercial e cuja eliminação representa ainda um custo. Por esta razão, é importante desenvolver aplicações interessantes para este subproduto industrial, fazendo uso do facto do glicerol ser um composto não tóxico e biodegradável (Çelik et al, 2008).

De entre os polissacáridos com elevado potencial industrial encontram-se os polissacáridos contendo fucose. O interesse neste tipo de polímeros, para além da sua capacidade de modificar as propriedades físicas de sistemas aquosos, está relacionado com o facto de a fucose ser considerada um açúcar raro por ser de difícil obtenção. Por outro lado, a presença de fucose reduz a possibilidade de ocorrência de respostas alérgicas, o que potência a utilização destes biopolímeros, por ex. em aplicações médicas e cosméticas.

A fucose pode ser sintetizada por conversão química a partir de outros monossacáridos mais comuns, tais como a galactose ou a glucose. No entanto, a maioria dos processos químicos são complexos, envolvendo vários intermediários, e têm um baixo rendimento. Uma das alternativas à síntese química de fucose é a sua obtenção por hidrólise química ou enzimática de polissacáridos contendo fucose. Estes polímeros podem ser encontrados em plantas, algas e microrganismos.

Nas plantas, a fucose (nas formas L-fucose e fucose metilada) ocorre, por ex. na casca da batata e do kiwi, em sementes de soja, na mucilagem de folhas jovens de Plantago lanceolata, em raízes de Lepidium sativum e de Glycyrrhiza uralensis, em exsudados de Astragalus microcephalus, A. gummifer e A. kurdicus, e em folhas de Lupinus albus (Vanhooren e Vandamme, 1999).

Nas algas, a fucose pode ser encontrada sob a forma de um homopolissacárido denominado fucoidan, que contém L-fucose sulfatada. 0 polissacárido fucoidan é extraído de algas, tais como por ex. Pelvetia canaliculata, Fucus vesiculosus e Ascophyllum nodosum. Nestas espécies, o conteúdo em L-fucose varia entre 9,0 e 11,2%. O rendimento global do processo de extracção de L-fucose a partir de algas é relativamente baixo (cerca de 7,6%) (Vanhooren e Vandamme, 1999) .

São vários os microrganismos, nomeadamente, bactérias, fungos e microalgas, que produzem polissacáridos extracelulares (EPS) contendo L-fucose. Esses polímeros incluem homo e heteropolissacáridos, mas estes últimos são mais comuns, contendo, para além de quantidades variáveis de fucose, outros monómeros sacarídeos (ex. glucose, galactose, manose, ramnose e/ou arabinose). EPS contendo L-fucose são produzidos por bactérias de vários Géneros, incluindo, Aerobacter, Azotobacter, Klebsiella, Erwinia, Enterobacter, Pseudomonas, Clavibacter, Bacillus e Salmonella, entre outros. Entre os fungos, a fucose pode ser encontrada em EPS produzidos por espécies dos Géneros Candida, Mucor, Polyporus, Rhodotorula e Sporobolomyces, entre outros.

Nas últimas décadas foram descritos em publicações científicas e em documentos de patente, vários polissacáridos contendo L-fucose produzidos por bactérias, de entre as quais se destacam estirpes dos Géneros Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas e Clavibacter.

Várias estirpes de Klebsiella pneumoniae produzem EPS contendo L-fucose, D-galactose e ácido galacturónico, que diferem entre si no grau de acetilação da cadeia polimérica. Um desses EPS, produzido por K. pneumoniae 1-1507 (US 5876982), encontrou aplicação na indústria de cosméticos, devido às suas propriedades psicosensoriais, hidratantes e auto-emulsionantes (Guetta et al, 2003a). Foram descritos outros EPS com composição muito semelhante à deste polissacárido nomeadamente, os EPS produzidos por Klebsiella K-63 (Joseleau e Marais, 1979) e por K. pneumoniae ATCC 31646 (US 4298691). O polímero da invenção difere destes polissacáridos por possuir na sua composição, para além de fucose e galactose, também, glucose, como um dos componentes maioritários. O polímero da invenção também possui, em quantidades significativas (até cerca de 25% do seu peso seco), grupos acilo substituintes, que não são referidos como componentes dos polissacáridos produzidos pelas estirpes do Género Klebsiella.

K. pneumoniae ATCC 12657 (anteriormente denominada Aerobacter aerogenes estirpe A3) produz um EPS constituído por fucose, glucose, galactose e ácido glucurónico, em quantidades aproximadamente iguais (Vanhooren e Vandamme, 1999). O EPS purificado contém 18,9% do seu peso em fucose (Guetta et al, 2003b). Este polímero difere do polímero da invenção pela presença de um elevado conteúdo em ácido glucurónico e pela presença de grupos acilo, que não foram descritos para o EPS de K. pneumoniae ATCC 12657 EPS. Por outro lado, o processo da invenção não usa espécies do Género Klebsiella para o cultivo microbiano.

Estirpes do Género Enterobacter também foram descritas como produtoras de EPS contendo fucose, galactose, glucose e ácido glucurónico. Exemplos incluem: Enterobacter sp. CNCM 1-2744, que produz um EPS no qual os referidos monómeros se encontram nas proporções 2:2:1:1 (FR2840920); Enterobacter sp. SSYL (KCTC 0687BP), que produz um EPS com peso molecular entre 10⁵e 10⁶, no qual a fucose representa 8-10% do conteúdo em açúcares, sendo o ácido glucurónico o principal componente (40-70%) (US2002115158); e E. sakazakii, estirpes ATCC 53017,

ATCC 29004 e ATCC 12868, que produzem um EPS com peso molecular de 2xl0⁶, no qual a fucose representa 13-22% e podendo ter, adicionalmente, até 8% de manose (US4806636) . Estes polissacáridos diferem do polímero da invenção principalmente pelo seu conteúdo diferente em monómeros e pelos grupos acilo. Por outro lado, o polímero da invenção apresenta tipicamente valores de peso moleculares mais elevados, na ordem de 10⁶-10⁷.

Várias estirpes de Clavibacter michiganensis foram descritas como produtoras de EPS contendo L-fucose. Esses EPS contêm igualmente outros açúcares neutros, tais como galactose, glucose e/ou manose, e grupos acilo substituintes, como o piruvato, succinato e/ou acetato. C. michiganensis subsp michiganensis Cm 542 (NCPPB 1064) produz um EPS de elevado peso molecular (ΙΟ⁶—10⁷) constituído por fucose, galactose e glucose, na proporção de 2:1:1, contendo piruvato, succinato e acetato, na proporção 1:0,5:1,5 (van den Bulk et al, 1991). O polímero da invenção, apesar de possuir uma composição semelhante ao polissacárido de C. michiganensis, distingue-se deste na proporção relativa dos grupos acilo. A maior quantidade de succinato presente no polímero da invenção confere-lhe um carácter aniónico mais acentuado.

No documento WO2008/127134 descreve-se um processo microbiano a partir de culturas de Pseudomonas oleovorans com substratos ricos em glicerol para obtenção de um polímero à base de galactose. Contudo, o EPS obtido nesse processo contém apenas quantidades residuais de fucose, na ordem de 0-4%.

Desta forma, a presente invenção propõe um processo para obtenção, por via microbiana, preferencialmente a partir de culturas de Enterobacter Α4Ί (DSM 23139), de um polímero contendo fucose, de elevado peso molecular, e com características polielectrolíticas, e o processo para a sua obtenção. O referido processo permite a obtenção do polímero usando substratos de baixo custo e de um modo fácil. O polímero da invenção pode ser usado em várias indústrias, tais como agro-alimentar, tratamento de águas residuais e farmacêutica devido às suas propriedades reológicas, capacidade para formar filmes, carácter polielectrólito, e capacidade emulsionante e floculante.

Descrição Geral da Invenção

A presente invenção relaciona-se com a produção de um biopolímero, cujo principal constituinte é um polissacárido de elevado peso molecular (ΙΟ⁶—10⁷) , no qual a fucose representa pelo menos 10% da sua composição, e possuindo grupos acilo substituintes, incluindo piruvato, succinato e acetato, produzido por cultivo de microrganismos, em particular da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139), usando como fonte de carbono preferencial glicerol ou misturas contendo glicerol.

Do mesmo modo, a presente invenção descreve um processo para a obtenção de um polímero compreendendo os passos de cultivo microbiano da bactéria Enterobacter Α4Ί (DSM 23139) num meio de cultura contendo glicerol.

1. Caracterização da cultura microbiana polímero contendo fucose da presente invenção é produzido por bactérias pertencentes aos Géneros Pseudomonas, Klebsiella, Methylobacterium, Erwinia, Alcaligenes ou Enterobacter, preferencialmente, pela bactéria Enterobacter Α4Ί depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), de acordo com o Tratado de Budapeste, com o número DSM 23139. Adicionalmente a estirpe microbiana usada na presente invenção pode caracterizar-se por outros aspectos, tais como o perfil bioquímico, a sequência de ácidos nucleicos e o dendrograma filogenético apresentados nas Tabelas 1 e 2 e na Figura 1, respectivamente.

A cultura microbiana, usada no âmbito da presente invenção, pode ser um microrganismo selvagem, uma variante ou um mutante, desde que possua a capacidade de produzir o polímero contendo fucose. Pode, ainda, ser utilizada uma cultura pura ou uma cultura mista de vários microrganismos, entre os quais se encontra, pelo menos, um dos microrganismos capazes de produzir o polímero contendo fucose, preferencialmente, a bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139).

2. Caracterização do processo de obtenção do polímero polímero da presente invenção é produzido num reactor agitado e arejado. 0 meio de cultura para a produção do polímero contendo fucose consiste num meio nutriente aquoso, contendo uma fonte de carbono, uma fonte de azoto e sais inorgânicos. A fonte de carbono preferencial é o glicerol ou misturas contendo glicerol. No entanto, o processo de produção do polímero da invenção prevê a utilização de outras fontes de carbono, em alternativa ao glicerol ou em mistura com este, tais como por ex. açúcares, álcoois, ácidos orgânicos ou alcanos, assim como a utilização de resíduos ou subprodutos alimentares ou industriais, tais como por ex. subproduto da produção de biodiesel, melaços de cana-deaçúcar, soro de leite ou resíduos da produção de azeite.

processo de cultivo para a produção do polímero contendo fucose consiste em crescer a cultura microbiana num meio nutriente aquoso, arejado. A temperatura é controlada entre 15 e 45°C, preferencialmente, entre 26 e 37°C. 0 pH é controlado entre 5,0 e 9,0, preferencialmente entre 6,5 e 7, 0 .

A concentração em oxigénio dissolvido no meio de cultura é elevada (>70% de saturação), no início do cultivo, mas, concomitante com o crescimento celular, diminui gradualmente, sendo controlada a valores inferiores a 30%, preferencialmente, inferiores a 10% ou nula. O polímero à base de galactose é produzido em condições de limitação da fonte de azoto (<0,l gN/L) e de disponibilidade da fonte de carbono (>5 g glicerol/L), em simultâneo com a manutenção de baixas concentrações em oxigénio dissolvido (<10% saturação). A disponibilidade em fonte de carbono é garantida pelo fornecimento à cultura de uma solução contendo uma elevada concentração em fonte de carbono (>100 g/L) . O caudal de adição desta solução é ajustada de modo a igualar o consumo de carbono pela cultura.

caldo de cultivo obtido no final do cultivo em reactor pode ser utilizado directamente, sem qualquer processamento, ou após secagem. Alternativamente, o polímero contendo fucose pode ser recuperado do caldo de cultivo, na sua forma nativa, por precipitação pela adição de um agente precipitante (ex. etanol, acetona).

processo de extracção do polímero da invenção consiste na remoção de células, por ex. por centrifugação do caldo de cultivo, seguida de precipitação do polímero por adição de um agente precipitante. A purificação do polímero envolve a utilização de um ou vários processos adicionais (ex. diálise) .

A produção máxima de polímero contendo fucose pode chegar a 50 g/L de polímero nativo ou 20 g/L de polímero purificado, dependendo das condições e do tempo de cultivo.

3. Caracterização do polímero

Tipicamente, o polímero da presente invenção possui na sua composição uma quantidade de fucose que representa pelo menos 10% do conteúdo total em açúcar. O polímero contendo fucose possui na sua composição outros açúcares neutros, nomeadamente, glucose e galactose, e pode conter também, em quantidades vestigiais (<5%), açúcares neutros, tais como por ex. manose, ramnose, arabinose, frutose, ácido glucurónico e/ou glucosamina.

4. Utilizações do polímero da presente invenção

O polímero desta invenção apresenta actividade floculante e emulsionante, forma soluções aquosas de elevada viscosidade, com comportamento de fluido pseudoplástico, e produz filmes biodegradáveis em mistura com outros polímeros. Assim sendo, pode substituir outros polissacáridos, tais como por ex. o xantano, o alginato, o carrageno, a goma de Guar e a gomaarábica, nas suas numerosas aplicações, nomeadamente nas indústrias agro-alimentar, farmacêutica e cosmética, como agente espessante, texturizante ou ligante. Adicionalmente, a presença de fucose no polímero da invenção potência a sua utilização em aplicações médicas e cosméticas. Adicionalmente, a presença de piruvato e succinato confere um carácter aniónico ao polímero. Como consequência, este é capaz de imobilizar metais.

Descrição das Figuras

Figura 1 - Representa o dendrograma filogenético da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139).

Figura 2 - Representa a viscosidade aparente de uma solução aquosa (0,8% p/v) do polímero contendo fucose (medição realizada à temperatura ambiente).

Figura 3 - Representa a evolução da concentração da fonte de carbono (glicerol) e da fonte de azoto (amónia), da produção de biomassa e de EPS contendo fucose, durante o processo de cultivo para a produção do polímero da invenção.

Descrição detalhada da invenção

1. Caracterização da cultura microbiana

O polímero contendo fucose é obtido através de um processo de cultivo por meio de microrganismos. A cultura microbiana é a bactéria Enterobacter Α4Ί (DSM 23139). A cultura microbiana pode ser um microrganismo selvagem, uma variante ou um mutante, desde que possua a capacidade de produzir o polímero contendo fucose. Pode, ainda, ser utilizada uma cultura pura ou uma cultura mista de vários microrganismos, entre os quais se encontra, pelo menos, um dos microrganismos capazes de produzir o polímero contendo fucose.

A cultura microbiana preferencial para a obtenção do polímero da presente invenção é a bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) com as características descritas a seguir. A caracterização bioquímica e genética do microrganismo foi realizada pelo DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).

1.1. Morfologia da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139)

A bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) apresenta a forma de bacilos, com as seguintes dimensões: 0,7-0,8 μη x 1,2-2,5 pm. É uma bactéria Gram negativa, que apresenta mobilidade.

1.2. Perfil bioquímico da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139)

Os testes bioquímicos realizados conduziram ao seguinte perfil bioquímico, o qual é típico de bactérias do Género Enterobacter (Tabela 1):

Tabela 1: Perfil bioquímico da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) ( + e representam uma reacção positiva ou negativa, respectivamente, ao teste realizado).

Teste	Resultado
Lise por KOH 3%	+
Aminopeptidase (Cerny)	+
Catalase	+
Crescimento em anaerobiose	+
Produção de gás a partir de glucose	+
Produção de H₂S	-
Produção de índole	-
Vermelho de metilo	-
Degradação de:
Gelatina	-
Tween 80	-
DNA	-
Ureia	+
Citrato (Simmons)	+
Utilização de malonato	+
VP	+
ONPG	+
ADH	+
LDC	-
ODC	+
Produção de ácido a partir de:
Glucose	+
Frutose	+
Manose	+
Maltose	+
D-Xilose	+
Sacarose	+
Trealose	+
L-Arabinose	+
Ramnose	+
Galactose	+
Adonitol	+
Dulcitol	-
Eritritol	-
Inositol	-
Glicerol	+

1.3. Sequenciação completa do rDNA 16S da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139)

A sequência completa do rRNA 16S da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) (Tabela 2) foi determinada por sequenciação directa de rDNA 16S amplificado por PCR. A extracção de DNA, a amplificação por PCR (Reacção em Cadeia de Polimerase) e a purificação dos produtos de PCR foi realizada como descrito por Rainey et al (1996). Os produtos de PCR purificados foram sequenciados utilizando o kit CEQ™DTCS-Quick Start (Beckman Coulter) segundo o protocolo indicado pelo produtor. As reacções das sequências foram sujeitas a electroforese usando o sistema de análise CEQ™8000 Genetic Analysis System. Os dados da sequência resultante foram introduzidos no editor de alinhamento (alignment editor) ae2 (Maidak et al, 1999), alinhados manualmente e comparados com sequências representativas pertencentes a organismos Enterobacteriaeceae (Maidak et al, 1999) . As sequências para comparação foram obtidas das bases de dados da EMBL, RDP e DSMZ.

Tabela 2: Sequência completa do rDNA 16S da bactéria

Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) - SEQ ID NO 1

1	TGATCCTGGC TCAGATTGAA CGCTGGCGGC AGGCCTAACA CATGCAAGTC GAACGGTAAC
61	AGGAAGCAGC TTGCTGCTTC GCTGACGAGT GGCGGACGGG TGAGTAATGT CTGGGAAACT
121	GCCTGATGGA GGGGGATAAC TACTGGAAAC GGTAGCTAAT ACCGCATAAY GTCGCAAGAC
181	CAAAGAGGGG GACCTTCGGG CCTCTTGCCA TCGGATGTGC CCAGATGGGA TTAGCTAGTA
241	GGTGGGGTAA CGGCTCACCT AGGCGACGAT CCCTAGCTGG TCTGAGAGGA TGACCAGCCA
301	CACTGGAACT GAGACACGGT CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA
361	ATGGGCGCAA GCCTGATGGA GCCATGCCGC GTGTATGAAG AAGGCCTTCG GGTTGTAAAG
421	TACTTTCAGC GGGGAGGAAG GCGATAAGGT TAATAACCTT GTCGATTGAC GTTACCCGCA
481	GAAGAAGCAC CGGCTAACTC CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGGAGGGT GCAAGCGTTA
541	ATCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGCACGCA GGCGGTCTGT CAAGTCGGAT GTGAAATCCC
601	CGGGCTCAAC CTGGGAACTG CATTCGAAAC TGGCAGGCTA GAGTCTTGTA GAGGGGGGTA
661	GAATTCCAGG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG AGATCTGGAG GAATACCGGT GGCGAAGGCG
721	GCCCCCTGGA CAAAGACTGA CGCTCAGGTG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT
781	ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGTC GACTTGGAGG TTGTGCCCTT GAGGCGTGGC
841	TTCCGGAGCT AACGCGTTAA GTCGACCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG TTAAAACTCA
901	AATGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG ATGCAACGCG
961	AAGAACCTTA CCTACTCTTG ACATCCAGAG AACTTTCCAG AGATGGATTG GTGCCTTCGG
1021	GAACTCTGAG ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTTGTGAAAT GTTGGGTTAA
1081	GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTATCCTTT GTTGCCAGCG GTYAGGCCGG GAACTCAAAG
1141	GAGACTGCCA GTGATAAACT GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA
1201	CGAGTAGGGC TACACACGTG CTACAATGGC GCATACAAAG AGAAGCGACC TCGCGAGAGC
1261	AAGCGGACCT CATAAAGTGC GTCGTAGTCC GGATTGGAGT CTGCAACTCG ACTCCATGAA
1321	GTCGGAATCG CTAGTAATCG TGGATCAGAA TGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT
1381	ACACACCGCC CGTCACACCA TGGGAGTGGG TTGCAAAAGA AGTAGGTAGC TTAACCTTCG
1441	GGAGGGCGCT TACCACTTTG TGATTCATGA CTGGGGTGAA GTCGTAACAA GGTAACCGTA
1501	GGGAACCTGC GGGCTGGATC ACC

1.4. Dendrograma filogenético da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) dendrograma filogenético da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) (Figura 1) foi construído usando operações do pacote ARB (Pruesse et al, 2007). Sendo baseado na distância evolucionária, o dendrograma foi construído usando o método de agrupamento por vizinhança (neighbor-joining) (Jukes e Cantor, 1969) , com as correcções de Saitou e Nei (1987) . A raiz do dendrograma foi determinada incluindo a sequência de rRNA 16S de Klebsiella pneumoniae na análise. A barra de escala indica a substituição de 1 nucleótido por cada 100 nucleótidos.

A sequência de rDNA 16S mostrou que a bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) possui um grau de semelhança elevado com as bactérias Enterobacter pyrinus (98,3%), Enterobacter hormaechei (99,0%) e Enterobacter asburiae (98,9%). O critério para a identificação de um microrganismo numa dada espécie é definido como sendo de, no mínimo, >99,0% ou, idealmente, >99,5% de semelhança com a estirpe de referência para essa espécie (Janda e Abbott, 2007).

Desta forma, numa realização preferida no âmbito da presente invenção, encontram-se igualmente incluídos os microrganismos que possuam a SEQ ID NO 1 ou um grau de semelhança, pelo menos igual a 99,0±0,5%, com a SEQ ID NO 1 da Enterobacter sp. A47 (DSM 23139), de acordo com a Tabela 2, numa ordem crescente de preferência de, pelo menos, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, quer sejam obtidos por manipulação genética, mutação, variantes ou directamente da natureza.

2. Caracterização do processo de obtenção do polímero polímero da presente invenção é produzido num reactor agitado e arejado, com controlo de pH e temperatura. 0 processo de obtenção do polímero é iniciado pela inoculação do microrganismo num meio nutriente aquoso contendo uma fonte de carbono, uma fonte de azoto e sais inorgânicos. 0 processo compreende uma fase inicial em reactor descontínuo, seguida por uma fase em reactor semi-contínuo, durante a qual é introduzida no reactor meio nutriente.

2.1. Meio de cultura meio de cultura para a produção do polímero contendo fucose consiste num meio nutriente aquoso, contendo uma fonte de carbono, uma fonte de azoto e sais inorgânicos.

2.1.1. Fonte de carbono

A fonte de carbono é, preferencialmente, glicerol ou misturas contendo glicerol. Alternativamente, a fonte de carbono pode ser um açúcar monomérico, dimérico ou oligomérico, um álcool, um ácido orgânico, um alcano, ou misturas contendo dois ou mais compostos dos grupos referidos.

A fonte de carbono pode ser, também, um resíduo ou subproduto alimentar ou industrial, contendo um ou vários dos compostos referidos atrás, tal como por ex. subproduto da produção de biodiesel, melaço de cana-de-açúcar, soro de leite ou resíduos da produção de azeite. 0 subproduto da indústria do biodiesel é constituído principalmente por glicerol não purificado, podendo conter metanol em quantidades variáveis (5-50%), para além de outros contaminantes provenientes do processo industrial (ex. NaOH, gordura/óleos, alguns ésteres, enxofre, proteínas e minerais). O melaço-de-cana de açúcar é um subproduto da indústria de refinaria do açúcar, rico em açúcares (sacarose, glucose e frutose) (>50%) . O soro de leite é um subproduto da indústria queijeira, constituído principalmente por lactose. A fracção orgânica do resíduo da produção de azeite inclui açúcares, taninos, polifenóis, polialcoóis, pectinas e lípidos. Outros resíduos ou subprodutos alimentares ou industriais que possuam na sua composição açúcares, álcoois, ácidos orgânicos, alcanos e/ou lípidos podem ser usados como substratos para o cultivo do microrganismo e produção do EPS contendo fucose.

No processo para a obtenção do polímero contendo fucose, de acordo com a presente invenção, a fonte de carbono deve representar entre 2 e 10% (p/v) do meio nutriente aquoso, durante a fase em reactor descontínuo, de modo a garantir o crescimento celular. Durante a fase de reactor em semicontínuo subsequente, a fonte de carbono deve ser mantida acima de 0,1% (p/v), preferencialmente acima de 0,5% (p/v), de modo a garantir disponibilidade em fonte de carbono, necessária para a síntese de polímero.

2.1.2. Fonte de azoto

A fonte de azoto utilizada no processo de cultivo pode ser um sal inorgânico (ex. (NH₄)₂HPO₄, NH₄OH, (NH₄)₂SO₄, NH₄C1) ou um composto orgânico azotado (ex. ureia, aminoácidos) , misturas contendo dois ou mais dos compostos referidos ou, ainda, um resíduo ou subproduto alimentar ou industrial contendo compostos azotados (ex. farinha de soja, extracto de levedura, farelo de trigo).

No processo para a obtenção do polímero contendo fucose, a fonte de azoto deve estar presente no meio de cultivo numa concentração entre 0,6 e 3,0 g N/L, durante a fase em reactor descontínuo, de modo a garantir o crescimento celular. Durante a fase de reactor em semi-contínuo subsequente, a fonte de azoto deve ser mantida inferiores a 0,3 g/L, preferencialmente inferior a 0,1 g N/L ou nula, criando condições de limitação neste nutriente. Deste modo, durante a fase em reactor em semi-continuo, são impostas condições nas quais o crescimento celular abranda ou cessa por limitação da fonte de azoto, o que, concomitante com a manutenção da disponibilidade em fonte de carbono, conduz à indução da síntese do polímero contendo fucose.

2.1.3. Sais inorgânicos

São, também, incorporados no meio de cultivo, em quantidades vestigiais, catiões metálicos, nomeadamente, sódio, potássio, magnésio, ferro, manganésio, cobalto, cálcio, cobre e zinco. Cada um destes catiões deve estar presente no meio de cultivo em concentrações entre 0,001 e 100 mM, à excepção do sódio que pode estar presente em quantidades superiores especialmente para ajuste do pH.

2.2. Condições do processo de cultivo

O processo de cultivo em reactor é iniciado pela inoculação da cultura microbiana no meio nutriente aquoso, descrito atrás, arejado com ar comprimido. O volume de inoculo deve representar entre 10 e 30% do volume total de meio reaccional no início do cultivo.

Ao longo do processo de cultivo, a temperatura é controlada entre 15 e 45°C, preferencialmente entre 26 e 37°C, e o pH é controlado entre 5,0 e 9,0, preferencialmente entre 6,5 e 7, 0 .

A concentração em oxigénio dissolvido no meio de cultura é elevada (>70%), no início do cultivo, mas, ao longo da fase em reactor em descontínuo diminui gradualmente, concomitante com ο crescimento celular sendo controlada valores a inferiores a 30%, preferencialmente, inferiores a 10% ou, ainda, em condições de anaerobiose - valores de oxigénio nulos ou vestigiais, durante a fase em reactor semi-continuo. O caudal de arejamento com ar comprimido pode ser mantido constante, num valor entre 0,1 e 2,0 vvm, sendo a concentração em oxigénio dissolvido controlada por variação da agitação mecânica entre 0 e 2000 rpm, preferencialmente, entre 400 e 800 rpm. Em alternativa, o caudal de arejamento pode variar ao longo do processo de cultivo, entre 0 e 2,0 vvm, podendo, neste caso, a agitação mecânica ser mantida constante. A concentração em oxigénio dissolvido durante a fase em descontínuo também pode ser controlada pela adição de substrato, sendo que, neste caso, a agitação mecânica e o arejamento poderão ser mantidos constantes num valor entre 0 e 2000 rpm, e entre 0 e 2,0 vvm, respectivamente.

A síntese do polímero da invenção é iniciada durante a fase em reactor em contínuo, mas ocorre principalmente durante a fase em reactor em semi-continuo, na qual o crescimento celular abranda ou cessa devido à limitação em fonte de azoto. Durante a fase em reactor em semi-continuo, devido à entrada de meio nutriente, são criadas condições de disponibilidade em fonte de carbono e limitação em fonte de azoto. A concentração da fonte de azoto nessa fase é mantida a valores nulos ou inferiores a 0,3 g N/L, preferencialmente inferiores a 0,1 g N/L. Na presença destas concentrações em fonte de azoto, o crescimento celular é limitado, ocorrendo a síntese de polímero, desde que haja disponibilidade em fonte de carbono de modo a igualar o consumo de carbono pela cultura.

A produção do polímero contendo fucose pode ser mantida por um período entre 4 e 7 dias, ou seja, até ao momento em que, devido à elevada viscosidade do caldo de cultivo, se torna impossível manter uma distribuição homogénea de oxigénio, temperatura e nutrientes no reactor. Esta situação ocorre quando a viscosidade aparente do caldo de cultivo atinge um valor de cerca de 2,0 Pa.s (medidos à temperatura de 30°C, com uma tensão de corte de 5 s^-1) .

A produção do polímero da invenção pode ser mantida num processo em contínuo ou num processo por ciclos. No processo em contínuo, o meio nutriente é continuamente introduzido no reactor, sendo o caldo de cultivo removido também continuamente. No processo por ciclos, o modo de cultivo descrito atrás, nomeadamente, uma fase inicial em reactor em descontínuo, seguida de uma fase em reactor em semi-contínuo, é ciclicamente repetido, sendo que cerca 10-30% do volume do caldo de cultivo de cada ciclo permanece no reactor e serve de inoculo para o ciclo seguinte. Estes dois modos alternativos de operação do reactor constituem uma optimização do processo, já que são eliminados períodos de tempo não produtivos correspondentes à preparação de novo inoculo e preparação do reactor.

2.3. Extracção e purificação dos produtos do processo de cultivo

O caldo de cultivo obtido no final do bioprocesso pode ser utilizado directamente, sem qualquer processamento. Alternativamente, o polímero em bruto pode ser obtido por secagem do caldo de cultivo a temperaturas até 80°C ou por liofilização.

Alternativamente, o polímero, na sua forma nativa, pode ser recuperado do caldo de cultivo no final do bioprocesso, preferencialmente por precipitação, o que pode ser conseguido por adição de um agente precipitante, que consiste num solvente miscível com água no qual o polímero é insolúvel, tal como por ex. um álcool (ex. etanol, isopropanol) ou uma cetona (ex. acetona). 0 polímero contendo fucose é precipitado por adição de 1-3 litros de agente precipitante por cada litro de caldo de cultivo. 0 polímero co-precipita com as células, proteínas, sais e outros componentes do caldo de cultivo insolúveis no agente precipitante, podendo ser seco a temperaturas até 80°C ou liofilizado. Este polímero nativo, tal como o caldo de cultivo e o polímero em bruto descritos anteriormente, podem ser utilizados em certas aplicações, como por ex. na indústria mineira, no tratamento de águas residuais ou em alimentação animal.

Num processo de extracção alternativo, o polímero da invenção pode ser parcialmente purificado, por um processo que envolve a remoção das células por centrifugação do caldo de cultivo (10 000-20 000 rpm, 30-60 minutos), seguida de precipitação do polímero por adição de um agente precipitante (1-3 litros de agente precipitante por cada litro de caldo de cultivo). O agente precipitante pode ser qualquer dos solventes descritos atrás (ex. etanol, acetona, isopropanol).

Sendo o caldo de cultivo muito viscoso no final do bioprocesso, a separação das células é facilitada por diluição (adição de 1-4 litros de água desionizada por cada litro de caldo de cultivo) antes da centrifugação. O polímero precipitado pode ser seco a 80°C ou liofilizado. Este polímero semi-purifiçado pode ser utilizado em diversas aplicações, tais como por ex. nas indústrias agro22 alimentares, cosmética, do papel, das tintas ou do petróleo, entre outras.

A obtenção do polímero com um grau de pureza superior envolve, adicionalmente, a aplicação de um ou vários dos seguintes processos:

1) Re-precipitação do polímero semi-purifiçado a partir de soluções aquosas deste em concentrações reduzidas (0,1-5,0 g/L), aumentando o grau de pureza com o número de re-precipitações realizadas;

2) Precipitações sucessivas com diferentes agentes precipitantes, nomeadamente etanol, acetona e/ou isopropanol, ou a utilização de misturas destes solventes, o que promove a eliminação de diferentes contaminantes solúveis em cada solvente;

3) Lavagem do polímero semi-purifiçado com solventes nos quais este seja insolúvel (ex. hexano), mas que solubilize um ou vários dos contaminantes nele presentes;

4) Utilização de enzimas proteolíticas (ex. tripsina), adição de agentes que precipitam proteínas (ex. ácido tricloroacético) ou desnaturação de contaminantes de natureza proteica por aquecimento a temperaturas entre 60 e 80°C;

5) Diálise, ultrafiltração ou diafiltração de soluções aquosas do polímero semi-purifiçado, em concentrações reduzidas (0,1-5,0 g/L), o que resulta num elevado grau de pureza, já que o polímero, possuindo um peso molecular elevado, é separado de todos os contaminantes de peso molecular inferior.

O polímero purificado obtido por qualquer destes processos pode ser seco a temperaturas até 80°C ou liofilizado. O grau de pureza superior do polímero purificado permite que possa ser utilizado nas indústrias alimentar, farmacêutica e cosmética, entre outras.

Podem ser utilizadas várias combinações dos diferentes processos referidos atrás para extrair/purificar o polímero, de acordo com o grau de pureza pretendido para a aplicação a que este se destina.

3. Caracterização do polímero

3.1. Composição polímero da presente invenção tem como principal constituinte um polissacárido de elevado peso molecular (10⁶— 10⁷), que compreende na sua constituição uma quantidade de fucose que representa pelo menos 10% do conteúdo total em açúcar. O polímero contendo fucose possui na sua composição glucose e galactose (20-70% e 10-40% do conteúdo total em açúcar, respectivamente). A proporção relativa entre a fucose, a glucose e a galactose no polímero varia ao longo do tempo de cultivo e é dependente das condições de operação do reactor.

O polímero da invenção pode, ainda, conter, em menores quantidades (<5%) outros açúcares neutros, tais como por ex. manose, ramnose, xilose, ribose, arabinose, ácido glucurónico e/ou glucosamina.

O referido polímero possui, também, componentes não sacarídeos, nomeadamente, grupos acilo substituintes, que representam até cerca de 25% do seu peso seco. Os principais grupos acilo que fazem parte da composição do polímero são o succinato, o piruvato e o acetato.

Tipicamente, o acetato e o piruvato representam entre 0,5 e 5% do peso seco do polímero, enquanto que o succinato está presente em quantidades mais elevadas, nomeadamente, entre 1 e 20. O conteúdo do polímero da invenção em cada um dos grupos acilo substituintes é dependente das condições de operação do reactor e do tempo de cultivo do microrganismo. A presença de piruvato e succinato confere ao polímero carácter aniónico. Devido a esta característica, o polímero possui afinidade para se ligar a catiões, o que o torna capaz de imobilizar metais tóxicos, potenciando a sua utilização na remoção de metais tóxicos (metais pesados e radionucleótidos) de solos e meios aquáticos contaminados.

Dependendo do método de extracção/purificação utilizado, o polímero obtido pode apresentar, para além do polissacárido contendo fucose, componentes remanescentes do caldo de cultivo, nomeadamente proteínas e cinzas. O conteúdo nestes componentes é máximo nos polímeros em bruto e nativo (15-30% e de proteínas e 25-40% de cinzas) e mínimo no polímero purificado por diálise (<1%).

3.2. Peso molecular do polímero

O peso molecular médio do polímero na sua forma purificada, determinado por Cromatografia de Permeação em Gel, é da ordem de 10⁶-10⁷. Tipicamente, quando a síntese é iniciada durante o processo de cultivo, o polímero apresenta um peso molecular médio na ordem de 10⁵, aumentando ao longo do tempo de cultivo até atingir um valor na ordem de 10⁶-10⁷ e permanecendo praticamente constante a partir daí.

3.3. Propriedades do polímero

3.3.1. Solubilidade polímero da invenção é insolúvel na maioria dos solventes orgânicos, incluindo acetona, isopropanol, DMSO, hexano, dietiléter, xileno e tetracloroetileno, entre outros, em testes realizados à temperatura ambiente. Esta característica do polímero poderá ser útil no desenvolvimento de certas aplicações, tais como por ex. preparação de membranas para utilização em processos de separação.

Verificou-se, ainda, que o polímero da invenção é solúvel em alguns solventes orgânicos, como por ex. tetraclroroetano.

polímero da invenção é estável na presença dos solventes orgânicos testados, ou seja, manteve a sua composição tanto em termos dos açúcares constituintes como dos grupos acilo substituintes. Também o peso molecular do polímero não foi alterado pelo contacto com os solventes testados.

3.3.2. Viscosidade em meio aquoso polímero da invenção em solução aquosa é um fluido não Newtoniano, com comportamento pseudoplástico (Figura 2) . A viscosidade aparente de uma solução aquosa do polímero, numa concentração de 0,8% (p/v), medida a 25°C, é de 0,21 Pa.s, para uma velocidade de corte de 5 s^-1, diminuindo para 0,02 Pa.s, quando a velocidade de corte aumenta para 500 s^-1. As soluções recuperam a viscosidade instantaneamente quando a velocidade de corte é reduzida, não existindo nenhum fenómeno de histerese. O facto das soluções aquosas do polímero da invenção possuir um comportamento pseudoplástico, confere-lhe a capacidade para modificar as propriedades físicas de sistemas aquosos, potenciando a sua utilização como agente espessante ou texturizante, principalmente nas indústrias alimentar, cosmética e farmacêutica.

A viscosidade aparente das soluções aquosas do polímero da invenção diminui com o aumento da temperatura, mantendo-se, no entanto, o comportamento pseudoplástico. A viscosidade aparente de uma solução aquosa do polímero, numa concentração de 0,8% (p/v), para uma velocidade de corte de 5 s^-1, é de 0,32 Pa.s a 15°C, diminuindo para 0,05 Pa.s a 65°C.

Foi estudado o efeito da variação da temperatura ao longo do tempo, em ciclos consecutivos de aquecimento e arrefecimento, entre 25°C e 40, 55, 70 e 80°C. Verifica-se que o módulo de perda (G''), o módulo conservativo (G' ) e a viscosidade aparente registados no início e no fim de cada ciclo são praticamente coincidentes, indicando que as propriedades da solução se mantêm bastante estáveis quando esta é exposta a variações consecutivas de temperatura até 80°C. Assim, as soluções do polímero da invenção afiguram-se como boas candidatas para serem usadas em formulações aquosas, tais como produtos alimentares, que são sujeitas a flutuações de temperatura durante o seu processamento.

Tendo em conta o espectro mecânico é ainda possível concluir que a solução de polímero contendo fucose se comporta como um líquido viscoso (G''>G' em toda a gama de frequências estudada), não se registando nenhum processo de gelificação nas condições estudadas.

3.3.3. Actividade emulsionante

O polímero da invenção possui actividade emulsionante, ou seja, possui a capacidade para estabilizar emulsões entre soluções aquosas e compostos hidrofóbicos, tais como óleos (ex. azeite, parafina) e hidrocarbonetos (ex. hexano, tolueno) . Devido a esta propriedade, o polímero pode ser usado como bioemulsionante ou agente estabilizador de emulsões, podendo substituir emulsionantes sintéticos em numerosas aplicações nas indústrias petrolífera, dos detergentes, têxtil, papel, tintas, cosmética, farmacêutica e alimentar, entre outras.

Qualquer das formas de polímero, nomeadamente, em bruto, nativo, semi-purifiçado e purificado, possui a capacidade para estabilizar emulsões entre soluções aquosas e compostos hidrofóbicos. A formação de emulsões foi verificada utilizando soluções aquosas do polímero da invenção com concentrações entre 0,05 e 1,5%, quando misturadas com vários hidrocarbonetos (ex. hexadecano, hexano, tolueno, xileno) e óleos (ex. azeite, parafina). As emulsões assim preparadas mantiveram-se estáveis por várias semanas. Além disso, mostraram ser muito estáveis à temperatura, mantendo-se inalteradas após aquecimento desde a temperatura ambiente até 40, 50, 60 e 100°C.

3.3.4. Actividade floculante

O polímero da invenção também possui actividade floculante, pelo que pode ser utilizado como biof loculante natural. Os agentes floculantes são úteis, por ex. na agregação de colóides e células, sendo largamente utilizados em aplicações industriais, tais como, tratamento de águas residuais, tratamento de água potável, alimentos, entre outras. A vantagem do polímero da invenção como biofloculante reside na sua biodegradabilidade e segurança, já que os floculantes sintéticos são perigosos para a saúde humana e a sua degradação no ambiente é difícil.

A actividade floculante do polímero da invenção diminui de 70 para 60% com o aumento da concentração de polímero de 0,1 para 0,8% (p/v), à temperatura ambiente e pH neutro. A actividade floculante do polímero contendo fucose foi comparada com outros polissacáridos comerciais, nomeadamente, xantano, alginato, goma de Guar e carboximetilcelulose. 0 polímero da invenção revelou ser um bom agente floculante, com uma actividade floculante semelhante à dos referidos polissacáridos, para a mesma concentração em polímero.

3.3.5. Formação de filmes polímero contendo fucose pode ser usado em mistura com outros polímeros biodegradáveis, como por ex. amido, pectina, alginato, carragenato, glúten, gelano e quitosano, na produção de filmes biodegradáveis. Estes filmes podem ser aplicados na produção de embalagens, e como apresentam uma baixa permeabilidade a gases (oxigénio e dióxido de carbono), são potencialmente aplicáveis em embalagens específicas para produtos alimentares.

Polissacáridos como o quitosano, o amido e a goma de Guar têm sido testados para a preparação de microesferas para a libertação controlada de fármacos. 0 polímero a que se refere esta invenção poderá ser usado, isoladamente ou em conjunto com outros polímeros, para o mesmo efeito.

4. Utilizações do polímero da presente invenção polímero desta invenção apresenta actividade floculante e emulsionante, e forma soluções aquosas de elevada viscosidade, com comportamento de fluido pseudoplástico. Assim sendo, pode substituir outros polissacáridos, tais como por ex. o xantano, o alginato, o carrageno, a goma de Guar e a goma-arábica, nas suas numerosas aplicações, nomeadamente nas indústrias agro-alimentar, farmacêutica e cosmética, como agente espessante, texturizante ou ligante.

polímero contendo fucose pode ser usado em conjunto com outros polímeros biodegradáveis (ex. amido, pectina, alginato, carragenato, glúten, gelano ou quitosano) na produção de filmes biodegradáveis. Estes filmes podem ser aplicados na produção de embalagens, e como apresentam uma baixa permeabilidade a gases (oxigénio e dióxido de carbono), são potencialmente aplicáveis em embalagens específicas para produtos alimentares.

polímero contendo fucose pode ainda ser usado como fonte de oligossacáridos, obtidos a partir do polímero original usando tratamentos físicos (ex. microondas, calor, irradiação e ultrassonicação), químicos (ex. hidrólise ácida), enzimáticos (ex. hidrolases e liases) ou biológicos (por acção de microrganismos que degradam o polímero, alimentando-se dos açúcares constituintes, à excepção da fucose). A fucose e os fuco-oligossacáridos assim obtidos, assim como o polissacárido contendo fucose, isoladamente ou em conjunto, têm potencial aplicação médica como agentes anticancerígenos, anti-inflamatórios ou no tratamento de artrite reumatóide, entre outros (Vanhooren e Vandamme, 1999; Péterszegi et al, 2003b). O polímero da invenção também tem grande potencial de aplicação em cosméticos, já que a presença de fucose na sua composição antevê a sua utilização, por ex. em produtos hidratantes ou anti-envelhecimento (Péterszegi et al, 2003a).

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção do polímero contendo fucose a partir de glicerol, subproduto da indústria do biodiesel, por cultivo da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139)

Uma cultura de Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) foi inoculada em 8 litros de meio nutriente com a composição descrita na

Tabela 3. 0 reactor (BioStat B-plus, Sartorius) foi operado nas seguintes condições: temperatura controlada a 30°C; pH controlado a 6,80±0,05, por adição automática de NaOH 1M; arejamento constante de 1,6 L/min (0,2 vvm). Concomitante com o crescimento celular, a concentração em oxigénio dissolvido diminuiu gradualmente, de 80% de saturação, no inicio do cultivo, para cerca de 20%, ao fim de 1 dia.

A partir desse momento, foi iniciada a alimentação do reactor, em continuo (cerca 20 mL/h), com uma solução de alimentação, cuja composição é a descrita na Tabela 3, excepto pelo facto da concentração em glicerol ser 200 g/L. Deste modo, foram criadas, no caldo de cultivo, condições de limitação em azoto (concentração inferior a 0,1 g N/L) e de disponibilidade em fonte de carbono.

Tabela 3: Composição do meio de cultura.

componente	concentração
Glicerol subproduto K₂HPO₄ kh₂po₄ (NH₄) ₂hpo₄ Solução mineral¹¹¹ MgSO₄ 100 mM	25 g/L 5,8 g/L 3,7 g/L 3,3 g/L 1,0 mL/L 10 mL/L
⁽¹⁾ composição da solução mineral (para 1 litro de HC1 IN) : FeSO₄'7H₂O, 2,78 g; MnCl₂'4H₂O, 1,98 g; CoS0₄'7H₂0, 2,81 g; CaCl₂'2H₂O, 1,67 g; CuCl₂'2H₂O, 0,17 g; ZnSO₄'7H₂O, 0,29 g)

A concentração em oxigénio dissolvido diminuiu gradualmente, sendo inferior a 10% de saturação, ao fim de 2 dias de cultivo. A partir desse momento, a concentração em oxigénio dissolvido foi controlada abaixo de 10%, por variação automática da agitação entre 400 e 800 rpm. Ao fim de cerca de 1 dia nestas condições, verificou-se o aumento muito rápido da viscosidade do caldo de cultivo, o que se relaciona com a produção do polímero.

Ao fim de 4 dias de cultivo a produção de polímero (extraído e quantificado na sua forma semi-purifiçada) foi de aproximadamente 13,3 g/L (Figura 3) . Embora a quantidade de polímero sintetizado não tenha aumentado entre os dias 4 e 7 de cultivo, a viscosidade do caldo de cultivo aumentou significativamente. Considerando o intervalo de tempo de cultivo durante o qual se observou a produção do polímero (de 1 a 4 dias), foi obtida uma produtividade de 3,6 g IF¹ dia^-1 e um rendimento em glicerol de 0,47 g g^-1.

O cultivo foi terminado ao fim de 7 dias quando foi atingido um valor de viscosidade de 3,0 Pa.s, medida com uma velocidade de corte de 5 s^-1, a 30°C.

Exemplo 2: Extracção e purificação do polímero contendo fucose produzido por Enterobacter sp. A47 (DSM 23139), a partir de glicerol, subproduto da indústria do bíodíesel

No final do processo de cultivo em reactor descrito no Exemplo 1, o polímero contendo fucose foi recuperado do caldo de cultivo, tendo sido obtido em três formas com diferentes graus de pureza, nomeadamente: polímero nativo, semipurif içado e purificado.

O polímero, na sua forma nativa, foi obtido por adição de acetona (3 litros de acetona por cada litro de caldo de cultivo). Foram obtidas 20,6 g/L de polímero nativo.

Para a obtenção de polímero semi-purifiçado, este foi precipitado pela adição de acetona ao sobrenadante sem células, obtido por centrifugação do caldo de cultivo (20 000 rpm, 30 minutos). Para se conseguir uma remoção eficiente das células, foi necessário diluir o caldo de cultivo com água desionizada (2 litros de água desionizada para cada litro de caldo fermentativo). O sobrenadante sem células assim obtido foi misturado com acetona (3 litros de acetona para cada litro de sobrenadante), com agitação suave. O precipitado obtido foi ressuspendido em água desionizada e liofilizado. Foram obtidas 11,6 g/L de polímero semi-purifiçado.

Com o objectivo de obter o polímero purificado, uma suspensão aquosa de polímero semi-purifiçado foi sujeita a diálise em água desionizada, durante 24 horas. Para tal, foi utilizada uma membrana de 3500 MWCO (SnakeSkinTM Pleated Dialysis Tubing 68035 - Thermo Scientific). Foi adicionada azida de sódio (6 ppm) para prevenir a biodegradação do polímero durante o processo de diálise. Após a diálise, o polímero foi precipitado pela adição de acetona, redissolvido em água desionizada e, finalmente, liofilizado. Foram obtidas 5,5 g/L de polímero purificado.

O polímero pode ser extraído/purifiçado utilizando o seguinte método alternativo: diluição do caldo de cultivo e centrifugação, para eliminação das células; aquecimento a 60°C durante 1 hora, para inactivação de enzimas presentes no sobrenadante e que poderiam degradar parcialmente o polímero durante a sua purificação; diálise do sobrenadante em água desionizada; liofilização do polímero. Com este método foram obtidas 5,0 g/L de polímero purificado.

Exemplo 3: Análise química do polímero contendo fucose produzido por Enterobacter sp. A47 (DSM 23139)

A composição do polímero produzido como descrito no Exemplo 1 e extraído como descrito no Exemplo 2 foi caracterizado em termos da sua composição química, nomeadamente a sua composição glicosídica, o conteúdo em grupos acilo substituintes e o conteúdo em componentes não sacarídeos (proteínas e cinzas), usando os métodos descritos por Freitas et ai (2009) . Foi realizada a análise da composição do polímero produzido ao longo do tempo de cultivo em reactor, extraído na sua forma semi-purifiçada, assim como do polímero nativo, semi-purifiçado e purificado por diálise.

O polímero produzido ao fim de 1 dia de cultivo era constituído maioritariamente por glucose (77%) e galactose (15%), sendo a fucose um componente minoritário (6%) . Ao longo do cultivo, a proporção relativa entre estes açúcares variou significativamente: a quantidade de glucose no polímero diminuiu gradualmente, representando 40% dos açúcares do polímero, ao fim de 4 dias de cultivo; nesse período de tempo, o conteúdo em galactose e fucose aumentou para 26% e 28%, respectivamente.

A composição em açúcares manteve-se praticamente inalterada durante os três últimos dias de cultivo. De facto, nesse período de tempo, a composição em açúcares manteve-se praticamente inalterada (glucose, 40-44%; fucose, 26-30%; galactose, 28-29%).

Também se verificou uma variação na proporção relativa dos grupos acilo substituintes ao longo do tempo de cultivo: no dia 1, o polímero continha cerca de 2,4% de succinato, 0,2% de piruvato e 0,3% de acetato; entre os dias 1 e 4, o conteúdo em succinato, piruvato e acetato aumentou para 20%, 2,4% e 2,0, respectivamente; no dia 7, o conteúdo em succinato diminuiu para 3,9%, enquanto que o conteúdo em piruvato e em acetato continuou a aumentar (4,9% e 3,6%, respectivamente).

A composição glicosidica e em grupos acilo é semelhante para as diferentes forma de polímero recuperado do caldo de cultivo. Pelo contrário, o conteúdo em resíduos não sacarídeos, nomeadamente proteínas e cinzas, diminui do polímero nativo para o polímero semi-purifiçado e, deste, para o polímero purificado.

Examplo 4: Produção do polímero contendo fucose a partir de glicerol, subproduto da indústria do biodiesel, por cultivo da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) em diferentes condições de pH e temperature

A bactéria Enterobacter A47 (DSM 23139) foi cultivada em biorreactores de, como descrito no exemplo 1, excepto pelo facto do pH e da temperatura terem sido controlados a diferentes valores, de acordo com a tabela 4. No final de cada ensaio, os polímeros foram recuperados como descrito no exemplo 2.

Tabela 4: Valores de pH e temperatura testados.

ensaio	T (°C)	pH	μ (h-¹)	^max (g/L)	EPSmax (g/L)	(g/Ld)	Yp/S (g.g^-1)
1	30,0	7,0	0, 30	7,14	8,37	5,00	0,17
2	30,0	7,0	0, 32	7,58	10,13	4,94	0,21
3	20,0	6, 0	0, 14	7,41	0, 82	0,19	0,01
4	40,0	6, 0	0, 34	9,20	2,59	0,81	0,03
5	20,0	8,0	0, 13	8,39	4,40	2,54	0,10
6	40,0	8,0	0,22	5,63	1, 62	1,34	0,04
7	15,9	7,0	0, 08	8,17	1, 12	0,33	0,02
8	44,1	7,0	—	0,21	0,23	0,06	0,02
9	30,0	5, 6	0, 10	10,62	7,50	2,05	0,09
10	30,0	8,4	0, 07	3,01	2,67	2,38	0,09

As condições que maximizam o crescimento celular, a produção de polímero e a sua produtividade são temperatura entre 25 e 34°C, e pH entre 6,5 e 7,5 (Tabela 4). Adicionalmente, nestas gamas o conteúdo do polímero em fucose é máximo. For a destas gamas, a cultura sintetiza polímeros com composições diferentes, tais como, por exemplo: redução do conteúdo em fucose (<14%), concomitante com um aumento do conteúdo em glucose (>50%) e o aparecimento de novos monómeros (ex. ramnose e glucosamina) como componentes (conteúdos até 20% e 10%, respectivamente). O ácido glucurónico também foi detectado nestes polímeros com um conteúdo até 15%. O conteúdo em grupos acilo também foi afectado pela tempertaura e pelo pH, tendo sido reduzidos para conteúdos inferiores a 10% do peso seco do polímero.

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LISTA SEQUÊNCIAS <110> Bio73100

73100

73100, Bio <120> Fucose-containing bacterial biopolymer <130> PAT 41306/09 <160>1 <170> Patentln version 3.5 <210>1 <211>1523 <212> DNA <213> Enterobacter <400>1 tgatcctggc tcagattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc gaacggtaac60 aggaagcagc ttgctgcttc gctgacgagt ggcggacggg tgagtaatgt ctgggaaact120 gcctgatgga gggggataac tactggaaac ggtagctaat accgcataay gtcgcaagac180 caaagagggg gaccttcggg cctcttgcca tcggatgtgc ccagatggga ttagctagta240 ggtggggtaa cggctcacct aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga tgaccagcca300 cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca360 atgggcgcaa gcctgatgca gccatgccgc gtgtatgaag aaggccttcg ggttgtaaag420 tactttcagc ggggaggaag gcgataaggt taataacctt gtcgattgac gttacccgca480 gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta540 atcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgca ggcggtctgt caagtcggat gtgaaatccc600 cgggctcaac ctgggaactg cattcgaaac tggcaggcta gagtcttgta gaggggggta660 gaattccagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctggag gaataccggt ggcgaaggcg720 gccccctgga caaagactga cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat780 accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gacttggagg ttgtgccctt gaggcgtggc840 ttccggagct aacgcgttaa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca900 aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg960

aagaacctta	cctactcttg	acatccagag	aactttccag	agatggattg	gtgccttcgg	1020
gaactctgag	acaggtgctg	catggctgtc	gtcagctcgt	gttgtgaaat	gttgggttaa	1080
gtcccgcaac	gagcgcaacc	cttatccttt	gttgccagcg	gtyaggccgg	gaactcaaag	1140
gagactgcca	gtgataaact	ggaggaaggt	ggggatgacg	tcaagtcatc	atggccctta	1200
cgagtagggc	tacacacgtg	ctacaatggc	gcatacaaag	agaagcgacc	tcgcgagagc	1260
aagcggacct	cataaagtgc	gtcgtagtcc	ggattggagt	ctgcaactcg	actccatgaa	1320
gtcggaatcg	ctagtaatcg	tggatcagaa	tgccacggtg	aatacgttcc	cgggccttgt	1380
acacaccgcc	cgtcacacca	tgggagtggg	ttgcaaaaga	agtaggtagc	ttaaccttcg	1440
ggagggcgct	taccactttg	tgattcatga	ctggggtgaa	gtcgtaacaa	ggtaaccgta	1500
gggaacctgc	gggctggatc	acc				1523

Lisboa, 15 de Dezembro de 2010

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um processo para a preparação de um polímero que compreende um polissacárido que contém fucose, em que o polímero é obtido através do cultivo de uma cultura bacteriana de

Enterobacter

Ά4 7

DSM

23139 caracterizado por ser composto pelos seguintes passos:

a) cultivar a cultura microbiana num biorreactor agitado e arejado

b) suplementar a referida cultura microbiana com uma fonte de carbono contendo glicerol ou mistura contendo glicerol, uma fonte de azoto e sais minerais

c) inoculo da bactéria

d) síntese do polímero

e) extracção do polímero

f) purificação.
2. Processo, de acordo com as reivindicações 2-3, caracterizado por:

a) a concentração inicial de oxigénio dissolvido no meio de cultura bacteriano é superior a 70%;

b) quando a concentração de oxigénio dissolvido no meio de cultura atinge 30%, então essa referida concentração de oxigénio dissolvido é controlada para se manter a níveis inferiores a 30%, ou inferiores a 20%, ou inferiores a 10%, ou mesmo a níveis de condição anaeróbica, mantendo a fonte de azoto limitada a quantidades inferiores a 0,3 g/L, ou inferiores a 0,2 g/L, ou inferiores a 0,1 g/L ou mesmo sem adição de fonte de azoto, enquanto de fornece a fonte de carbono de modo a coincidir com a taxa de consumo microbiano.

1/5
3. Processo, de acordo com as reivindicações 2-4, caracterizado por compreender uma fase inicial em descontínuo, seguido de uma fase com alimentação, durante a qual é introduzido no biorreactor meio mineral.
4. Processo, de acordo com as reivindicações 2-5, caracterizado por a temperatura do passo de cultivo estar compreendida entre 15 e 45 °C, e o pH estar compreendido entre 5,0 e 9,0.
5. Processo, de acordo com as reivindicações 2-6, caract eri zado por o meio de cultura no final do passo de cultivo ser seco a uma temperatura até 80 °C, ou liofilizado.
6. Processo, de acordo com as reivindicações 2-7, caract eri zado por após a extracção, o meio de cultura ser precipitado pela adição de 1-3 volumes do agente precipitante, por cada litro de meio.
7. Processo, de acordo com as reivindicações 2-8, caracterizado por o polímero ser posteriormente purificado, por, entre outras técnicas de diálise, ultrafiltração ou diafiltração.
8. Processo, de acordo com as reivindicações 2-9, caracterizado por o volume de inoculo, estar compreendido entre 10 e 30% do total de meio de reacção no início do cultivo.

2/5
9 Processo, de acordo com as reivindicações 2-
10, caracterizado por a fonte de carbono ser um resíduo ou subproduto alimentar ou industrial.

10 - Processo, de acordo com as reivindicações 2-11, caracterizado por a fonte de carbono estar compreendida entre 2-10% (w/v) do meio nutriente aquoso, durante a fase em descontínuo, e superior a alimentação.

0,1% (p/v) durante a fase com
11 - Processo, de acordo com as reivindicações 2-12, caracterizado por a fonte de azoto ter uma concentração inicial compreendida entre 0,6 e 3,0 g/L, durante a fase descontínuo, e ser inferior a 0.3 g/L durante a fase com alimentação .
12. Um polímero obtido pelo processo descrito em qualquer uma das reivindicações 1- caracterizado por compreender um peso molecular médio compreendido entre 106 - 107, e por compreender fucose num conteúdo superior a 10%, um conteúdo de glucose compreendido 20%-70% e um conteúdo de galactose compreendido entre 10%-40% e um conteúdo de ácido glucurónico até 15% do total do conteúdo de carbohidratos, e no qual os grupos acilo representam 25% do total do peso seco do polímero.
13. Polímero, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por os grupos acilo serem succinato e/ou piruvato e/ou acetato.

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14. Polímero, de acordo com as reivindicações 12-13, caracterizado por os compostos acilados, compreenderem conteúdos de sucinato superiores a 20%, piruvato e/ou acetado em conteúdos superiores a 5% do peso seco do polímero.
15. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-14, caracterizado por possuir comportamento de fluido pseudoplástico em meio aquoso, com uma viscosidade estável a temperaturas até 80 °C, pH compreendido entre 3-10 e força iónica até 20% de NaCl.
16. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-15, caracterizado por ser insolúvel em solventes orgânicos.
17- Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-16, caracterizado por possuir a capacidade de formar emulsões e capacidade estabilizadora contra vários compostos hidrofóbicos, tais como óleos vegetais e minerais e hidrocarbonetos, sendo as emulsões estáveis a aquecimento a temperaturas até 100 °C.
18- Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações

12-17, caracterizado por possuir actividade floculante.
19- Filmes, revestimentos e embalagens caracterizados por conterem o polímero descrito em qualquer uma das reivindicações 12-18.

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20 - Filmes compósitos biodegradáveis caracterizados por conterem o polímero descrito nas reivindicações 12-18.
21- Microesferas para libertação controlada de fármacos, caracterizadas por conterem o polímero descrito nas reivindicações 12-18.

Formulações farmacêuticas e cosméticas caracterizadas por conterem o polímero descrito nas reivindicações 12-18.
23 - Utilização do polímero descrito nas reivindicações 1218 caracterizado por ser usado na indústria agroalímentar, farmacêutica e cosmética e/ou no tratamento de resíduos.