JPH1156384A - 多糖類の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】経済的かつ汎用的な方法で、微生物より得られ
る多糖類を効率的に分離し精製する方法を提供する。 【解決の手段】微生物の培養液に酸を加えてｐＨ３以下
とした後に、アルカリを加えてｐＨ１２以上とし、さら
に酸を加えてｐＨ５〜９とし、その後に菌体と多糖類含
有液体とを分離することを特徴とする多糖類の精製方法
を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は微生物より得られる
多糖類を、その培養液から効率的に分離して精製する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】自然界にはセルロ−ス（繊維素）、海
藻、植物樹液、植物種子などの大量の多糖類を含有する
資源があり、多糖類の化学的な誘導体化を含め数多くの
多糖類を含む製品が生み出され、産業の広い分野に用い
られている。これらの多糖類の内、微生物より得られる
多糖類は天然に得られる多糖類の中でも容易にかつ安定
的に製造でき、さらにその種類、機能についても、多く
の種類があり、幅広い機能を有していることから、近
年、様々な製品化のための検討がなされており、キサン
タン、デキストラン、プルラン、カ−ドラン、ジェラ
ン、ウェランなどが製品として市販されている。また、
これら以外にも種々の多糖類が商品化に向けて開発され
ており、さらに、ヒアルロン酸などは動物からの抽出品
を代替して市販されている。殊にキサンタンは微生物よ
り得られる多糖として産業上極めて有用であり、粘性、
分散安定性、乳化安定性、チキソトロピ−性など合成高
分子などの高分子材料で代替できない性質を有してお
り、かつ無毒で環境適合性が良いなどの社会的要請にも
合致している。このように、微生物より得られる多糖類
は合成高分子材料では代替できない優れた性質を有して
いる。

【０００３】しかしながら、微生物より得られる多糖類
の多くはその重合度が極めて高く、分子間あるいは分子
内の相互作用が大きいことから、微生物を培養して得ら
れる培養液からの分離が困難となることがある。特に粘
性、乳化性、分散性の高い多糖類においては、微生物菌
体とその微生物が生産した多糖類との分離が製造工程に
おいて大きな障害となる。これを解決するために、水に
よる希釈、酸処理、熱処理、あるいは酵素処理などの処
方が考案されている。

【０００４】例えば特開平６−１９７７８４には、培養
液をｐＨ０．５―２．５にして低級アルコールなどの水
溶性溶媒を加えて、その後アルカリで中和して多糖を沈
澱させる方法が提案されている。特開平８−１５４６９
５には、ｐＨを９―１２．５にした培養液を３０分以上
４５―７０℃で熱処理し、その後ポリリン酸を加えてか
らアルカリプロテアーゼで溶菌させる方法が提案されて
いる。特開平８−１７５９６６には、培養液のｐＨを１
０％硫酸で４．５に調整し、１２１℃で９０分間の湿熱
滅菌後、遠心分離により菌体を除去する方法が提案され
ている。特開平８−３１９４７４には、培養液を水で１
０倍に希釈してから９０℃まで加熱した後、遠心分離す
る方法が提案されている。特開平９−１９６３３には、
培養液のｐＨを１０％硫酸で４．５に調整し、１２１℃
で９０分間の湿熱滅菌後、遠心分離により菌体を除去す
る方法が提案されている。

【０００５】しかしながら、これらの方法は処理にかか
る費用面の問題や、操作手順等において多種の多糖類に
対応できるような一般的な方法とはいえず、スケールア
ップが困難であるという問題があった。

【０００６】また、メチロフィルス属細菌ＡＴＣＣ３１
５０４株を適当な条件で培養すると著量の多糖類（以
下、メチロフィルス属細菌ＡＴＣＣ３１５０４株が生産
する多糖類を、「ＰＳ１００４」と呼ぶ）を生産するこ
とが知られている（特開昭５５−７５４０１）が、この
菌株の生産する多糖類はもともと菌体に結合しており、
培養継続と共に徐々に菌体より培地中へ放出されるとい
う性質がある。培養の後期においては多糖類が蓄積して
培養液の粘度が上昇する上に、多糖類のもつ分散性（高
分子界面活性剤としての性質）と糖鎖間の強い分子間相
互作用のために菌体と液体の分離が甚だしく困難にな
り、その精製を行うにあたっての課題となっていた。本
発明者らは、この株の産生する多糖類を経済的に製造す
る方法を種々検討し、粘度を減少させる目的で水による
希釈、アルコ−ル類の添加、酸（酢酸あるいは塩酸）の
添加などを試みたが、これらのいずれの方法によっても
菌体と液体の効果的な分離は達成されず、その精製方法
が大きな課題となっていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】このように従来の方法
により微生物より得られる多糖類の製造及びその分離、
精製を行う場合、経済的な方法ではなく、また、多糖類
の分離、精製の手段としても多種の多糖類に対応できる
方法ではなく、スケールアップも容易な方法ではないと
いう問題があり、本発明はこのような問題点に鑑みてな
されたものである。その目的は、経済的かつ汎用的な方
法で、微生物より得られる多糖類を効率的に分離し精製
する方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、微生物を培養す
ることで得られる多糖類、特にＰＳ１００４のようなウ
ロン酸を構成糖として含む多糖類を精製し回収するにあ
たり、まず微生物の培養液を酸性にして蛋白質を変性さ
せて溶菌を防ぎ、その後にアルカリを加えて多糖類の水
溶性を高め粘性を低下させて菌体と多糖類との分離を容
易とし、さらにその後にｐＨを中性付近とすることで、
微生物の生産する多糖類を容易にかつ収率良く回収する
ことができ、さらにこの回収された多糖類含有液体に水
溶性溶媒及び／又はカチオン性界面活性剤を添加するこ
とで多糖類を精製できることを見出し本発明を完成する
に至った。

【０００９】すなわち本発明は、微生物の培養液に酸を
加えてｐＨ３以下とした後に、アルカリを加えてｐＨ１
２以上とし、さらに酸を加えてｐＨ５〜９として菌体と
多糖類含有液体とを分離すること、さらに分離された多
糖類含有液体に水溶性溶媒やカチオン性界面活性剤を添
加して多糖類を精製する方法に関する。

【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１１】本発明の方法において用いられる微生物と
しては、多糖類を生産できるものであれば特にその属、
種については限定されることはないが、その培養が容易
であり、また栄養源として安価な材料より生育できる点
から、メチロフィルス属、メチロボラス属、メチロバク
テリウム属などのメタノール資化性細菌が好ましく用い
られる。さらにこれらの細菌の内、多糖類、特にグルク
ロン酸を含む高分子量の多糖を大量に生産することか
ら、メチロフィルス属細菌ＡＴＣＣ３１５０４株が好ま
しく用いられる。ここで、メチロフィルス属細菌ＡＴＣ
Ｃ３１５０４株とは、土壌中より分離されて、かつてシ
ュードモナス・ビスコゲナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｖｉｓｃｏｇｅｎａ）ＴＳ−１００４株と命名され（特
開昭５３ー１１８５８５）、工業技術院生物工業技術研
究所に微工研菌寄第３８１１号として寄託されたもので
あるが、本発明者らによって再同定され、メチロフィル
ス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌ＡＴＣＣ３１
５０４株と改名された。本菌株はまたＡＴＣＣ（アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション）にＡＴＣＣ
３１５０４として寄託されている。このＡＴＣＣ３１５
０４株は住商ファーマ インターナショナル株式会社を
通じてＡＴＣＣより入手することができる。

【００１２】微生物の培養方法については通常微生物の
培養に用いられる培地で良いが、培地に含まれる微生物
の成育に必要な炭素源としてはメタノールが好ましく用
いられ、その濃度は０．１〜５容量％程度、より好まし
くは０．５〜１．５容量％程度である。窒素源としては
アンモニウム塩が好ましく用いられ、特にｐＨ緩衝能や
リン分の補給の点からリン酸アンモニウムが好ましい。
また、培養が進行すると培地のｐＨが低下するため、ア
ルカリを滴下してｐＨ６〜８、より好ましくは６．５〜
７．５の範囲となるように調整して培養を行うことが好
ましい。この際使用されるアルカリとしては、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、アンモニア、アミン化合物
など任意のものが使用できるが、細胞増殖のための窒素
源を補給する面からアンモニアが好ましく用いられる。
また、培地にはビタミン類などの補給のため酵母エキス
を添加しても良い。また、炭素源のメタノールも細胞増
殖につれて徐々に減少していくので、順次追加していく
必要があるが、この際にアンモニアとメタノールの混合
液を追加することもできる。追加の方法としては、一定
量ずつ断続的に追加する方法、連続的に追加する追加す
る方法などあらゆる方法を採用することができる。ま
た、培養温度としては、細胞の増殖速度の面から通常０
〜５０℃で行うが、より好ましくは２５〜３５℃付近で
ある。

【００１３】このようにして培養した培養液から多糖類
が回収され、精製されるが、回収に先立って微生物菌体
を遠心分離などの操作で培養液から予め除去しておくこ
ともできる。多糖類の回収には、塩化セチルピリジニウ
ム、臭化セチルトリメチルアンモニウム等の４級アミン
の塩を利用する方法やメタノール、イソプパノール等の
低級アルコールを添加する方法が利用でき、より高純度
の多糖類標品を得るには前者の方法が、より迅速に多糖
類標品を得るためには後者の方法が好ましく用いられ、
また、これら両方法を併用することもでき、その順序は
どちらでも良い。この方法で回収された多糖類は公知の
方法により乾燥した粉末として、あるいは再度水に溶解
して水溶液として利用される。

【００１４】また、本発明の方法により精製される多糖
類としては、上記記載の微生物が生産するものであれば
特に限定されないが、後記するように精製の際に、例え
ばカチオン性界面活性剤の添加による沈殿を生成しやす
くして精製を容易とするために、多糖類を構成する単糖
として少なくともウロン酸を有するものが好ましく、さ
らにその構成する単糖としてマンノ−ス、アロ−ス、ガ
ラクトース、グルコ−ス及びグルクロン酸からなるもの
であることが好ましく、特に多糖類を構成する単糖のモ
ル比がマンノ−ス１に対してアロ−ス、ガラクトース、
グルコ−ス、グルクロン酸がそれぞれ０．８〜１．５、
５．０〜１０．０、１．０〜５．０、０．５〜２．０で
あることが好ましい。

【００１５】本発明の方法において用いられる酸として
は、通常用いられる無機酸、有機酸のいずれも用いるこ
とができるが、取り扱いの容易さから酢酸、塩酸、トリ
クロロ酢酸、硫酸が好ましく用いられ、さらに少量で所
望のｐＨへと変えられ処理液の容量が少なく済むことか
ら塩酸が好ましく用いられる。これらの酸については、
培養液に対して用いるものと以下に示すアルカリにより
処理された溶液に対して用いるものとの２つがあるが、
両者とも同じものを用いても、異なるものを用いてもよ
い。また、酸の濃度としては本発明の目的を達成できる
濃度であればいかなる濃度のものも用いることができる
が、処理液の容量が少なく済むことから比較的高濃度の
酸を用いることが好ましい。

【００１６】本発明の方法において用いられるアルカリ
としては、通常用いられるアルカリであればよいが、取
り扱いの容易さから水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
等の水酸化アルカリ金属や、アンモニアが好ましく用い
られ、さらに少量で所望のｐＨへと変えられ処理液の容
量が少なく済むことから水酸化ナトリウムが好ましく用
いられる。アルカリとしての形態は、溶液状、固形状の
いずれも用いることができ、特に溶液状のアルカリとし
ては水溶液が好ましく用いられる。アンモニアとして
は、原液のみならず水溶液としたものも用いることがで
きる。また、アルカリの濃度としては本発明の目的を達
成できる濃度であればいかなる濃度のものも用いること
ができるが、処理液の容量が少なく済むことから比較的
高濃度のアルカリを用いることが好ましい。

【００１７】本発明の方法において用いられる水溶性溶
媒としては、多糖類を含む溶液に溶解できるものであれ
ば特に限定されるものではないが、後記するように、精
製された多糖類に残存する水溶性溶媒を除去するために
乾燥することがあるが、その際に揮発性の溶媒であるこ
とが好ましく、さらに炭素数１〜４のアルコールやケト
ン類が好ましく用いられる。例えば、アルコールとして
は、メチルアルコ−ル、エチルアルコ−ル、ｎ−プロピ
ルアルコール、イソプロピルアルコールなどが、ケトン
類としては、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチル
ケトンなどが例示できる。これらの内、メチルアルコ−
ル、エチルアルコ−ル、イソプロピルアルコール、アセ
トンが価格面から好ましく用いられる。これらの水溶性
溶媒は多糖類含有溶液に添加されることで、多糖類の溶
解性を低下させ、結果的に沈殿を生成させるものと考え
られる。しかしながら、このような推察は本発明をなん
ら限定するものではない。

【００１８】本発明の方法において用いられることのあ
るカチオン性界面活性剤としては、多糖類含有溶液に溶
解できるものであれば特に限定されるものではないが、
塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモ
ニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムな
どの芳香族あるいは脂肪族４級アンモニウム塩であるカ
チオン性界面活性剤が好ましく用いられる。

【００１９】次に、本発明の多糖類の精製方法について
より具体的に説明する。

【００２０】本発明の方法は、１）微生物の培養液を酸
やアルカリを用いてそのｐＨを変化させ、菌体と分離し
て得られる多糖類含有溶液を得る工程と、２）さらに必
要に応じて、１）の工程で得られた多糖類含有溶液に水
溶性溶媒及び／又はカチオン性界面活性剤を添加するこ
とで、多糖類を精製する工程、からなっている。

【００２１】まず工程１）について説明すると、工程
１）は、微生物の培養液に酸を加えてｐＨ３以下とした
後に、アルカリを加えてｐＨ１２以上とし、さらに酸を
加えてｐＨ５〜９として菌体と多糖類含有液体とを分離
するものである。

【００２２】ここで、微生物の培養液に酸を加えてｐＨ
３以下とするが、これは培養液を酸性にして蛋白質を変
性させることによって溶菌を防ぐことができるからであ
る。酸を加える際や加えた後に液体を均質とするために
撹拌してもよく、その後３０分程度撹拌を継続してもよ
い。このｐＨの範囲としては、培養液の量と加える酸の
量により変化して一定しないが、少なくともｐＨ３以下
であればよく、通常はｐＨ１程度で十分である。また、
ｐＨを３以下とする際に濁りが生じることがあるため
に、その操作の前に水を加えたり、酸を加えて最終的な
ｐＨよりも高いｐＨにして撹拌し、その後に遠心分離等
の分離処理を行うことで濁りが生じるのを抑制すること
もできる。

【００２３】ついで、上記の溶液にアルカリを加えてｐ
Ｈ１２以上とするが、これは液体中の多糖類、特にＰＳ
１００４のようなウロン酸を含む多糖類は高ｐＨ領域に
おいて水素結合が弱められることにより水溶性が増し、
その後中性に戻してもこれらの操作前に比べると粘度は
はるかに低下して菌体と液体の分離が容易になるからで
ある。アルカリを加える際や加えた後に液体を均質とす
るために撹拌してもよく、その後３０分程度撹拌を継続
してもよい。このｐＨの範囲としては、液体の量と加え
るアルカリの量により変化して一定しないが、少なくと
もｐＨ１２以上であればよく、通常はｐＨ１２〜１３程
度において実施される。

【００２４】このアルカリ添加の処理後さらに酸を加え
てｐＨ５〜９の範囲とするが、これはアルカリ処理後の
液体を中性付近とし、そのまま各種の用途に用いたり、
又は、工程２）の操作へと進めるためである。酸を加え
る際や加えた後に液体を均質とするために撹拌してもよ
く、その後３０分程度撹拌を継続してもよい。この酸を
加える処理中あるいは処理後に濁りが生じても分離処理
を行うことで濁りを除去できる。この分離処理について
は、遠心分離等の操作により沈殿性の菌体成分と多糖類
を含有する液体とを分離できる手法であれば特に限定さ
れるものではない。遠心分離を行う場合、その条件とし
ては特に限定されるものではなく、例えば、８０００×
Ｇ程度の遠心力、２０℃程度の温度にて、２０分間程度
実施することでよい。

【００２５】このような処理により、微生物が生産する
多糖類と微生物菌体とを分離することができるわけであ
るが、その後、必要に応じて、以下に示す多糖類のさら
なる精製を行ってもよい。

【００２６】工程２）は、工程１）により分離された多
糖類含有液体にさらに水溶性溶媒を添加し、及び／又は
カチオン性界面活性剤を添加することからなる。

【００２７】ここで、前記した水溶性溶媒、カチオン性
界面活性剤を多糖類含有液体へ添加する方法としては特
に限定されるものではなく、水溶性溶媒やカチオン性界
面活性剤をそのままあるいはいったん水溶液などの溶液
として加えてもよい。加え方としては、一度に加えても
よいが、徐々に連続的あるいは断続的に加えることもで
きる。

【００２８】加える水溶性溶媒の量としては、多糖類の
回収量を多くし、また使用する水溶性溶媒の量を過度に
多くして不経済的にならないように多糖類含有液体の全
量に対して１〜２倍の範囲の容量を加えることが好まし
い。水溶性溶媒を加えた後に多糖類を含む沈殿が生じる
が、その回収量を多くするためにしばらく、例えば、室
温にて１６時間程度熟成のために静置することが好まし
い。その後遠心分離等の分離操作により沈殿部分の多糖
類が回収できる。なお、この水溶性溶媒を多糖類含有溶
液へ加える操作は、１回のみならず２回以上繰り返し行
ってもよく、繰り返すことで得られる多糖類の純度が向
上することが期待できる。

【００２９】また、加えるカチオン性界面活性剤の量と
しては、多糖類の回収量を多くし、また使用するカチオ
ン性界面活性剤の量を過度に多くして不経済的にならな
いように多糖類含有液体中の多糖の重量に対して１〜３
倍の範囲の重量を加えることが好ましい。カチオン性界
面活性剤を加えた後に多糖類を含む沈殿が生じるが、そ
の回収量を多くするためにしばらく、例えば、室温にて
１６時間程度熟成のために静置することが好ましい。そ
の後遠心分離等の分離操作により沈殿部分の多糖類が回
収できる。なお、このカチオン性界面活性剤を多糖類含
有溶液へ加える操作は、１回のみならず２回以上繰り返
し行ってもよく、繰り返すことで得られる多糖類の純度
が向上することが期待できる。

【００３０】このようなカチオン性界面活性剤を添加す
るのは、ウロン酸含有多糖を選択的に沈殿させることが
できるからであり、イオン交換樹脂などのような高価な
試薬を必要とせず経済的である上にスケ−ルアップが容
易で工業的製法として受け入れやすいものである。

【００３１】さらに、多糖類含有液体に水溶性溶媒、カ
チオン性界面活性剤を添加する操作は、一方のみならず
両者を実施することもでき、その順序についてはどちら
でもよい。このように両方の処理を併用することで得ら
れる多糖類の純度が向上することが期待できる。

【００３２】このようにして多糖類含有液体に水溶性溶
媒やカチオン性界面活性剤を添加すると、主に多糖類か
らなる沈殿が形成され、次にこの沈殿を分離する。分離
方法としては、この沈殿が回収できる方法であればよ
く、例えば、遠心分離、フィルター等によるろ過などに
より実施でき、これらの分離操作は１回又は２回以上繰
り返してもよい。この分離操作により沈殿に含まれてい
る水溶性溶媒やカチオン性界面活性剤をある程度取り除
くことができるが、さらに、スラリー状態となっている
沈殿をプレス処理などを行ってもよい。また、分離操作
の後に塩化カリウム水溶液や水などを加えて沈殿を分散
させ、その後に分離を行うこともできる。沈殿を分散さ
せる際には、撹拌したり、又はエチルアルコールなどの
水溶性溶媒を加えて分散速度を高めることもできる。こ
れらの分離操作により、精製された主に多糖類を含む沈
殿より残存する水溶性溶媒やカチオン性界面活性剤を除
くことができる。

【００３３】次いで沈殿を乾燥するが、その方法は公知
の方法を用いればよく、例えば適当な容器に沈殿を展開
し、通気乾燥を行うことが例示できる。

【００３４】さらにこのようにして得られる多糖類を乾
燥標品として種々の目的に用いる場合には、一旦水や揮
発性を有する溶媒に分散させてスラリー化し、スラリー
の全量あるいは一部を凍結乾燥することで乾燥標品を得
ることもできる。凍結乾燥の方法としては、公知の方法
を用いればよい。得られた乾燥標品は使用目的にもよる
が、砕いて細かくして種々の用途に用いることもでき
る。

【００３５】以上に記載したように、本発明の方法は、
従来の方法では多糖の有する粘性ゆえにその分離、精製
が困難であった微生物菌体とその生産する多糖類とを簡
便にかつ経済的に回収し、精製することができ、多糖の
回収量として従来の方法よりも１．５〜３倍程度向上で
きるという優れたものであり、広く応用が可能である。

【００３６】

【実施例】以下、本発明を実施例を用いて更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、各評価は以下に示した方法によって実施した。

【００３７】＜多糖標品の構成糖の分析＞１００ｍｇの
多糖標品をポッター型ホモジナイザーを用いて１０ｍｌ
の２Ｎ硫酸に溶解させ１．０重量％の溶液を調製し、蓋
付きのバイアル瓶に分注した。水流アスピレ−タ−を用
いてデシケ−タ−内で３０分減圧、窒素置換することに
より酸素を除去した。１００℃にて３時間加水分解を行
なった後、これに炭酸バリウムを適量加えて中和、ろ紙
でろ過した後ろ液にイオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ
ＩＲ−１２０（Ｈ⁺）を２００ｍｇ加え、ろ紙でろ過
した。なお中和が不十分である場合は２Ｎ水酸化ナトリ
ウムにて中和した。ろ液をロ−タリ−エバポレ−タ−
（東京理化製、型式：Ｎ−１−ＡＪ）にて、５０℃、３
０分間水を除去した後、真空ポンプで良く乾燥させた。
このようにして得た加水分解物４５５ｍｇを５ｍｌの水
に溶解し、室温にて水素化ホウ素ナトリウムを適当量加
え、３時間攪拌した。反応液にイオン交換樹脂Ａｍｂｅ
ｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ⁺）を泡が出なくなるま
で加えた後、ろ紙（東洋ろ紙、Ｎｏ．２）でろ過し、ろ
液をロ−タリ−エバポレ−タ−で減圧下留去して、メタ
ノ−ルにより２回共沸させた。得られた沈殿を真空ポン
プで乾燥し、無水ピリジンを３ｍｌ加え、攪拌しながら
無水酢酸３ｍｌを加えて１６時間反応させた。反応終了
後、水およびクロロホルムを加えて抽出した後、有機層
を水で２回洗浄した。これを無水硫酸マグネシウムで乾
燥後、ろ紙でろ過し、ＧＣ−ＭＳ（ヒューレット・パッ
カード社製、型式：Ｇ１８００Ａ、カラム：ＨＰ−５
０．２５ｍｍ（内径）×３０ｍ（長さ））にて分析し
た。

【００３８】グルクロン酸の定量はカルバゾ−ル硫酸法
によって行った。すなわち、まずカルバゾ−ル１２５ｍ
ｇをメタノ−ル１００ｍｌに溶解したカルバゾ−ル溶液
およびホウ酸ナトリウム（１０水和物）０．９５ｇを硫
酸１００ｍｌに溶解したホウ酸ナトリウム入り硫酸を調
製した。ホウ酸ナトリウム入り硫酸２．５ｍｌを試験管
にとり、氷水中で良く冷却した。これに予め氷水で冷却
しておいた試料もしくは標準品のグルクロン酸０．５ｍ
ｌを静かに加え、氷水中でゆっくりと攪拌し、発熱が収
まるのを待ってからボルテックスミキサ−で十分に攪拌
した。これを沸騰湯浴中で１０分間加熱してから氷冷
し、カルバゾ−ル溶液０．１ｍｌを加えて攪拌した。再
び沸騰湯浴に移して１５分間加熱してから氷冷し、５３
０ｎｍの吸収を測定した。コントロ−ルとしてカルバゾ
−ル溶液の代わりにメタノ−ルを用いて同様の操作を行
い、この吸光度を差し引いて実測値とした。この値と既
知濃度のグルクロン酸で作成した検量線とを比較して多
糖中のグルクロン酸を測定した。

【００３９】実施例１ ＜微生物の培養＞ メチロフィルス属細菌ＡＴＣＣ３１５０４株の培養は５
００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコ中、表１に示す組
成の培地１００ｍｌで２４時間３０℃で振盪培養した
後、８Ｌの同様の組成をもつ本培養培地に１／１００容
量植菌し、４２時間、３０℃で通気培養することによっ
て行った。

【００４０】

【表１】

【００４１】本培養においてはｐＨコントロ−ルを７．
０±０．１に設定し、メタノ−ル／アンモニア混合液
（モル比１５：１）がｐＨを設定値に保つ量だけフィ−
ドされるようにした。これにより微生物の成育に必要な
Ｃ源およびＮ源が適当量培養液に継続的に供給された。
培養終了後、８０００ｘＧ、２０℃、２０分間にて遠心
分離して微生物菌体を含む不溶性成分を除去した。

【００４２】実施例２ ＜酸・アルカリ処理−１＞ 実施例１で得た培養液４Ｌに等容量の水を加えてから５
０ｍｌの酢酸を加えてｐＨを約３．５に調整した。これ
を室温にて約３０分間撹拌した後、８０００ｘＧ、２０
℃、２０分間にて遠心分離（日立工機製高速冷却遠心
機、型式：ＣＲ２６Ｈ）を行い、濁りのある非沈殿画分
を得た。これに１２Ｎ塩酸を２８ｍｌを加えてｐＨを約
１にし、約３０分間撹拌した。その後５Ｎ水酸化ナトリ
ウムを３５０ｍｌ加えてｐＨを約１３にした。この操作
により液体はほぼ透明になった。これに１２Ｎ塩酸を４
０ｍｌを加えてｐＨを約８にしたところ、再び濁りが観
察された。この濁りを８０００ｘＧ、２０℃、２０分間
にて遠心分離して、その上清であるほぼ清澄な液体を得
た。

【００４３】実施例３ ＜アルコ−ル及びカチオン性界
面活性剤を用いた精製法＞ 実施例２で得た液体に対して１．４倍容のイソプロパノ
−ルを加えて沈殿を生成させ、その後室温で１６時間放
置することにより沈殿を熟成した。デカンテ−ションに
より約８割の液体を除き、沈殿を多く含む部分に対して
８０００ｘＧ、２０℃、２０分間にて遠心分離を行っ
た。パックされた沈殿を３Ｌの水に分散し、全体が一様
になるまで撹拌した後、６０ｇのＣＰＣ（塩化セチルピ
リジニウム）を加えて撹拌したところ、沈殿が生じた。
その後室温で一晩静置した後、デカンテ−ションで約９
割の液体を除き、沈殿を多く含む部分に対して遠心操作
を行った。パックされた沈殿を３ＬのＫＣｌ溶液に分散
して撹拌した。分散を助けるために６００ｍｌのエタノ
−ルを添加し、全体が一様になるまで撹拌した。これに
５．４Ｌのエタノ−ルを加えて多糖を沈殿させた。これ
を室温で一晩放置した後８０００ｘＧ、２０℃、２０分
間、遠心分離操作によって沈殿を回収した。このパック
された沈殿を凍結乾燥し、細かく砕いて標品とした。得
られた乾燥標品は１４．５ｇであった。この多糖標品を
上記記載の方法によりその構成するマンノ−ス、アロ−
ス、ガラクト−ス、グルコ−ス分析したところ、そのモ
ル比は１：０．８：６．２：１．１であった。また、標
品中のグルクロン酸量は上記記載の方法により測定し、
標品１ｇ中に０．１５ｇのグルクロン酸が含まれてい
た。

【００４４】実施例４ ＜酸・アルカリ処理−２＞ 実施例１で得た培養液６．８Ｌに等量の水を加えて１
３．６Ｌとしてから１２Ｎ塩酸５０ｍｌを徐々に添加し
てｐＨを約１に調整した。約３０分間撹拌を継続してか
ら５Ｎ水酸化ナトリウムを徐々に３２０ｍｌ加えてｐＨ
を約１３とした。この操作により液体はほとんど透明に
なった。約３０分間撹拌した後これに１２Ｎ塩酸６０ｍ
ｌを徐々に添加してｐＨを８．５とした。液体は再び濁
度を増したが粘性は処理前に比べて大きく低下してい
た。また、この処理によって生成したＮａＣｌは最終濃
度として約９０ｍＭであった。

【００４５】実施例５ ＜アルコ−ルを用いた精製法−
１＞ 実施例４で得られた液体に対し、イソプロパノ−ル沈殿
を２回繰り返して多糖類の精製を行った。すなわち、こ
の液体全量に対して１．２倍容のイソプロパノ−ルを加
えて多糖の沈殿を生成させ、室温で１６時間静置するこ
とによりこれを熟成させた。デカンテ−ションにより約
８割の液体を除き、沈殿を多く含む画分に対して８００
０ｘＧ、２０℃、２０分間にて遠心分離を行った。パッ
クされた沈殿を５Ｌの水に分散し、全体が一様になるま
で撹拌した後１．４倍容（７Ｌ）のイソプロパノ−ルを
加えた。２回目のイソプロパノ−ル沈殿は塩が除かれて
いるためウロン酸の静電的反発力から沈殿の容量が大き
くなる。この状態で室温にて１６時間静置した後ナイロ
ンメッシュでろ過することにより沈殿を集めた。この沈
殿には大量の溶媒（イソプロパノ−ルと水）が含まれて
おり、８０００ｘＧ、２０℃、２０分間にて遠心分離し
てある程度の溶媒を除いてから沈殿を平底容器に広げて
通風乾燥を１６時間行った。これに７５０ｍｌの水を加
えて分散し、多糖のスラリ−を得た。このスラリーの一
部を凍結乾燥することで乾燥重量が求められ、全体とし
て４６ｇの多糖標品を得た。

【００４６】実施例６ ＜酸・アルカリ処理−２＞ 実施例１で得た培養液７．３Ｌに等量の水を加えて１
４．６Ｌとしてから１２Ｎ塩酸７０ｍｌを徐々に添加し
てｐＨを約１に調整した。約３０分間撹拌を継続してか
ら５Ｎ水酸化ナトリウムを徐々に４００ｍｌ加えてｐＨ
を約１３とした。この操作により液体はほとんど透明に
なった。約３０分間撹拌した後これに１２Ｎ塩酸８０ｍ
ｌを徐々に添加してｐＨを８．５とした。液体は再び濁
度を増したが粘性は処理前に比べて大きく低下してい
た。また、この処理によって生成したＮａＣｌは最終濃
度として約１１０ｍＭであった。

【００４７】実施例７ ＜アルコ−ルを用いた精製法−
２＞ 実施例６で得られた液体に対してイソプロパノ−ル沈殿
を２回繰り返すことにより、多糖類の精製を行った。す
なわち、この液体全量に対して１．２倍容のイソプロパ
ノ−ルを加えて多糖の沈殿を生成させ、室温で１６時間
静置することによりこれを熟成させた。デカンテ−ショ
ンにより約８割の液体を除き、沈殿を多く含む部分に対
して８０００ｘＧ、２０℃、２０分間にて遠心分離し
た。パックされた沈殿を６Ｌの水に分散し、全体が一様
になるまで撹拌した後１．４倍容（８．４Ｌ）のイソプ
ロパノ−ルを加えた。２回目のイソプロパノ−ル沈殿は
塩が除かれているためウロン酸の静電的反発力から沈殿
の容量が大きくなる。この状態で室温２時間静置した後
ナイロンメッシュでろ過することにより沈殿を集めた。
この沈殿をプレスすることにより溶媒（イソプロパノ−
ルと水）の大部分を除いてから平底容器に広げて通風乾
燥を１６時間行った。これに８００ｍｌの水を加えて分
散し、多糖のスラリ−を得た。このスラリーの一部を凍
結乾燥することで乾燥重量が求められ、全体として４８
ｇの多糖標品を得た。

【００４８】

【発明の効果】本発明の方法によれば、微生物の培養に
より生産される粘度及び分散性の高い多糖類を微生物菌
体から簡便で収率良く回収でき、工業的に利用する上で
汎用性があるため有用である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】微生物の培養液に酸を加えてｐＨ３以下と
   した後に、アルカリを加えてｐＨ１２以上とし、さらに
   酸を加えてｐＨ５〜９とし、その後に菌体と多糖類含有
   液体とを分離することを特徴とする多糖類の精製方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の多糖類の精製方法におい
   て、分離された多糖類含有液体にさらに水溶性溶媒を添
   加し、及び／又はカチオン性界面活性剤を添加すること
   を含む多糖類の精製方法。
3. 【請求項３】多糖類含有液体に対して１〜２倍容量の水
   溶性溶媒を添加することを特徴とする請求項２に記載の
   多糖類の精製方法。
4. 【請求項４】多糖類含有液体中の多糖に対して重量比１
   〜３倍のカチオン性界面活性剤を添加することを特徴と
   する請求項２又は請求項３に記載の多糖類の精製方法。
5. 【請求項５】酸が酢酸、塩酸、トリクロロ酢酸及び硫酸
   からなる群より選ばれる１つであることを特徴とする請
   求項１〜４のいずれかに記載の多糖類の精製方法。
6. 【請求項６】アルカリが水酸化ナトリウム、水酸化カリ
   ウム及びアンモニアからなる群より選ばれる１つである
   ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の多糖
   類の精製方法。
7. 【請求項７】多糖類を構成する単糖として少なくともウ
   ロン酸を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれ
   かに記載の多糖類の精製方法。
8. 【請求項８】多糖類を構成する単糖のモル比がマンノ−
   ス１に対してアロ−ス、ガラクトース、グルコ−ス、グ
   ルクロン酸がそれぞれ０．８〜１．５、５．０〜１０．
   ０、１．０〜５．０、０．５〜２．０であることを特徴
   とする請求項１〜７のいずれかに記載の多糖類の精製方
   法。
9. 【請求項９】微生物がメタノール資化性細菌であること
   を特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の多糖類の
   精製方法。
10. 【請求項１０】微生物がメチロフィルス属細菌ＡＴＣＣ
    ３１５０４株であることを特徴とする請求項１〜９のい
    ずれかに記載の多糖類の精製方法。