JP2002176996A - 細菌細胞の表面に付着していないエキソポリサッカライドの産生 - Google Patents
細菌細胞の表面に付着していないエキソポリサッカライドの産生Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 エキソポリサッカライドの産生およびエキソ
ポリサッカライドを産生するための細菌を提供すること
に関し、さらに詳細には、細菌細胞の表面に付着してい
ないスライム状のエキソポリサッカライドを産生する細
菌を提供する。 【解決手段】 本発明は、スライム状のスフィンガンエ
キソポリサッカライドを提供するのに効果的な時間およ
び温度にて、スフィンゴモナス細菌を発酵ブロスで培養
することによりエキソポリサッカライドを製造するスフ
ィンゴモナス細菌および方法に関する。
ポリサッカライドを産生するための細菌を提供すること
に関し、さらに詳細には、細菌細胞の表面に付着してい
ないスライム状のエキソポリサッカライドを産生する細
菌を提供する。 【解決手段】 本発明は、スライム状のスフィンガンエ
キソポリサッカライドを提供するのに効果的な時間およ
び温度にて、スフィンゴモナス細菌を発酵ブロスで培養
することによりエキソポリサッカライドを製造するスフ
ィンゴモナス細菌および方法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エキソポリサッカ
ライドの産生およびエキソポリサッカライドを産生する
ための細菌に関する。さらに詳細には、本発明の細菌
は、細菌細胞の表面に付着していないスライム状のエキ
ソポリサッカライドを産生する。
ライドの産生およびエキソポリサッカライドを産生する
ための細菌に関する。さらに詳細には、本発明の細菌
は、細菌細胞の表面に付着していないスライム状のエキ
ソポリサッカライドを産生する。
【０００２】
【従来の技術】安価で且つ環境に許容できる増粘剤、生
体乳化剤および生分解性ポリマーの需要がかつてなく高
まっている。エキソポリサッカライドは、独特の流動学
的特性を有するため、これらの目的に有用な化合物の一
例である。たとえば、ジェラン（ｇｅｌｌａｎ）、ウェ
ラン（ｗｅｌａｎ）、およびラムザン（ｒｈａｍｓａ
ｎ）等のエキソポリサッカライドが、食品、化粧品、お
よび油田における用途、および他の用途向けに、工業用
に製造されている。各エキソポリサッカライドは、剪断
抵抗、様々なイオン性化合物との相溶性、および極端な
温度、ｐHおよび塩濃度に対する安定性を含む、異なる
特徴的な一連の水性流動学的特性を示す。
体乳化剤および生分解性ポリマーの需要がかつてなく高
まっている。エキソポリサッカライドは、独特の流動学
的特性を有するため、これらの目的に有用な化合物の一
例である。たとえば、ジェラン（ｇｅｌｌａｎ）、ウェ
ラン（ｗｅｌａｎ）、およびラムザン（ｒｈａｍｓａ
ｎ）等のエキソポリサッカライドが、食品、化粧品、お
よび油田における用途、および他の用途向けに、工業用
に製造されている。各エキソポリサッカライドは、剪断
抵抗、様々なイオン性化合物との相溶性、および極端な
温度、ｐHおよび塩濃度に対する安定性を含む、異なる
特徴的な一連の水性流動学的特性を示す。
【０００３】エキソポリサッカライドは、細菌発酵によ
り産生することができる。幾つかの例を挙げると、ジェ
ラン、ウェラン、ラムザン、Ｓ−８８、Ｓ−７、Ｓ−１
９８、ＮＷ１１、およびＳ−６５７を含むエキソポリサ
ッカライドを、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏ
ｎａｓ）属の異なる菌株が産生する（Ｐｏｌｌｏｃｋ１
９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：１
９３９−１９４５）。スフィンゴモナス細菌の他の菌株
によって、多くの他のエキソポリサッカライドを作るこ
とができる。スフィンゴモナス細菌により産生されるエ
キソポリサッカライドは、ソースとしての共通の属に関
連して、「スフィンガン（ｓｐｈｉｎｇａｎ）」と呼ば
れる。大規模液内発酵により、少なくとも３つのスフィ
ンガン（ジェラン、ウェラン、およびラムザン）が工業
用に製造される。
り産生することができる。幾つかの例を挙げると、ジェ
ラン、ウェラン、ラムザン、Ｓ−８８、Ｓ−７、Ｓ−１
９８、ＮＷ１１、およびＳ−６５７を含むエキソポリサ
ッカライドを、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏ
ｎａｓ）属の異なる菌株が産生する（Ｐｏｌｌｏｃｋ１
９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：１
９３９−１９４５）。スフィンゴモナス細菌の他の菌株
によって、多くの他のエキソポリサッカライドを作るこ
とができる。スフィンゴモナス細菌により産生されるエ
キソポリサッカライドは、ソースとしての共通の属に関
連して、「スフィンガン（ｓｐｈｉｎｇａｎ）」と呼ば
れる。大規模液内発酵により、少なくとも３つのスフィ
ンガン（ジェラン、ウェラン、およびラムザン）が工業
用に製造される。
【０００４】バイオテクノロジー業界は、工業的使用基
準に合った様々な細菌のエキソポリサッカライド生成物
の利用性を高めることにより、エキソポリサッカライド
化合物の需要に応えてきた。細菌性エキソポリサッカラ
イド生成物の多くは、合成により製造された物質にまさ
る広範囲の魅力的な改良点を提供するが、製造するのに
比較的費用がかかるままである。費用は、一般に所望の
生成物の回収費用および精製費用と関連がある。
準に合った様々な細菌のエキソポリサッカライド生成物
の利用性を高めることにより、エキソポリサッカライド
化合物の需要に応えてきた。細菌性エキソポリサッカラ
イド生成物の多くは、合成により製造された物質にまさ
る広範囲の魅力的な改良点を提供するが、製造するのに
比較的費用がかかるままである。費用は、一般に所望の
生成物の回収費用および精製費用と関連がある。
【０００５】細菌の菌株改良および変更、ならびに細菌
の生合成および発酵条件の最適化をよりよく理解した結
果として、エキソポリサッカライドのより高い発酵収量
が得られる。これにより、十分な量の工業的用途向けの
ポリマーを回収する場合における重要なステップの１つ
が満たされる。しかし、発酵工程でエキソポリサッカラ
イド濃度が上昇すると、酸素および栄養分を発酵ブロス
中に効果的に分散させるのにより高いエネルギー入力を
必要とする粘度の上昇を招く。従って、エキソポリサッ
カライド収量が高い発酵は、相応して生産コストが高く
なる。
の生合成および発酵条件の最適化をよりよく理解した結
果として、エキソポリサッカライドのより高い発酵収量
が得られる。これにより、十分な量の工業的用途向けの
ポリマーを回収する場合における重要なステップの１つ
が満たされる。しかし、発酵工程でエキソポリサッカラ
イド濃度が上昇すると、酸素および栄養分を発酵ブロス
中に効果的に分散させるのにより高いエネルギー入力を
必要とする粘度の上昇を招く。従って、エキソポリサッ
カライド収量が高い発酵は、相応して生産コストが高く
なる。
【０００６】エキソポリサッカライドの回収は、難しく
且つ高価なステップのままである。スフィンゴモナス属
由来の細菌株は、細胞表面に付着したままであるエキソ
ポリサッカライドを産生する（Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ
ａｌ．１９９９，Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｃｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：４３６−４１１）。
付着したポリマーは、細菌を囲むようにカップセルを形
成する。ポリサッカライドのカプセルは、細菌から容易
に分離されない。発酵ブロスを十分な水で希釈して粘度
を低下させた後でさえ、このカプセルは細菌細胞に付着
したままであり、遠心沈降分離で細胞をカプセルと分離
させることはできない。細胞をカプセルと分離させるに
は、他の物理的方法または化学的方法が必要である。細
胞への付着点付近のポリマー鎖をランダムに分断するこ
とにより、ポリサッカライドの大部分を細胞から放出さ
せるために、たとえば、酸によるポリサッカライドの部
分的加水分解を使用することができる。
且つ高価なステップのままである。スフィンゴモナス属
由来の細菌株は、細胞表面に付着したままであるエキソ
ポリサッカライドを産生する（Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ
ａｌ．１９９９，Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｃｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：４３６−４１１）。
付着したポリマーは、細菌を囲むようにカップセルを形
成する。ポリサッカライドのカプセルは、細菌から容易
に分離されない。発酵ブロスを十分な水で希釈して粘度
を低下させた後でさえ、このカプセルは細菌細胞に付着
したままであり、遠心沈降分離で細胞をカプセルと分離
させることはできない。細胞をカプセルと分離させるに
は、他の物理的方法または化学的方法が必要である。細
胞への付着点付近のポリマー鎖をランダムに分断するこ
とにより、ポリサッカライドの大部分を細胞から放出さ
せるために、たとえば、酸によるポリサッカライドの部
分的加水分解を使用することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】エキソポリサッカライ
ドの産生に使用される条件と関係なく、エキソポリサッ
カライドの回収は、一般に、沈澱ステップを含む。次い
で、沈澱したエキソポリサッカライドを遠心分離により
回収する。ジェランガムおよびウェランガムを回収する
一般的な方法は次の方法である。発酵後直ちに、培養ブ
ロスを少なくとも９０℃に加熱して、生存細菌を死滅さ
せる。次いで、約２倍量のイソプロピールアルコールで
沈澱させることにより、両ガムを培養ブロスから分離さ
せる。沈澱したポリサッカライド繊維を収集し、圧縮
し、乾燥して粉砕機にかける。蒸留によりアルコールを
回収する。この最も簡単な方法では、ポリサッカライド
は細胞に付着したままであるため、乾燥して粉砕機にか
けたポリサッカライドを水に再懸濁するとき、その溶液
は透明ではない。ジェランガムの場合、さらなるステッ
プを導入して細菌細胞からポリサッカライドを精製する
ことができるため、再懸濁した生成物はより透明であ
る。アルコール沈澱の前に、培養ブロスを遠心分離また
は濾過またはその両者を実施するが、その間、高粘性状
態と、容易に遠心分離または濾過できる液化状態との間
の臨界転移温度より高温に温度を維持する。これらの方
法は、米国特許第４，３２６，０５２号（ジェラン）、
第４，３２６，０５３号（ジェラン）、第４，３４２，
８６６号（ウェラン）、第３，９６０，８３２号（Ｓ−
７）、および第４，５３５，１５３号（Ｓ−８８）（こ
れらは、参照することにより本明細書に組み込まれるも
のとする）に開示されている。
ドの産生に使用される条件と関係なく、エキソポリサッ
カライドの回収は、一般に、沈澱ステップを含む。次い
で、沈澱したエキソポリサッカライドを遠心分離により
回収する。ジェランガムおよびウェランガムを回収する
一般的な方法は次の方法である。発酵後直ちに、培養ブ
ロスを少なくとも９０℃に加熱して、生存細菌を死滅さ
せる。次いで、約２倍量のイソプロピールアルコールで
沈澱させることにより、両ガムを培養ブロスから分離さ
せる。沈澱したポリサッカライド繊維を収集し、圧縮
し、乾燥して粉砕機にかける。蒸留によりアルコールを
回収する。この最も簡単な方法では、ポリサッカライド
は細胞に付着したままであるため、乾燥して粉砕機にか
けたポリサッカライドを水に再懸濁するとき、その溶液
は透明ではない。ジェランガムの場合、さらなるステッ
プを導入して細菌細胞からポリサッカライドを精製する
ことができるため、再懸濁した生成物はより透明であ
る。アルコール沈澱の前に、培養ブロスを遠心分離また
は濾過またはその両者を実施するが、その間、高粘性状
態と、容易に遠心分離または濾過できる液化状態との間
の臨界転移温度より高温に温度を維持する。これらの方
法は、米国特許第４，３２６，０５２号（ジェラン）、
第４，３２６，０５３号（ジェラン）、第４，３４２，
８６６号（ウェラン）、第３，９６０，８３２号（Ｓ−
７）、および第４，５３５，１５３号（Ｓ−８８）（こ
れらは、参照することにより本明細書に組み込まれるも
のとする）に開示されている。
【０００８】一般的な生成物回収プロトコールと関連し
た主要な非能率的な点は、エキソポリサッカライドの回
収が不完全な点である。細菌のエキソポリサッカライド
は、様々な程度の粘り強さで、産生細胞に付着してい
る。エキソポリサッカライドを比較的しっかり結び付け
た細菌は、エキソポリサッカライドを培地中に放出する
公算が低く、従って、沈澱ステップで回収に利用できる
エキソポリサッカライドの量が減少し、エキソポリサッ
カライドを産生細胞から分離するのに必要な工程ステッ
プが増加する。
た主要な非能率的な点は、エキソポリサッカライドの回
収が不完全な点である。細菌のエキソポリサッカライド
は、様々な程度の粘り強さで、産生細胞に付着してい
る。エキソポリサッカライドを比較的しっかり結び付け
た細菌は、エキソポリサッカライドを培地中に放出する
公算が低く、従って、沈澱ステップで回収に利用できる
エキソポリサッカライドの量が減少し、エキソポリサッ
カライドを産生細胞から分離するのに必要な工程ステッ
プが増加する。
【０００９】本発明の利点、特色および特徴は、以下の
説明および上述の特許請求の範囲について熟考すると、
より明白になるであろう。
説明および上述の特許請求の範囲について熟考すると、
より明白になるであろう。
【００１０】
【課題を解決するための手段】発明の概要 本発明はスフィンガンエキソポリサッカライドの製造方
法およびスフィンガンエキソポリサッカライドを産生す
るスフィンゴモナス細菌に関する。本発明は、スフィン
ガンエキソポリサッカライドがの表面に付着していない
スライム状のスフィンガンエキソポリサッカライドが産
生される方法を提供する。スライム状のスフィンガンエ
キソポリサッカライドが産生されると、カプセル状のエ
キソポリサッカライドが細菌細胞に付着したままである
発酵と比較して少ないエネルギーですむ。さらに、スラ
イム状で産生されるスフィンガンエキソポリサッカライ
ドの分離および回収は、カプセル状で産生されるスフィ
ンガンエキソポリサッカライドの回収と比較して、能率
的である。
法およびスフィンガンエキソポリサッカライドを産生す
るスフィンゴモナス細菌に関する。本発明は、スフィン
ガンエキソポリサッカライドがの表面に付着していない
スライム状のスフィンガンエキソポリサッカライドが産
生される方法を提供する。スライム状のスフィンガンエ
キソポリサッカライドが産生されると、カプセル状のエ
キソポリサッカライドが細菌細胞に付着したままである
発酵と比較して少ないエネルギーですむ。さらに、スラ
イム状で産生されるスフィンガンエキソポリサッカライ
ドの分離および回収は、カプセル状で産生されるスフィ
ンガンエキソポリサッカライドの回収と比較して、能率
的である。
【００１１】１つの態様において、本発明は、スライム
状のスフィンガンエキソポリサッカライドを提供するの
に効果的な時間および温度で、スフィンゴモナス細菌を
発酵ブロス中で培養することを含む、スフィンガンエキ
ソポリサッカライドを製造する方法を提供する。本発明
の重要な態様において、スライム状のスフィンガンエキ
ソポリサッカライドを産生するように遺伝学的に突然変
異させたスフィンゴモナス細菌を液内発酵で使用する。
遺伝学的に突然変異したスフィンゴモナス細菌の例とし
ては、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８７（菌株Ｘ２８７）、
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８６（菌株Ｘ５３０）、ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ−３４８５（菌株Ｚ４７３）、ＡＴＣＣ Ｐ
ＴＡ−３４８８（菌株Ｘ０３１）およびそれらの混合物
が挙げられる。
状のスフィンガンエキソポリサッカライドを提供するの
に効果的な時間および温度で、スフィンゴモナス細菌を
発酵ブロス中で培養することを含む、スフィンガンエキ
ソポリサッカライドを製造する方法を提供する。本発明
の重要な態様において、スライム状のスフィンガンエキ
ソポリサッカライドを産生するように遺伝学的に突然変
異させたスフィンゴモナス細菌を液内発酵で使用する。
遺伝学的に突然変異したスフィンゴモナス細菌の例とし
ては、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８７（菌株Ｘ２８７）、
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８６（菌株Ｘ５３０）、ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ−３４８５（菌株Ｚ４７３）、ＡＴＣＣ Ｐ
ＴＡ−３４８８（菌株Ｘ０３１）およびそれらの混合物
が挙げられる。
【００１２】本発明の遺伝学的に突然変異したスフィン
ゴモナス細菌を発酵することにより、スライム状のエキ
ソポリサッカライドを含む発酵ブロスが得られる。発酵
ブロスの粘度は、産生されるスフィンガンエキソポリサ
ッカライドの量に左右され、次には発酵中にエキソポリ
サッカライドに転換される糖の量に左右される。発酵開
始時の糖濃度または糖のエキソポリサッカライドへの転
換効率のいずれかが上昇すると、ブロスの粘度は相応じ
て上昇する。たとえば、スフィンゴモナス菌株Ｘ２８７
を、約２５〜約３５℃にて約４８〜９６時間発酵する
と、スライム状でジェランガムが産生される。結果とし
て得られる発酵ブロスは約１５，０００〜約３０，００
０ｃｐ、好ましくは約１５，０００〜約２０，０００ｃ
ｐの粘度、および総バイオマスとして約２０〜約２５ｇ
／Ｌを有する。一般に、このバイオマスの半分から４分
の３は、エキソポリサッカライドそのものである。
ゴモナス細菌を発酵することにより、スライム状のエキ
ソポリサッカライドを含む発酵ブロスが得られる。発酵
ブロスの粘度は、産生されるスフィンガンエキソポリサ
ッカライドの量に左右され、次には発酵中にエキソポリ
サッカライドに転換される糖の量に左右される。発酵開
始時の糖濃度または糖のエキソポリサッカライドへの転
換効率のいずれかが上昇すると、ブロスの粘度は相応じ
て上昇する。たとえば、スフィンゴモナス菌株Ｘ２８７
を、約２５〜約３５℃にて約４８〜９６時間発酵する
と、スライム状でジェランガムが産生される。結果とし
て得られる発酵ブロスは約１５，０００〜約３０，００
０ｃｐ、好ましくは約１５，０００〜約２０，０００ｃ
ｐの粘度、および総バイオマスとして約２０〜約２５ｇ
／Ｌを有する。一般に、このバイオマスの半分から４分
の３は、エキソポリサッカライドそのものである。
【００１３】本発明のこの態様において、本発明の遺伝
学的に突然変異したスフィンゴモナス細菌の発酵により
生じる発酵ブロスは、約２０，０００ｃｐｓ未満の粘度
を有し、対応する親菌株の発酵により生じる発酵ブロス
は、約４０，０００ｃｐより高い粘度を有する。スライ
ム状のエキソポリサッカライドにより実現される低い粘
度によって、混合および通気がより能率的になり、エネ
ルギー消費が低くなる。
学的に突然変異したスフィンゴモナス細菌の発酵により
生じる発酵ブロスは、約２０，０００ｃｐｓ未満の粘度
を有し、対応する親菌株の発酵により生じる発酵ブロス
は、約４０，０００ｃｐより高い粘度を有する。スライ
ム状のエキソポリサッカライドにより実現される低い粘
度によって、混合および通気がより能率的になり、エネ
ルギー消費が低くなる。
【００１４】発酵中の混合、通気およびエネルギー消費
は、発酵容器の大きさおよび形状、発酵容器回転翼のタ
イプ、大きさおよび質、ならびに培養粘度によって左右
される。たとえば、同じ発酵装置および運転条件を用い
て、野生型親菌株を定常期（スフィンゴモナス細菌の場
合、６００ｎｍにて約１５を超える吸光度を示す）まで
増殖させることができる。容器内の酸素センサーで測定
するとき、定常期には、発酵ブロスには検出可能な酸素
がない。対比すると、本発明の遺伝学的に突然変異させ
て定常期まで増殖させた細菌の発酵ブロスは、水の飽和
状態の少なくとも約５％という溶存酸素レベルを有す
る。さらに、本発明の遺伝学的に突然変異した細菌を用
いた発酵の全期間にわたって、酸素をポジティブなレベ
ルに維持すると、エキソポリサッカライドの産生率が高
くなる。
は、発酵容器の大きさおよび形状、発酵容器回転翼のタ
イプ、大きさおよび質、ならびに培養粘度によって左右
される。たとえば、同じ発酵装置および運転条件を用い
て、野生型親菌株を定常期（スフィンゴモナス細菌の場
合、６００ｎｍにて約１５を超える吸光度を示す）まで
増殖させることができる。容器内の酸素センサーで測定
するとき、定常期には、発酵ブロスには検出可能な酸素
がない。対比すると、本発明の遺伝学的に突然変異させ
て定常期まで増殖させた細菌の発酵ブロスは、水の飽和
状態の少なくとも約５％という溶存酸素レベルを有す
る。さらに、本発明の遺伝学的に突然変異した細菌を用
いた発酵の全期間にわたって、酸素をポジティブなレベ
ルに維持すると、エキソポリサッカライドの産生率が高
くなる。
【００１５】低粘性スライム状のエキソポリサッカライ
ドを産生する利点のもう１つの例は、外来性の酸または
塩基を加えることにより、容器内のｐＨを調節できるこ
とである。親菌株を用いた発酵の場合のように、粘度が
約２０，０００ｃｐを超えるとき、酸または塩基を急速
に混合して均質な溶液を作ることは不可能である。代わ
りに、酸または塩基の高濃度領域が生じる。濃酸または
濃塩基は、それぞれ、ポリサッカライドを加水分解する
か、ポリサッカライドからアシル基を切断することがで
きる。発酵の全期間にわたってｐＨを能率的にコントロ
ールすることにより、生産性を高めることもできる。
ドを産生する利点のもう１つの例は、外来性の酸または
塩基を加えることにより、容器内のｐＨを調節できるこ
とである。親菌株を用いた発酵の場合のように、粘度が
約２０，０００ｃｐを超えるとき、酸または塩基を急速
に混合して均質な溶液を作ることは不可能である。代わ
りに、酸または塩基の高濃度領域が生じる。濃酸または
濃塩基は、それぞれ、ポリサッカライドを加水分解する
か、ポリサッカライドからアシル基を切断することがで
きる。発酵の全期間にわたってｐＨを能率的にコントロ
ールすることにより、生産性を高めることもできる。
【００１６】重要な態様において、本発明は、スフィン
ガンエキソポリサッカライドがカプセル状で産生される
発酵ブロスと比較して、改良されたスフィンガンエキソ
ポリサッカライドの下流部門回収および処理を招来する
のに有効である。本発明のこの態様において、スフィン
ガンエキソポリサッカライドは一般にアルコール沈澱に
より回収される。アルコール沈澱に必要な量を、発酵ブ
ロスの体積の約２倍量から、約１〜１．５倍量に減少さ
せることが可能である。さらに、有効な沈澱温度を約９
０℃から約２５℃〜約５０℃に下げることが可能であ
る。
ガンエキソポリサッカライドがカプセル状で産生される
発酵ブロスと比較して、改良されたスフィンガンエキソ
ポリサッカライドの下流部門回収および処理を招来する
のに有効である。本発明のこの態様において、スフィン
ガンエキソポリサッカライドは一般にアルコール沈澱に
より回収される。アルコール沈澱に必要な量を、発酵ブ
ロスの体積の約２倍量から、約１〜１．５倍量に減少さ
せることが可能である。さらに、有効な沈澱温度を約９
０℃から約２５℃〜約５０℃に下げることが可能であ
る。
【００１７】発酵後且つアルコール沈澱前に、さらなる
処理ステップによって、エキソポリサッカライドを含む
発酵ブロスを処理することが可能である。たとえば、細
菌細胞を死滅させるために、ブロス温度を、８０℃より
高温に少なくとも１５分間、上昇させてもよい。加熱し
たブロスにアルカリを加えて約９以上のｐＨを実現する
ことにより、ポリサッカライドからアシル基を除去する
ことが可能である。ジェランガムの特例において、これ
らの２つのステップは、濾過または遠心沈降分離のいず
れか、または２法の併用等の物理的方法によって、細菌
細胞をポリサッカライドから分離できるほど十分に、発
酵ブロスの粘度を低下させる。しかし、ジェランガムが
カプセル状で産生されるとき、発酵ブロスが８０℃より
高温に維持されている間に分離ステップを遂行しなけれ
ばならない。８０℃より低温では、培養ブロス中のジェ
ランガムは、培地中の二価陽イオンによって架橋された
ジェラン鎖を有する堅いゲルに凝固する。ジェランガム
がゲルを形成すると、ジェランを沈澱で回収することが
できなくなり、ゲル化した物質を廃棄しなければならな
い。対照すると、エキソポリサッカライドがスライム状
であるとき、粘度は低下しており、ゲル形成を防止する
のに必要な温度は低い。本発明のこの態様において、細
胞分離ステップ中の温度を約６０℃まで低下させること
ができる。
処理ステップによって、エキソポリサッカライドを含む
発酵ブロスを処理することが可能である。たとえば、細
菌細胞を死滅させるために、ブロス温度を、８０℃より
高温に少なくとも１５分間、上昇させてもよい。加熱し
たブロスにアルカリを加えて約９以上のｐＨを実現する
ことにより、ポリサッカライドからアシル基を除去する
ことが可能である。ジェランガムの特例において、これ
らの２つのステップは、濾過または遠心沈降分離のいず
れか、または２法の併用等の物理的方法によって、細菌
細胞をポリサッカライドから分離できるほど十分に、発
酵ブロスの粘度を低下させる。しかし、ジェランガムが
カプセル状で産生されるとき、発酵ブロスが８０℃より
高温に維持されている間に分離ステップを遂行しなけれ
ばならない。８０℃より低温では、培養ブロス中のジェ
ランガムは、培地中の二価陽イオンによって架橋された
ジェラン鎖を有する堅いゲルに凝固する。ジェランガム
がゲルを形成すると、ジェランを沈澱で回収することが
できなくなり、ゲル化した物質を廃棄しなければならな
い。対照すると、エキソポリサッカライドがスライム状
であるとき、粘度は低下しており、ゲル形成を防止する
のに必要な温度は低い。本発明のこの態様において、細
胞分離ステップ中の温度を約６０℃まで低下させること
ができる。
【００１８】本発明のこの態様に従えば、本方法は、ブ
ロス１リットル当たり約１０〜約２０ｇのエキソポリサ
ッカライドを生成することができる。純度は、一般に少
なくとも約８０％を超える。
ロス１リットル当たり約１０〜約２０ｇのエキソポリサ
ッカライドを生成することができる。純度は、一般に少
なくとも約８０％を超える。
【００１９】詳細な説明定義 別に規定がなければ、本明細書で使用する全ての専門用
語および科学用語は、本発明が属する技術分野における
普通の熟練者より一般的に理解されるものと同じ意味を
有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９
４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ａｎｄＳｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）は、本発明
で使用される用語の多くの汎用辞書を熟練者に提供して
いる。本明細書に関連した全ての特許および出版物は、
参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明の
ために、以下に、下記の用語を定義する。
語および科学用語は、本発明が属する技術分野における
普通の熟練者より一般的に理解されるものと同じ意味を
有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９
４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ａｎｄＳｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）は、本発明
で使用される用語の多くの汎用辞書を熟練者に提供して
いる。本明細書に関連した全ての特許および出版物は、
参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明の
ために、以下に、下記の用語を定義する。
【００２０】本明細書で使用する用語「スフィンガン」
および「スフィンガンエキソポリサッカライド」は、ス
フィンゴモナス属のメンバーにより分泌される、関連が
あるがそれぞれ異なるエキソポリサッカライド群を指す
（Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ １３９：１９３９−１９４５，１９９３）。スフ
ィンガンの構造は、全て多少関連がある。各スフィンガ
ンの主鎖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−
マンノースおよびＬ−ラムノースの４糖の関連した配列
からなる。スフィンガン群のポリサッカライドメンバー
は、ポリマー主鎖および側鎖を含む炭水化物によって互
いに区別できる。スフィンガンポリサッカライドは、炭
水化物側鎖、および炭水化物のポリマー主鎖に結合した
アセチル基およびピルビル基を含んでもよい。Ｍｉｋｏ
ｌａｊｃｚａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．ａｎｄ Ｅ
ｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０：４０２，（１９９
４）参照。ジェラン、ウェラン、ラムザン、Ｓ−８８、
Ｓ−７、ＮＷ−１１、Ｓ−１９８およびＳ−６５７は、
スフィンガン群のエキソポリサッカライドの例である。
および「スフィンガンエキソポリサッカライド」は、ス
フィンゴモナス属のメンバーにより分泌される、関連が
あるがそれぞれ異なるエキソポリサッカライド群を指す
（Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ １３９：１９３９−１９４５，１９９３）。スフ
ィンガンの構造は、全て多少関連がある。各スフィンガ
ンの主鎖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−
マンノースおよびＬ−ラムノースの４糖の関連した配列
からなる。スフィンガン群のポリサッカライドメンバー
は、ポリマー主鎖および側鎖を含む炭水化物によって互
いに区別できる。スフィンガンポリサッカライドは、炭
水化物側鎖、および炭水化物のポリマー主鎖に結合した
アセチル基およびピルビル基を含んでもよい。Ｍｉｋｏ
ｌａｊｃｚａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．ａｎｄ Ｅ
ｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０：４０２，（１９９
４）参照。ジェラン、ウェラン、ラムザン、Ｓ−８８、
Ｓ−７、ＮＷ−１１、Ｓ−１９８およびＳ−６５７は、
スフィンガン群のエキソポリサッカライドの例である。
【００２１】一般に、スフィンガンエキソポリサッカラ
イドファミリーのメンバーは、次の一般的な反復化学構
造
イドファミリーのメンバーは、次の一般的な反復化学構
造
【化４】 （式中、Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルク
ロン酸または２−デオキシ−グルクロン酸であり、Ｒｈ
ａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘ
はＲｈａであってもＭａｎであってもよく、ＺはＧｌｃ
残基２に結合しており、且つα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−
４）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎまたはα−Ｌ−
Ｒｈａであってもよく、ＷはＧｌｃ残基１に結合してお
り、且つβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−６）−α−Ｄ−Ｇｌ
ｃ、β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−６）−β−Ｄ−Ｇｌｃまた
はα−Ｌ−Ｒｈａであってもよく、下付き文字ｖおよび
ｙは、０、０．３３、０．５、０．６７または１であっ
てもよく、ポリマーの「還元末端」は、主鎖のＸ残基の
方に向いている）で表すことができる。本明細書で使用
する用語「主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅまたはｍａｉｎ ｃ
ｈａｉｎ）」は、鎖Ｗおよび鎖Ｚを除く構造の部分を指
す、すなわち、ｖおよびｙが０に等しいときである。
ロン酸または２−デオキシ−グルクロン酸であり、Ｒｈ
ａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘ
はＲｈａであってもＭａｎであってもよく、ＺはＧｌｃ
残基２に結合しており、且つα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−
４）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎまたはα−Ｌ−
Ｒｈａであってもよく、ＷはＧｌｃ残基１に結合してお
り、且つβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−６）−α−Ｄ−Ｇｌ
ｃ、β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−６）−β−Ｄ−Ｇｌｃまた
はα−Ｌ−Ｒｈａであってもよく、下付き文字ｖおよび
ｙは、０、０．３３、０．５、０．６７または１であっ
てもよく、ポリマーの「還元末端」は、主鎖のＸ残基の
方に向いている）で表すことができる。本明細書で使用
する用語「主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅまたはｍａｉｎ ｃ
ｈａｉｎ）」は、鎖Ｗおよび鎖Ｚを除く構造の部分を指
す、すなわち、ｖおよびｙが０に等しいときである。
【００２２】スフィンガンポリサッカライドファミリー
の幾つかのメンバーは、様々な位置でアセチル化されて
いる。しかし、ポリサッカライドを従来の方法で化学的
脱アシル化してアシル基を除去することが可能である。
たとえば、ジェランは、ウェランと同じ炭水化物主鎖を
有する（すなわち、Ｘ＝Ｒｈａ）が、側鎖糖が欠如して
おり（すなわち、Ｖ＝０且つｙ＝０）且つグルコース残
基１はグリセレートで完全に置換されている。ジェラン
サブユニット構造は、やはりグルコース残基１にて部分
的にアセチル化されている。本明細書で使用する「脱ア
シル化」は、グリセリル基およびアセチル基が欠如して
いることを意味する。
の幾つかのメンバーは、様々な位置でアセチル化されて
いる。しかし、ポリサッカライドを従来の方法で化学的
脱アシル化してアシル基を除去することが可能である。
たとえば、ジェランは、ウェランと同じ炭水化物主鎖を
有する（すなわち、Ｘ＝Ｒｈａ）が、側鎖糖が欠如して
おり（すなわち、Ｖ＝０且つｙ＝０）且つグルコース残
基１はグリセレートで完全に置換されている。ジェラン
サブユニット構造は、やはりグルコース残基１にて部分
的にアセチル化されている。本明細書で使用する「脱ア
シル化」は、グリセリル基およびアセチル基が欠如して
いることを意味する。
【００２３】上記の通り、スフィンガンエキソポリサッ
カライドの一例はジェランガムである。「ジェランガ
ム」は、炭水化物反復構造−［（Ｌ）ラムノース−
（Ｄ）グルコース−（Ｄ）グルクロン酸−（ｄ）グルコ
ース］−を有し、グリセリル基およびアセチル基が、ラ
ムノースの還元側に隣接したグルコース残基に結合した
ポリサッカライドを意味する。標準方法では、オリゴサ
ッカライドの還元末端を右に配置する。ジェランガム
は、平均して、反復単位当たり約１個のグリセリル基お
よび反復単位２個当たり約１個のアセチル基を有する。
カライドの一例はジェランガムである。「ジェランガ
ム」は、炭水化物反復構造−［（Ｌ）ラムノース−
（Ｄ）グルコース−（Ｄ）グルクロン酸−（ｄ）グルコ
ース］−を有し、グリセリル基およびアセチル基が、ラ
ムノースの還元側に隣接したグルコース残基に結合した
ポリサッカライドを意味する。標準方法では、オリゴサ
ッカライドの還元末端を右に配置する。ジェランガム
は、平均して、反復単位当たり約１個のグリセリル基お
よび反復単位２個当たり約１個のアセチル基を有する。
【００２４】本明細書にさらに説明する通り、スフィン
ゴモナスの親菌株はスフィンガンエキソポリサッカライ
ドをカプセル状で産生する。本明細書で使用する「カプ
セル」は、産生細菌細胞の表面に付着し、水性希釈後で
も付着したままであり、且つ付着した細胞から沈降分離
または遠心分離で分離することができない、ポリサッカ
ライドを意味する。
ゴモナスの親菌株はスフィンガンエキソポリサッカライ
ドをカプセル状で産生する。本明細書で使用する「カプ
セル」は、産生細菌細胞の表面に付着し、水性希釈後で
も付着したままであり、且つ付着した細胞から沈降分離
または遠心分離で分離することができない、ポリサッカ
ライドを意味する。
【００２５】本明細書で使用する用語「スフィンゴモナ
ス」は、上述のような、エキソポリサッカライドすなわ
ちスフィンガンを産生するスフィンゴモナス属由来のグ
ラム陰性菌の菌株を指す。１９９３年、グラム陰性菌の
スフィンガン産生ファミリーが、スフィンゴモナス属に
属するとして最初に同定された（Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１３９，１９３９（１９９
３）参照）。
ス」は、上述のような、エキソポリサッカライドすなわ
ちスフィンガンを産生するスフィンゴモナス属由来のグ
ラム陰性菌の菌株を指す。１９９３年、グラム陰性菌の
スフィンガン産生ファミリーが、スフィンゴモナス属に
属するとして最初に同定された（Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１３９，１９３９（１９９
３）参照）。
【００２６】本発明で有用なスフィンゴモナス細菌とし
ては、遺伝学的に突然変異するか突然変異誘発を受け
た、親菌株由来のスフィンゴモナス細菌などがある。
ては、遺伝学的に突然変異するか突然変異誘発を受け
た、親菌株由来のスフィンゴモナス細菌などがある。
【００２７】本明細書で使用する「親菌株」は、親菌株
の遺伝的内容または表現型を修飾することを意図する、
突然変異誘発等の処理前の細菌菌株または個々の細菌を
意味する。これは、親菌株と、親菌株または親細菌から
得られる突然変異した、または遺伝学的に修飾された誘
導菌株とを明らかに区別することを意味する。
の遺伝的内容または表現型を修飾することを意図する、
突然変異誘発等の処理前の細菌菌株または個々の細菌を
意味する。これは、親菌株と、親菌株または親細菌から
得られる突然変異した、または遺伝学的に修飾された誘
導菌株とを明らかに区別することを意味する。
【００２８】本明細書で使用する「遺伝学的に突然変異
した」は、自然に突然変異し、または突然変異が誘導さ
れたものの何れかであり、突然変異した細菌または細菌
菌株と親菌株とを区別する特性を示すという特質を意味
する。
した」は、自然に突然変異し、または突然変異が誘導さ
れたものの何れかであり、突然変異した細菌または細菌
菌株と親菌株とを区別する特性を示すという特質を意味
する。
【００２９】本明細書で使用する「突然変異誘発」は、
化学薬品、電磁放射、生物学的作用物質、たとえばウイ
ルス、プラスミド、挿入エレメントまたはトランスポゾ
ン等を含むが、それらに限定されない、ＤＮＡにおける
遺伝子の突然変異形成を誘導することがよく知られてい
る作用物質で細菌細胞を処理することを意味する。
化学薬品、電磁放射、生物学的作用物質、たとえばウイ
ルス、プラスミド、挿入エレメントまたはトランスポゾ
ン等を含むが、それらに限定されない、ＤＮＡにおける
遺伝子の突然変異形成を誘導することがよく知られてい
る作用物質で細菌細胞を処理することを意味する。
【００３０】本発明のスフィンゴモナス細菌は、スライ
ム状のエキソポリサッカライドを産生する。本明細書で
使用する「スライム」は、産生細菌細胞に付着しておら
ず、且つ発酵ブロスの、またはブロスの水性希釈後の、
沈降分離または遠心分離によって、且つ熱処理、または
ブロスの他の物理的処理または化学的処理なしで、細胞
から実質的に分離することができるポリサッカライドを
意味する。光学顕微鏡で観察することによって、スライ
ム状のエキソポリサッカライドを産生する細菌と、カプ
セルのポリサッカライドを産生する細菌とを区別するこ
とができる。カプセルで包まれたスフィンゴモナス細菌
は、細胞の表面に付着したポリサッカライド鎖によって
結合された多細胞凝集体を形成し、細菌細胞を凝集体状
に結合させるカプセルを全くもたない一様に分散された
スライムを形成する細菌細胞と対照的である。
ム状のエキソポリサッカライドを産生する。本明細書で
使用する「スライム」は、産生細菌細胞に付着しておら
ず、且つ発酵ブロスの、またはブロスの水性希釈後の、
沈降分離または遠心分離によって、且つ熱処理、または
ブロスの他の物理的処理または化学的処理なしで、細胞
から実質的に分離することができるポリサッカライドを
意味する。光学顕微鏡で観察することによって、スライ
ム状のエキソポリサッカライドを産生する細菌と、カプ
セルのポリサッカライドを産生する細菌とを区別するこ
とができる。カプセルで包まれたスフィンゴモナス細菌
は、細胞の表面に付着したポリサッカライド鎖によって
結合された多細胞凝集体を形成し、細菌細胞を凝集体状
に結合させるカプセルを全くもたない一様に分散された
スライムを形成する細菌細胞と対照的である。
【００３１】本明細書で使用する用語「生合成」は、生
物学的産生すなわちスフィンゴモナス細菌によるスフィ
ンガンの合成を表す。スフィンガンエキソポリサッカラ
イドは、細菌の多数の酵素によって調節される一連のス
テップで、個々の炭水化物単位から合成される。
物学的産生すなわちスフィンゴモナス細菌によるスフィ
ンガンの合成を表す。スフィンガンエキソポリサッカラ
イドは、細菌の多数の酵素によって調節される一連のス
テップで、個々の炭水化物単位から合成される。
【００３２】用語「バイオマス」は、細菌培養中の、エ
キソポリサッカライドと細菌細胞を加えたものを指す。
キソポリサッカライドと細菌細胞を加えたものを指す。
【００３３】菌株開発 本発明は、スライム状のスフィンガンエキソポリサッカ
ライドを合成して分泌するように遺伝学的に突然変異さ
せたスフィンゴモナス細菌を使用する。本発明のこの態
様において、スフィンガンエキソポリサッカライドをカ
プセル状で産生する親スフィンゴモナス菌株を、遺伝学
的に突然変異したスフィンゴモナス細菌を提供するため
の手順に供した。使用した親菌株の例の中には、Ｓ６０
（ＡＴＣＣ ３１４６１）、Ｓ１３０（ＡＴＣＣ ３１
５５５）、Ｓ８８（ＡＴＣＣ ３１５５４）およびＳ７
（ＡＴＣＣ ５３１５９）が含まれていた。本発明で有
用な、遺伝学的に突然変異したスフィンゴモナス細菌の
例としては、スライム状のジェランガムを産生するＡＴ
ＣＣ ＰＴＡ−３４８７（菌株Ｘ２８７）、スライム状
のウェランガムを産生するＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８６
（菌株Ｘ５３０）、スライム状のエキソポリサッカライ
ドＳ−８８を産生するＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８５（菌
株Ｚ４７３）、スライム状のエキソポリサッカライドＳ
−７を産生するＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８８（菌株Ｘ０
３１）などがある。
ライドを合成して分泌するように遺伝学的に突然変異さ
せたスフィンゴモナス細菌を使用する。本発明のこの態
様において、スフィンガンエキソポリサッカライドをカ
プセル状で産生する親スフィンゴモナス菌株を、遺伝学
的に突然変異したスフィンゴモナス細菌を提供するため
の手順に供した。使用した親菌株の例の中には、Ｓ６０
（ＡＴＣＣ ３１４６１）、Ｓ１３０（ＡＴＣＣ ３１
５５５）、Ｓ８８（ＡＴＣＣ ３１５５４）およびＳ７
（ＡＴＣＣ ５３１５９）が含まれていた。本発明で有
用な、遺伝学的に突然変異したスフィンゴモナス細菌の
例としては、スライム状のジェランガムを産生するＡＴ
ＣＣ ＰＴＡ−３４８７（菌株Ｘ２８７）、スライム状
のウェランガムを産生するＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８６
（菌株Ｘ５３０）、スライム状のエキソポリサッカライ
ドＳ−８８を産生するＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８５（菌
株Ｚ４７３）、スライム状のエキソポリサッカライドＳ
−７を産生するＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８８（菌株Ｘ０
３１）などがある。
【００３４】発酵 本発明のもう１つの態様は、スフィンガンエキソポリサ
ッカライドの増強された産生である。スフィンガンエキ
ソポリサッカライドを産生させるためには、当技術分野
で周知であり且つ米国特許第５，８５４，０３４号（参
照することにより本明細書に組み込まれるものとする）
に一般的に記載されている適当な発酵条件で、遺伝学的
に突然変異したスフィンゴモナス細菌を培養する。要約
すると、遺伝学的に突然変異したスフィンゴモナス細菌
を培養するのに適した培地は、たとえば、グルコース、
ラクトース、スクロース、マルトースまたはマルトデキ
ストリンを含む炭水化物等の炭素源、たとえば、無機ア
ンモニウム、無機硝酸塩、有機アミノ酸またはタンパク
質物質、たとえば、加水分解した酵母、大豆粉またはカ
ゼイン酒造業者の可溶性物質またはコーンスティープリ
カー等の窒素源、無機塩類およびビタミン類を含む。多
種多様な発酵培地が、本発明によるスフィンガンの産生
を支える。
ッカライドの増強された産生である。スフィンガンエキ
ソポリサッカライドを産生させるためには、当技術分野
で周知であり且つ米国特許第５，８５４，０３４号（参
照することにより本明細書に組み込まれるものとする）
に一般的に記載されている適当な発酵条件で、遺伝学的
に突然変異したスフィンゴモナス細菌を培養する。要約
すると、遺伝学的に突然変異したスフィンゴモナス細菌
を培養するのに適した培地は、たとえば、グルコース、
ラクトース、スクロース、マルトースまたはマルトデキ
ストリンを含む炭水化物等の炭素源、たとえば、無機ア
ンモニウム、無機硝酸塩、有機アミノ酸またはタンパク
質物質、たとえば、加水分解した酵母、大豆粉またはカ
ゼイン酒造業者の可溶性物質またはコーンスティープリ
カー等の窒素源、無機塩類およびビタミン類を含む。多
種多様な発酵培地が、本発明によるスフィンガンの産生
を支える。
【００３５】炭水化物は様々な量で発酵ブロス中に含ま
れるが、通常は発酵培地の１〜５重量％である。この炭
水化物は、発酵前に、あるいは、発酵中に、一度に全部
加えてもよい。窒素の量は、水性培地の約０．０１〜
０．２重量％の範囲であってもよい。１つの炭素源また
は窒素源を使用してもよく、これらのソースの混合物を
使用してもよい。
れるが、通常は発酵培地の１〜５重量％である。この炭
水化物は、発酵前に、あるいは、発酵中に、一度に全部
加えてもよい。窒素の量は、水性培地の約０．０１〜
０．２重量％の範囲であってもよい。１つの炭素源また
は窒素源を使用してもよく、これらのソースの混合物を
使用してもよい。
【００３６】無機塩類の中で、スフィンゴモナス細菌の
発酵に使用されるものは、ナトリウム、カリウム、アン
モニウム、硝酸塩、カルシム、リン酸塩、硫酸塩、塩化
物、炭酸塩および類似のイオン類を含む塩類である。マ
グネシウム、マンガン、コバルト、鉄、亜鉛、銅、モリ
ブデン、ヨウ化物およびホウ酸塩等の微量金属も都合よ
く含まれる。ビオチン、葉酸、リポエート、ニコチンア
ミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チ
アミンおよびビタミンＢ12などのビタミン類およびそれ
らの混合物も都合よく使用することができる。
発酵に使用されるものは、ナトリウム、カリウム、アン
モニウム、硝酸塩、カルシム、リン酸塩、硫酸塩、塩化
物、炭酸塩および類似のイオン類を含む塩類である。マ
グネシウム、マンガン、コバルト、鉄、亜鉛、銅、モリ
ブデン、ヨウ化物およびホウ酸塩等の微量金属も都合よ
く含まれる。ビオチン、葉酸、リポエート、ニコチンア
ミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チ
アミンおよびビタミンＢ12などのビタミン類およびそれ
らの混合物も都合よく使用することができる。
【００３７】約２５℃〜３５℃の温度で発酵を実施する
が、約２８℃〜３２度の温度範囲内で最適生産性が得ら
れる。接種材料は、振盪フラスコ培養および小規模液内
攪拌培養を含む、標準増量法によって調製する。接種材
料調製用の培地は、生産培地と同じであってもよく、Ｌ
ｕｒｉａブロスまたはＹＭ培地等の、当技術分野で周知
の幾つかの標準培地の１つであってもよい。シード培地
中の炭水化物濃度は、約１重量％未満まで下げることが
できる。２つ以上のシード期を使用して、接種に望まし
い量を得ることが可能である。一般的な接種量は、最終
的な総発酵体積の約０．５％〜約１０％の範囲である。
が、約２８℃〜３２度の温度範囲内で最適生産性が得ら
れる。接種材料は、振盪フラスコ培養および小規模液内
攪拌培養を含む、標準増量法によって調製する。接種材
料調製用の培地は、生産培地と同じであってもよく、Ｌ
ｕｒｉａブロスまたはＹＭ培地等の、当技術分野で周知
の幾つかの標準培地の１つであってもよい。シード培地
中の炭水化物濃度は、約１重量％未満まで下げることが
できる。２つ以上のシード期を使用して、接種に望まし
い量を得ることが可能である。一般的な接種量は、最終
的な総発酵体積の約０．５％〜約１０％の範囲である。
【００３８】発酵容器は、一般に、内容を攪拌するため
の攪拌器を含む。この容器は、自動ｐＨ制御装置および
泡沫制御装置も具有してもよい。生産培地を容器に加
え、原位置で加熱滅菌する。あるいは、炭水化物または
炭素源を別個に滅菌してから加える。予め成長させたシ
ード培養を、冷却した（一般に、約２８℃〜３２℃の発
酵温度の）培地に加え、攪拌した培地を約４８〜約９６
時間発酵させて、約１５，０００〜約２０，０００ｃｐ
の粘度および約１０〜１５ｇ／Ｌのスライム状スフィン
ガンエキソポリサッカライドを有するブロスを生じさせ
る。対応する親スフィンゴモナス細菌の発酵によって、
一般に、約２５，０００〜約５０，０００ｃｐの粘度を
有するブロスが生じる。
の攪拌器を含む。この容器は、自動ｐＨ制御装置および
泡沫制御装置も具有してもよい。生産培地を容器に加
え、原位置で加熱滅菌する。あるいは、炭水化物または
炭素源を別個に滅菌してから加える。予め成長させたシ
ード培養を、冷却した（一般に、約２８℃〜３２℃の発
酵温度の）培地に加え、攪拌した培地を約４８〜約９６
時間発酵させて、約１５，０００〜約２０，０００ｃｐ
の粘度および約１０〜１５ｇ／Ｌのスライム状スフィン
ガンエキソポリサッカライドを有するブロスを生じさせ
る。対応する親スフィンゴモナス細菌の発酵によって、
一般に、約２５，０００〜約５０，０００ｃｐの粘度を
有するブロスが生じる。
【００３９】この態様において、本発明は、液内攪拌通
気培養で増殖させたスフィンゴモナス細菌から得られる
スライム状エキソポリサッカライドを提供する。２４時
間の培養後、液体培地中の溶存酸素濃度は、水の飽和状
態の約５％を超える。親菌株を用いた同様の発酵では、
２４時間後の溶存酸素は０％であった。スライム状のエ
キソポリサッカライドにより低粘度が実現し、その結果
として通気が改良され、スフィンゴモナス細菌はより長
期間にわたって培地中で生産力を有することが可能であ
る。
気培養で増殖させたスフィンゴモナス細菌から得られる
スライム状エキソポリサッカライドを提供する。２４時
間の培養後、液体培地中の溶存酸素濃度は、水の飽和状
態の約５％を超える。親菌株を用いた同様の発酵では、
２４時間後の溶存酸素は０％であった。スライム状のエ
キソポリサッカライドにより低粘度が実現し、その結果
として通気が改良され、スフィンゴモナス細菌はより長
期間にわたって培地中で生産力を有することが可能であ
る。
【００４０】本発明のもう１つの態様において、１つの
発酵からの細菌を液内発酵用接種材料として使用する半
回分式で発酵を実施することが可能である。この態様に
おいて、スフィンゴモナス細菌が産生したエキソポリサ
ッカライドから分離されたスフィンゴモナス細菌を新鮮
な発酵ブロスに加えてもよく、新鮮な発酵ブロスを残っ
たスフィンゴモナス細菌に加えてもよい。従って、本発
明のこの態様により、別個のシード培養を提供する必要
がなくなる。
発酵からの細菌を液内発酵用接種材料として使用する半
回分式で発酵を実施することが可能である。この態様に
おいて、スフィンゴモナス細菌が産生したエキソポリサ
ッカライドから分離されたスフィンゴモナス細菌を新鮮
な発酵ブロスに加えてもよく、新鮮な発酵ブロスを残っ
たスフィンゴモナス細菌に加えてもよい。従って、本発
明のこの態様により、別個のシード培養を提供する必要
がなくなる。
【００４１】発酵ブロスの処理 幾つかのアプローチを使用して、エキソポリサッカライ
ドを回収するために発酵ブロスをさらに処理することが
可能である。たとえば、エキソポリサッカライドを発酵
ブロスから直接沈澱させてもよく、発酵ブロスを先ず清
澄にし、次いで沈澱させてもよく、発酵ブロスを脱アシ
ル化した後沈澱させてもよく、あるいは発酵ブロスを脱
アシル化した後清澄にし、沈澱させてもよい。
ドを回収するために発酵ブロスをさらに処理することが
可能である。たとえば、エキソポリサッカライドを発酵
ブロスから直接沈澱させてもよく、発酵ブロスを先ず清
澄にし、次いで沈澱させてもよく、発酵ブロスを脱アシ
ル化した後沈澱させてもよく、あるいは発酵ブロスを脱
アシル化した後清澄にし、沈澱させてもよい。
【００４２】本発明の１つの態様において、少なくとも
約１％ｗ／ｖ量のエキソポリサッカライドおよび約２
５，０００ｃｐ以下の粘度を有する発酵ブロスを、エキ
ソポリサッカライド回収のためにさらに処理する。本発
明のこの態様において、約２５℃〜約５０℃の温度の発
酵ブロスに、約１〜約１．５倍量のアルコールを直接加
える。あるいは、米国特許第４，３２６，０５２号（参
照することにより本明細書に組み込まれるものとする）
に記載の通り、発酵ブロスを先ず脱アシル化し、次いで
清澄にしてからアルコールを加えてもよい。エキソポリ
サッカライドの沈澱に有効なアルコールとしては、エタ
ノール、イソプロピルアルコール、プロパノール、ブタ
ノールおよびそれらの混合物などがある。沈澱は、使用
する混合装置のタイプに応じて、回分式であってもよ
く、半回分式または連続式であってもよい。混合が高粘
度によって妨害される場合、水で希釈してからアルコー
ルを加える。
約１％ｗ／ｖ量のエキソポリサッカライドおよび約２
５，０００ｃｐ以下の粘度を有する発酵ブロスを、エキ
ソポリサッカライド回収のためにさらに処理する。本発
明のこの態様において、約２５℃〜約５０℃の温度の発
酵ブロスに、約１〜約１．５倍量のアルコールを直接加
える。あるいは、米国特許第４，３２６，０５２号（参
照することにより本明細書に組み込まれるものとする）
に記載の通り、発酵ブロスを先ず脱アシル化し、次いで
清澄にしてからアルコールを加えてもよい。エキソポリ
サッカライドの沈澱に有効なアルコールとしては、エタ
ノール、イソプロピルアルコール、プロパノール、ブタ
ノールおよびそれらの混合物などがある。沈澱は、使用
する混合装置のタイプに応じて、回分式であってもよ
く、半回分式または連続式であってもよい。混合が高粘
度によって妨害される場合、水で希釈してからアルコー
ルを加える。
【００４３】発酵後、沈降分離または濾過で、エキソポ
リサッカライドを細胞片から分離する。沈降分離は遠心
分離によって行ってもよい。本発明のこの態様におい
て、沈澱後、均質なエキソポリサッカライド粉末を与え
るために、回収、圧縮、乾燥および粉砕のための、当技
術分野で周知の幾つかの方法のいずれを使用してもよ
い。
リサッカライドを細胞片から分離する。沈降分離は遠心
分離によって行ってもよい。本発明のこの態様におい
て、沈澱後、均質なエキソポリサッカライド粉末を与え
るために、回収、圧縮、乾燥および粉砕のための、当技
術分野で周知の幾つかの方法のいずれを使用してもよ
い。
【００４４】本発明のこの態様によれば、この方法で約
１〜約２％（ｗ／ｖ、初めのブロス体積を基準にして）
のエキソポリサッカライドが生じる。純度は、一般に、
少なくとも８０％を超える。
１〜約２％（ｗ／ｖ、初めのブロス体積を基準にして）
のエキソポリサッカライドが生じる。純度は、一般に、
少なくとも８０％を超える。
【００４５】以下の実施例で本発明を実施するための方
法を説明するが、添付のクレームで規定される本発明の
範囲を、例を挙げて説明するものであって、制限するも
のではないと理解すべきである。
法を説明するが、添付のクレームで規定される本発明の
範囲を、例を挙げて説明するものであって、制限するも
のではないと理解すべきである。
【００４６】
【発明の実施の形態】実施例実施例Ｉ 通気攪拌液内発酵により、野生型菌株ＡＴＣＣ３１４６
１に由来するスフィンゴモナス突然変異体菌株Ｘ２８
７、およびＡＴＣＣ３１４６１親菌株から、ジェランガ
ムが産生された。突然変異誘発および好ましい特性の選
択という再現性のある多段方式で、菌株Ｘ２８７を得
た。
１に由来するスフィンゴモナス突然変異体菌株Ｘ２８
７、およびＡＴＣＣ３１４６１親菌株から、ジェランガ
ムが産生された。突然変異誘発および好ましい特性の選
択という再現性のある多段方式で、菌株Ｘ２８７を得
た。
【００４７】増殖培地は（脱イオン水１リットル当た
り）、硝酸アンモニウム１ｇ、可溶性大豆タンパク質水
解物（ＭａｒｃｏｒのＳｏｙ Ｐｅｐｔｏｎｅ）０．５
ｇ、リン酸水素カリウム３．２ｇ、リン酸二水素カリウ
ム１．６ｇ、硫酸マグネシウム（七水化物）０．１ｇ、
微量ミネラル類およびグルコースを含んでいた。微量ミ
ネラルは（最終培地１リットル当たり）、ＦｅＣｌ3−
６Ｈ2Ｏ ２．７ｍｇ、ＺｎＣｌ2 １．３６ｍｇ、Ｍｎ
Ｃｌ2−４Ｈ2Ｏ １．９８ｍｇ、ＣｏＣｌ2−６Ｈ 2Ｏ
２４０μｇ、Ｎａ2ＭｏＯ4−２Ｈ2Ｏ ２４０μｇ、お
よびＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ ２５０μｇを含んでいた。最
終的な発酵培地は、リットル当たり２５ｇのグルコース
を含み、前培養培地はリットル当たり１０ｇのグルコー
スを含んでいた。
り）、硝酸アンモニウム１ｇ、可溶性大豆タンパク質水
解物（ＭａｒｃｏｒのＳｏｙ Ｐｅｐｔｏｎｅ）０．５
ｇ、リン酸水素カリウム３．２ｇ、リン酸二水素カリウ
ム１．６ｇ、硫酸マグネシウム（七水化物）０．１ｇ、
微量ミネラル類およびグルコースを含んでいた。微量ミ
ネラルは（最終培地１リットル当たり）、ＦｅＣｌ3−
６Ｈ2Ｏ ２．７ｍｇ、ＺｎＣｌ2 １．３６ｍｇ、Ｍｎ
Ｃｌ2−４Ｈ2Ｏ １．９８ｍｇ、ＣｏＣｌ2−６Ｈ 2Ｏ
２４０μｇ、Ｎａ2ＭｏＯ4−２Ｈ2Ｏ ２４０μｇ、お
よびＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ ２５０μｇを含んでいた。最
終的な発酵培地は、リットル当たり２５ｇのグルコース
を含み、前培養培地はリットル当たり１０ｇのグルコー
スを含んでいた。
【００４８】１バイアルの凍結細胞を解凍し、バッフル
付フラスコ内の前培養５００ｍｌに加え、回転シェーカ
ー上で３０℃にて約１６〜２０時間、または６００ｎｍ
における吸光度で測定した細胞密度が約３〜５になるま
でインキュベートした。凍結細胞は、同じ培地を含む寒
天プレート上で増殖させた細菌菌株のコロニー１個を接
種しておいた、事前前培養フラスコから採取したサンプ
ルであった。
付フラスコ内の前培養５００ｍｌに加え、回転シェーカ
ー上で３０℃にて約１６〜２０時間、または６００ｎｍ
における吸光度で測定した細胞密度が約３〜５になるま
でインキュベートした。凍結細胞は、同じ培地を含む寒
天プレート上で増殖させた細菌菌株のコロニー１個を接
種しておいた、事前前培養フラスコから採取したサンプ
ルであった。
【００４９】約５〜１０容量％の接種を行うために、か
なりの量の前培養を発酵槽に加えた。発酵槽は、Ｎｅｗ
ＢｒｕｎｓｗｉｃｋモデルＩＩＩまたはモデル３００
０のいずれかであり、培地４リットルが入っていた。こ
の発酵槽に、発酵培地の体積と同量の空気を通気し、３
０℃に維持した。最小限、飽和状態の３０％に設定した
溶存酸素の量で、攪拌速度を調節した。発酵中に攪拌速
度が最大速度１０００ｒｐｍに達し、この後、溶存酸素
レベルは０〜３０％に低下した。
なりの量の前培養を発酵槽に加えた。発酵槽は、Ｎｅｗ
ＢｒｕｎｓｗｉｃｋモデルＩＩＩまたはモデル３００
０のいずれかであり、培地４リットルが入っていた。こ
の発酵槽に、発酵培地の体積と同量の空気を通気し、３
０℃に維持した。最小限、飽和状態の３０％に設定した
溶存酸素の量で、攪拌速度を調節した。発酵中に攪拌速
度が最大速度１０００ｒｐｍに達し、この後、溶存酸素
レベルは０〜３０％に低下した。
【００５０】下表に、親菌株ＡＴＣＣ３１４６１および
スライム形成性突然変異体菌株Ｘ２８７を用いた液内発
酵の結果を示す。ポリサッカライドが細胞に付着してい
ないＸ２８７突然変異体培養では、粘度が低下した結果
として、混合および通気が十分になり、消費エネルギー
が低くなる。
スライム形成性突然変異体菌株Ｘ２８７を用いた液内発
酵の結果を示す。ポリサッカライドが細胞に付着してい
ないＸ２８７突然変異体培養では、粘度が低下した結果
として、混合および通気が十分になり、消費エネルギー
が低くなる。
【００５１】
【表１】
【００５２】野生型菌株ＡＴＣＣ３１４６により産生さ
れたジェランガムを沈澱させるためには、アルコール沈
澱による生成物回収中に、２倍量のイソプロピルアルコ
ールが必要である。対照的に、菌株Ｘ２８７によりスラ
イム状で産生されるジェランガムは、同体積量のイソプ
ロピルアルコールのみで、ブロスから沈澱する。さら
に、スライム状のジェランガムは、２５〜３０℃にてイ
ソプロピルアルコールで沈澱するが、野生型ジェラン
は、アルコールを加える前に加熱ステップを必要とす
る。
れたジェランガムを沈澱させるためには、アルコール沈
澱による生成物回収中に、２倍量のイソプロピルアルコ
ールが必要である。対照的に、菌株Ｘ２８７によりスラ
イム状で産生されるジェランガムは、同体積量のイソプ
ロピルアルコールのみで、ブロスから沈澱する。さら
に、スライム状のジェランガムは、２５〜３０℃にてイ
ソプロピルアルコールで沈澱するが、野生型ジェラン
は、アルコールを加える前に加熱ステップを必要とす
る。
【００５３】実施例ＩＩ 野生型親菌株ＡＴＣＣ３１５５５に適用した、突然変異
の誘発または天然に生じる突然変異および好ましい特性
の選択で構成される多段方式によって得られた、菌株Ｘ
５３０およびＸ３１９を代表とする、幾つかの突然変異
体菌株のいずれからも、スライム状ウェランガムが産生
された。
の誘発または天然に生じる突然変異および好ましい特性
の選択で構成される多段方式によって得られた、菌株Ｘ
５３０およびＸ３１９を代表とする、幾つかの突然変異
体菌株のいずれからも、スライム状ウェランガムが産生
された。
【００５４】細菌菌株Ｘ５３０を、振盪フラスコ内の
（実施例Iに記載の）液体培地で増殖させた。菌株Ｘ５
３０は、細胞に付着していない、スライム状の、ウェラ
ンガムを合成した。培養の様相を光学顕微鏡で観察し
た。親野生型菌株は、各細胞に付着したカプセルのポリ
サッカライドによって結合された多細胞凝集体を形成し
たが、菌株Ｘ５３０の細胞は凝集体を形成せず、単細胞
として、培地全体に、自由に一様に分布することができ
た。以下の測定を行い、下表にまとめた。培養粘度（Ｂ
ｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＬＶＴＤＶ−ＩＩ粘度計用スピン
ドル＃４で１２ｒｐｍにおけるセンチポアズ）、細胞密
度（６００ｎｍにおける吸光度）、および２５℃にて２
倍量のイソプロピルアルコールで培養ブロスから直接沈
澱させたバイオマスの重量（ポリサッカライドと細胞を
加えたもの）（ｇ／ｌ）。
（実施例Iに記載の）液体培地で増殖させた。菌株Ｘ５
３０は、細胞に付着していない、スライム状の、ウェラ
ンガムを合成した。培養の様相を光学顕微鏡で観察し
た。親野生型菌株は、各細胞に付着したカプセルのポリ
サッカライドによって結合された多細胞凝集体を形成し
たが、菌株Ｘ５３０の細胞は凝集体を形成せず、単細胞
として、培地全体に、自由に一様に分布することができ
た。以下の測定を行い、下表にまとめた。培養粘度（Ｂ
ｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＬＶＴＤＶ−ＩＩ粘度計用スピン
ドル＃４で１２ｒｐｍにおけるセンチポアズ）、細胞密
度（６００ｎｍにおける吸光度）、および２５℃にて２
倍量のイソプロピルアルコールで培養ブロスから直接沈
澱させたバイオマスの重量（ポリサッカライドと細胞を
加えたもの）（ｇ／ｌ）。
【００５５】
【表２】
【００５６】さらに、９０℃にて沈澱を実施し、アルコ
ール−ブロス混合物中で沈澱したポリサッカライドの様
相を記録した。２倍量のイソプロピルアルコールを菌株
Ｘ５３０の培養に加えると、２５℃または９０℃のいず
れでも粘着性の凝塊を形成したが、それにひきかえ、野
生型親菌株では、沈澱したポリサッカライドは２５℃に
て分散した断片化凝塊を形成し、９０℃にて粘着性凝塊
を形成した。
ール−ブロス混合物中で沈澱したポリサッカライドの様
相を記録した。２倍量のイソプロピルアルコールを菌株
Ｘ５３０の培養に加えると、２５℃または９０℃のいず
れでも粘着性の凝塊を形成したが、それにひきかえ、野
生型親菌株では、沈澱したポリサッカライドは２５℃に
て分散した断片化凝塊を形成し、９０℃にて粘着性凝塊
を形成した。
【００５７】実施例ＩＩＩ 野生型親菌株ＡＴＣＣ３１５５４に適用した、突然変異
誘発または自然突然変異および好ましい特性の選択で構
成される多段方式によって得られた、菌株Ｘ０９９およ
びＺ４７３を代表とする、幾つかの突然変異体菌株のい
ずれからも、ポリサッカライドＳ−８８がスライム状で
産生された。
誘発または自然突然変異および好ましい特性の選択で構
成される多段方式によって得られた、菌株Ｘ０９９およ
びＺ４７３を代表とする、幾つかの突然変異体菌株のい
ずれからも、ポリサッカライドＳ−８８がスライム状で
産生された。
【００５８】増殖培地は（水１リットル当たり）、硝酸
アンモニウム１ｇ、可溶性大豆タンパク質水解物（Ｍａ
ｒｃｏｒのＳｏｙ Ｐｅｐｔｏｎｅ）０．５ｇ、リン酸
水素カリウム３．２ｇ、リン酸二水素カリウム１．６
ｇ、硫酸マグネシウム（七水化物）０．２ｇ、微量ミネ
ラル類およびグルコースを含んでいた。微量ミネラルは
（最終培地１リットル当たり）、ＦｅＣｌ3−６Ｈ2Ｏ
２．７ｍｇ、ＺｎＣｌ2１．３６ｍｇ、ＭｎＣｌ2−４Ｈ
2Ｏ １．９８ｍｇ、ＣｏＣｌ2−６Ｈ2Ｏ ２４０μ
ｇ、Ｎａ2ＭｏＯ4−２Ｈ2Ｏ ２４０μｇ、およびＣｕ
ＳＯ4−５Ｈ2Ｏ２５０μｇを含んでいた。最終的な発酵
培地は、リットル当たり３０ｇのグルコースを含み、前
培養培地はリットル当たり２０ｇのグルコースを含んで
いた。
アンモニウム１ｇ、可溶性大豆タンパク質水解物（Ｍａ
ｒｃｏｒのＳｏｙ Ｐｅｐｔｏｎｅ）０．５ｇ、リン酸
水素カリウム３．２ｇ、リン酸二水素カリウム１．６
ｇ、硫酸マグネシウム（七水化物）０．２ｇ、微量ミネ
ラル類およびグルコースを含んでいた。微量ミネラルは
（最終培地１リットル当たり）、ＦｅＣｌ3−６Ｈ2Ｏ
２．７ｍｇ、ＺｎＣｌ2１．３６ｍｇ、ＭｎＣｌ2−４Ｈ
2Ｏ １．９８ｍｇ、ＣｏＣｌ2−６Ｈ2Ｏ ２４０μ
ｇ、Ｎａ2ＭｏＯ4−２Ｈ2Ｏ ２４０μｇ、およびＣｕ
ＳＯ4−５Ｈ2Ｏ２５０μｇを含んでいた。最終的な発酵
培地は、リットル当たり３０ｇのグルコースを含み、前
培養培地はリットル当たり２０ｇのグルコースを含んで
いた。
【００５９】１バイアルの凍結細胞を解凍し、バッフル
付フラスコ内の前培養５００ｍｌに加え、回転シェーカ
ー上で３０℃にて約１６〜２０時間、または６００ｎｍ
における吸光度で測定した細胞密度が約３〜５になるま
でインキュベートした。凍結細胞は、同じ培地を含む寒
天プレート上で増殖させた細菌菌株のコロニー１個を接
種しておいた、事前前培養フラスコから採取したサンプ
ルであった。
付フラスコ内の前培養５００ｍｌに加え、回転シェーカ
ー上で３０℃にて約１６〜２０時間、または６００ｎｍ
における吸光度で測定した細胞密度が約３〜５になるま
でインキュベートした。凍結細胞は、同じ培地を含む寒
天プレート上で増殖させた細菌菌株のコロニー１個を接
種しておいた、事前前培養フラスコから採取したサンプ
ルであった。
【００６０】約５〜１０容量％の接種を行うために、か
なりの量の前培養を発酵槽に加えた。発酵槽は、Ｎｅｗ
ＢｒｕｎｓｗｉｃｋモデルＩＩＩであり、培地４リッ
トルが入っていた。この発酵槽に、発酵培地の体積と同
量の空気を通気し、３０℃に維持した。最小限、飽和状
態の３０％に設定した溶存酸素の量で、攪拌速度を調節
した。発酵中に攪拌速度が最大速度１０００ｒｐｍに達
し、この後、溶存酸素レベルは０〜３０％に低下した。
なりの量の前培養を発酵槽に加えた。発酵槽は、Ｎｅｗ
ＢｒｕｎｓｗｉｃｋモデルＩＩＩであり、培地４リッ
トルが入っていた。この発酵槽に、発酵培地の体積と同
量の空気を通気し、３０℃に維持した。最小限、飽和状
態の３０％に設定した溶存酸素の量で、攪拌速度を調節
した。発酵中に攪拌速度が最大速度１０００ｒｐｍに達
し、この後、溶存酸素レベルは０〜３０％に低下した。
【００６１】下表に、親菌株ＡＴＣＣ３１５５４および
スライム形成性突然変異体菌株Ｘ０９９およびＺ４７３
を用いた液内発酵の結果を示す。ポリサッカライドが細
胞に付着していないＸ０９９およびＺ４７３の突然変異
体培養では、ブロスの粘度上昇およびＩＰＡ沈澱物の重
量増加によってわかる通り、生産性が上昇する。培養ブ
ロスの体積と同量（１倍量）のイソプロピルアルコール
のみでポリサッカライドが沈澱したのに対して、野生型
親菌株ＡＴＣＣ３１５５４では２倍量であった。低速遠
心分離（約５０００×Ｇ）により、菌株Ｘ０９９および
Ｚ４７３の細胞をポリサッカライドから除去することが
できるが、ＡＴＣＣ３１５５４野生型親菌株ではできな
かった。
スライム形成性突然変異体菌株Ｘ０９９およびＺ４７３
を用いた液内発酵の結果を示す。ポリサッカライドが細
胞に付着していないＸ０９９およびＺ４７３の突然変異
体培養では、ブロスの粘度上昇およびＩＰＡ沈澱物の重
量増加によってわかる通り、生産性が上昇する。培養ブ
ロスの体積と同量（１倍量）のイソプロピルアルコール
のみでポリサッカライドが沈澱したのに対して、野生型
親菌株ＡＴＣＣ３１５５４では２倍量であった。低速遠
心分離（約５０００×Ｇ）により、菌株Ｘ０９９および
Ｚ４７３の細胞をポリサッカライドから除去することが
できるが、ＡＴＣＣ３１５５４野生型親菌株ではできな
かった。
【００６２】
【表３】
【００６３】実施例ＩＶ 発酵により培養したとき、ポリサッカライドＳ−７は、
突然変異体菌株Ｘ０３１からスライム状で産生され、Ａ
ＴＣＣ２１４２３によりカプセル状で産生された。菌株
Ｘ０３１は、ＡＴＣＣ２１４２３菌株に由来する自然突
然変異体である。増殖培地は（水１リットル当たり）、
硝酸アンモニウム１ｇ、可溶性大豆タンパク質水解物
（ＭａｒｃｏｒのＳｏｙ Ｐｅｐｔｏｎｅ）０．５ｇ、
リン酸水素カリウム３．２ｇ、リン酸二水素カリウム
１．６ｇ、硫酸マグネシウム（七水化物）０．２ｇ、微
量ミネラル類およびグルコースを含んでいた。微量ミネ
ラルは（最終培地１リットル当たり）、ＦｅＣｌ3−６
Ｈ2Ｏ ２．７ｍｇ、ＺｎＣｌ2１．３６ｍｇ、ＭｎＣｌ
2−４Ｈ2Ｏ １．９８ｍｇ、ＣｏＣｌ2−６Ｈ2Ｏ ２４
０μｇ、Ｎａ2ＭｏＯ4−２Ｈ2Ｏ ２４０μｇ、および
ＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ２５０μｇを含んでいた。最終的な
発酵培地は、リットル当たり３０ｇのグルコースを含
み、前培養培地はリットル当たり２０ｇのグルコースを
含んでいた。
突然変異体菌株Ｘ０３１からスライム状で産生され、Ａ
ＴＣＣ２１４２３によりカプセル状で産生された。菌株
Ｘ０３１は、ＡＴＣＣ２１４２３菌株に由来する自然突
然変異体である。増殖培地は（水１リットル当たり）、
硝酸アンモニウム１ｇ、可溶性大豆タンパク質水解物
（ＭａｒｃｏｒのＳｏｙ Ｐｅｐｔｏｎｅ）０．５ｇ、
リン酸水素カリウム３．２ｇ、リン酸二水素カリウム
１．６ｇ、硫酸マグネシウム（七水化物）０．２ｇ、微
量ミネラル類およびグルコースを含んでいた。微量ミネ
ラルは（最終培地１リットル当たり）、ＦｅＣｌ3−６
Ｈ2Ｏ ２．７ｍｇ、ＺｎＣｌ2１．３６ｍｇ、ＭｎＣｌ
2−４Ｈ2Ｏ １．９８ｍｇ、ＣｏＣｌ2−６Ｈ2Ｏ ２４
０μｇ、Ｎａ2ＭｏＯ4−２Ｈ2Ｏ ２４０μｇ、および
ＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ２５０μｇを含んでいた。最終的な
発酵培地は、リットル当たり３０ｇのグルコースを含
み、前培養培地はリットル当たり２０ｇのグルコースを
含んでいた。
【００６４】１バイアルの凍結細胞を解凍し、バッフル
付フラスコ内の前培養５００ｍｌに加え、回転シェーカ
ー上で３０℃にて約１６〜２０時間、または６００ｎｍ
における吸光度で測定した細胞密度が約３〜５になるま
でインキュベートした。凍結細胞は、同じ培地を含む寒
天プレート上で増殖させた細菌菌株のコロニー１個を接
種しておいた、事前前培養フラスコから採取したサンプ
ルであった。
付フラスコ内の前培養５００ｍｌに加え、回転シェーカ
ー上で３０℃にて約１６〜２０時間、または６００ｎｍ
における吸光度で測定した細胞密度が約３〜５になるま
でインキュベートした。凍結細胞は、同じ培地を含む寒
天プレート上で増殖させた細菌菌株のコロニー１個を接
種しておいた、事前前培養フラスコから採取したサンプ
ルであった。
【００６５】約５〜１０容量％の接種を行うために、か
なりの量の前培養を発酵槽に加えた。発酵槽は、Ｎｅｗ
ＢｒｕｎｓｗｉｃｋモデルＩＩＩであり、培地４リッ
トルが入っていた。この発酵槽に、発酵培地の体積と同
量の空気を通気し、３０℃に維持した。最小限、飽和状
態の３０％に設定した溶存酸素の量で、攪拌速度を調節
した。発酵中に攪拌速度が最大速度１０００ｒｐｍに達
し、この後、溶存酸素レベルは０〜３０％に低下した。
なりの量の前培養を発酵槽に加えた。発酵槽は、Ｎｅｗ
ＢｒｕｎｓｗｉｃｋモデルＩＩＩであり、培地４リッ
トルが入っていた。この発酵槽に、発酵培地の体積と同
量の空気を通気し、３０℃に維持した。最小限、飽和状
態の３０％に設定した溶存酸素の量で、攪拌速度を調節
した。発酵中に攪拌速度が最大速度１０００ｒｐｍに達
し、この後、溶存酸素レベルは０〜３０％に低下した。
【００６６】下表に、親菌株ＡＴＣＣ２１４２３および
スライム形成性突然変異体菌株Ｘ０３１を用いた液内発
酵の結果を示す。ポリサッカライドが細胞に付着してい
ないＸ０３１の場合、粘度が低下した結果として、混合
および通気が十分になり、消費エネルギーが低くなる。
低速遠心分離（約５０００×Ｇ）により、菌株Ｘ０３１
の細胞をポリサッカライドから除去することができた
が、ＡＴＣＣ２１４２３野生型親菌株ではできなかっ
た。野生型菌株ＡＴＣＣ２１４２３の細胞は、高温（約
９０〜１２１℃）および５〜７の酸性範囲のｐＨで、ポ
リサッカライドを部分的に加水分解した後、低速遠心分
離によってようやく除去された。ポリマー内の位置にて
ポリサッカライド鎖を分断することにより、細胞とポリ
サッカライド部分は非連続となる。
スライム形成性突然変異体菌株Ｘ０３１を用いた液内発
酵の結果を示す。ポリサッカライドが細胞に付着してい
ないＸ０３１の場合、粘度が低下した結果として、混合
および通気が十分になり、消費エネルギーが低くなる。
低速遠心分離（約５０００×Ｇ）により、菌株Ｘ０３１
の細胞をポリサッカライドから除去することができた
が、ＡＴＣＣ２１４２３野生型親菌株ではできなかっ
た。野生型菌株ＡＴＣＣ２１４２３の細胞は、高温（約
９０〜１２１℃）および５〜７の酸性範囲のｐＨで、ポ
リサッカライドを部分的に加水分解した後、低速遠心分
離によってようやく除去された。ポリマー内の位置にて
ポリサッカライド鎖を分断することにより、細胞とポリ
サッカライド部分は非連続となる。
【００６７】
【表４】
【００６８】実施例Ｖ 実施例Ｉの場合と同様に、液内通気液体発酵によってス
フィンゴモナス突然変異体菌株Ｘ２８７およびその親菌
株ＡＴＣＣ３１４６１を培養した。下表に、発酵持続期
間中の粘度および溶存酸素のの変化の時間経過を示す。
フィンゴモナス突然変異体菌株Ｘ２８７およびその親菌
株ＡＴＣＣ３１４６１を培養した。下表に、発酵持続期
間中の粘度および溶存酸素のの変化の時間経過を示す。
【００６９】
【表５】
【００７０】前述の本発明の詳細な説明を熟考すると、
本発明を実行する際の多数の修飾および変更が、当業者
の心に浮かぶことが予期される。従って、このような修
飾および変更は、上述の特許請求の範囲内に含まれるも
のとする。
本発明を実行する際の多数の修飾および変更が、当業者
の心に浮かぶことが予期される。従って、このような修
飾および変更は、上述の特許請求の範囲内に含まれるも
のとする。
【００７１】
【表６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｘ (72)発明者 山崎 元秀 アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サン・ディエゴ，ポルテ・デ・メラノ 4165，＃152 (72)発明者 マーシャ・ミコライジャック アメリカ合衆国カリフォルニア州92024, サン・ディエゴ，エンシニタス，サンリッ チ 852 (72)発明者 トーマス・ジェイ・ポロック アメリカ合衆国カリフォルニア州92103, サン・ディエゴ，トーランス・ストリート 1614 (72)発明者 リチャード・ダブリュー・アーメントロー ト アメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーヤ，ローズモント 542 Ｆターム(参考） 4B064 AF11 CA02 CC06 CE03 DA10 4B065 AA01X AC14 BA16 CA22 CA41
Claims (22)
- 【請求項１】 スライム状のスフィンガンエキソポリサ
ッカライドを提供するのに効果的な時間および温度で、
スフィンゴモナス細菌を発酵ブロスで培養するステップ
と、 スフィンガンエキソポリサッカライドを発酵ブロスから
回収するステップとを含む、エキソポリサッカライドを
製造する方法。 - 【請求項２】 前記スフィンゴモナス細菌が、ＡＴＣＣ
ＰＴＡ−３４８７、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８６、Ａ
ＴＣＣ ＰＴＡ−３４８５、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８
８およびそれらの混合物からなる群から選択される、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 発酵が、約２５℃〜約３５℃の温度で、
約４８〜約９６時間実施される、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項４】 前記スフィンガンエキソポリサッカライ
ドがアルコール沈澱によって回収される、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項５】 約１〜約１．５倍量のアルコールが発酵
ブロスに加えられる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８７、ＡＴＣＣ
ＰＴＡ−３４８６、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８５、Ａ
ＴＣＣ ＰＴＡ−３４８８およびそれらの混合物からな
る群から選択されたスフィンゴモナス細菌を、スライム
状のスフィンガンエキソポリサッカライドを提供するの
に効果的な時間および温度で、発酵ブロスで培養するス
テップと、 アルコール沈澱によってスフィンガンエキソポリサッカ
ライドを発酵ブロスから回収するステップとを含む、ス
フィンガンエキソポリサッカライドを製造する方法であ
って、 発酵ブロス１リットル当たり少なくとも約１０ｇのスフ
ィンガンエキソポリサッカライドを提供するのに有効で
あることを特徴とする方法。 - 【請求項７】 発酵が、約２５℃〜約３５℃の温度で約
４８〜約９６時間実施される、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 約１〜約１．５倍量のアルコールが発酵
ブロスに加えられる、請求項６に記載の方法。 - 【請求項９】 発酵ブロス１リットル当たり約１０〜約
２０ｇのスフィンガンエキソポリサッカライドを含み、
前記スフィンガンエキソポリサッカライドがスライム状
であることを特徴とする発酵ブロス。 - 【請求項１０】 約１５，０００〜約３０，０００ｃｐ
の粘度を有する、請求項９に記載の発酵ブロス。 - 【請求項１１】 ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８７、ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ−３４８６、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８５、
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８８およびそれらの混合物から
なる群から選択されたスフィンゴモナス細菌を、スライ
ム状のスフィンガンエキソポリサッカライドを提供する
のに効果的な時間および温度にて、発酵ブロス中で培養
するステップと、 アルコール沈澱によってスフィンガンエキソポリサッカ
ライドを発酵ブロスから回収するステップとを含む方法
によって製造されるエキソポリサッカライドであって、 前記方法が発酵ブロス１リットル当たり少なくとも約１
０ｇのスフィンガンエキソポリサッカライドを提供する
のに効果的な方法であることを特徴とするエキソポリサ
ッカライド。 - 【請求項１２】 発酵が、約２５℃〜約３５℃の温度で
約４８〜約９６時間実施される、請求項１１に記載のエ
キソポリサッカライド。 - 【請求項１３】 約１〜約１．５倍量のアルコールが発
酵ブロスに加えられる、請求項１１に記載のエキソポリ
サッカライド。 - 【請求項１４】 ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８７、ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ−３４８６、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８５、
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８８およびそれらの混合物から
なる群から選択されたスフィンゴモナスの菌株に由来す
る細菌。 - 【請求項１５】 スフィンゴモナス細菌により産生され
るスライム状のエキソポリサッカライド。 - 【請求項１６】 ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８７、ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ−３４８６、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８５、
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８８およびそれらの混合物から
なる群から選択されたスフィンゴモナスにより産生され
る、請求項１５に記載のスライム状のエキソポリサッカ
ライド。 - 【請求項１７】 一般式 【化１】 （式中、Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルク
ロン酸または２−デオキシグルクロン酸であり、Ｒｈａ
はラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘは
ＲｈａまたはＭａｎであり、ＺはＧｌｃ残基２に結合し
ており、且つα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−４）−α−Ｌ−Ｒ
ｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎまたはα−Ｌ−Ｒｈａであり、Ｗ
はＧｌｃ残基１に結合しており、且つβ−Ｄ−Ｇｌｃ−
（１−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−
６）−β−Ｄ−Ｇｌｃまたはα−Ｌ−Ｒｈａであり、下
付き文字ｖおよびｙは、０、０．３３、０．５、０．６
７または１である）を有するスフィンガンエキソポリサ
ッカライドである、請求項１５に記載のスライム状のエ
キソポリサッカライド。 - 【請求項１８】 一般式 【化２】 （式中、Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルク
ロン酸または２−デオキシグルクロン酸であり、Ｒｈａ
はラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘは
ＲｈａまたはＭａｎであり、ＺはＧｌｃ残基２に結合し
ており、且つα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−４）−α−Ｌ−Ｒ
ｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎまたはα−Ｌ−Ｒｈａであり、Ｗ
はＧｌｃ残基１に結合しており、且つβ−Ｄ−Ｇｌｃ−
（１−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−
６）−β−Ｄ−Ｇｌｃまたはα−Ｌ−Ｒｈａであり、下
付き文字ｖおよびｙは、０、０．３３、０．５、０．６
７または１である）を有する、スライム状のエキソポリ
サッカライド。 - 【請求項１９】 ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８７、ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ−３４８６、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８５、
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８８およびそれらの混合物から
なる群から選択されたスフィンゴモナスにより産生され
る、請求項１８に記載のスライム状のエキソポリサッカ
ライド。 - 【請求項２０】 スフィンゴモナス細菌により産生され
たスライム状のエキソポリサッカライドであって、前記
スフィンゴモナス細菌が液内通気液体培養で増殖され、
２４時間の培養後、溶存酸素濃度が水の飽和状態の約５
％を超えることを特徴とするエキソポリサッカライド。 - 【請求項２１】 ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８７、ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ−３４８６、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８５、
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４８８およびそれらの混合物から
なる群から選択されたスフィンゴモナスにより産生され
る、請求項２０に記載のスライム状のエキソポリサッカ
ライド。 - 【請求項２２】 一般式 【化３】 （式中、Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルク
ロン酸または２−デオキシグルクロン酸であり、Ｒｈａ
はラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘは
ＲｈａまたはＭａｎであり、ＺはＧｌｃ残基２に結合し
ており、且つα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−４）−α−Ｌ−Ｒ
ｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎまたはα−Ｌ−Ｒｈａであり、Ｗ
はＧｌｃ残基１に結合しており、且つβ−Ｄ−Ｇｌｃ−
（１−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−
６）−β−Ｄ−Ｇｌｃまたはα−Ｌ−Ｒｈａであり、下
付き文字ｖおよびｙは、０、０．３３、０．５、０．６
７または１である）を有するスフィンガンエキソポリサ
ッカライドである、請求項２１に記載のスライム状のエ
キソポリサッカライド。
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|---|---|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN114292887A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-08 | 合肥师范学院 | 一种二阶段调节pH发酵生产结冷胶的方法 |
| CN116240137B (zh) * | 2023-02-01 | 2024-08-27 | 陕西延长石油（集团）有限责任公司 | 一种新鞘氨醇菌、耐盐耐高温的微生物分散体封堵调驱剂的制备方法及其应用 |
| FR3146281A1 (fr) * | 2023-03-01 | 2024-09-06 | Societe Industrielle Limousine D'application Biologique | Extrait de Sphingomonas panaciterrae et ses utilisations cosmétiques |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3915800A (en) * | 1972-03-30 | 1975-10-28 | Kelco Co | Polysaccharide and bacterial fermentation process for its preparation |
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| US5300429A (en) | 1990-08-23 | 1994-04-05 | Merck & Co., Inc. | PHB-free gellan gum broth |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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