KR20020009480A

KR20020009480A - 박테리아 세포 표면에 부착되지 않은엑소폴리사카라이드의 생산방법

Info

Publication number: KR20020009480A
Application number: KR1020010044426A
Authority: KR
Inventors: 야마자키모토히데; 미콜라이작마르시아; 폴록토머스제이.; 아멘트라웃리처드더블유.
Original assignee: 추후보정; 신-에쮸 케미칼 컴퍼니 리미티드; 신-에쮸 바이오 인코포레이티드
Priority date: 2000-07-24
Filing date: 2001-07-24
Publication date: 2002-02-01
Also published as: DE60135281D1; US6605461B2; EP1176209B1; KR100771745B1; US7390644B2; CA2351233A1; AU5588701A; BR0102991A; US20020035249A1; JP4316826B2; CA2351233C; JP2002176996A; ATE404687T1; NZ512962A; US20040077056A1; AU783628B2; EP1176209A1

Abstract

본 발명은 스핑고모나스 박테리아 및 점액형 스핑간 엑소폴리사카라이드 제공에 유효한 시간 동안 및 그러한 온도에서 스핑고모나스 박테리아를 발효 브로스에서 배양함에 의한 엑소폴리사카라이드의 생산방법에 관한 것이다.

Description

박테리아 세포 표면에 부착되지 않은 엑소폴리사카라이드의 생산방법{PRODUCTION OF EXOPOLYSACCHARIDES UNATTACHED TO THE SURFACE OF BACTERIAL CELLS}

본 발명은 엑소폴리사카라이드의 생산 및 엑소폴리사카라이드를 생산하는 박테리아에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명의 박테리아는 박테리아 세포 표면에 부착되지 않은 점액형 엑소폴리사카라이드를 생산한다.

배경기술

값싸고 환경적으로 허용가능한 점성화제, 생물학적 유화제 및 생분해성 중합체에 대한 수요가 증가 추세이다. 엑소폴리사카라이드는 이의 독특한 유동학적 성질로 인해 이러한 목적에 유용한 화합물의 일례이다. 엑소폴리사카라이드, 예를 들어 겔란, 웰란 및 람산은 식품, 화장품, 및 유전 생산, 및 기타 용도로 상업적으로 생산된다. 각각의 엑소폴리사카라이드는 내전단성, 각종 이온 화합물과의 사용성, 및 극한 온도, pH 및 염 농도에 대한 안정성을 포함한 수성 유동학적 성질면에서 다양한 특성을 나타낸다.

엑소폴리사카라이드는 박테리아 발효를 통해 생산될 수 있다.스핑고모나스(Sphingomonas) 속의 다양한 균주가 겔란, 웰란, 람산, S-88, S-7, S-198, NW11, 및 S-657을 포함한 엑소폴리사카라이드를 생산한다(Pollock 1993, J. Gen. Microbiol. 139:1939-1945). 기타 스핑고모나스 박테리아 균주에 의해 다수의 기타 엑소폴리사카라이드가 만들어진다. 스핑고모나스 박테리아에 의해 생산된 엑소폴리사카라이드는 근원이 공통인 종을 참조할 때 "스핑간"으로 불린다. 대규모의 액침 발효에 의해 적어도 세 종류 스핑간(겔란, 웰란, 및 람산)이 생산된다.

생물공학 산업은 산업적으로 허용가능한 각종 박테리아 엑소폴리사카라이드 산물의 효용을 증가시킴으로써 엑소폴리사카라이드 화합물에 대한 수요에 응해 왔다. 다수의 박테리아 엑소폴리사카라이드 산물이 합성에 의해 생산된 물질보다 다양한 범위에서 매력적인 개선점을 제공하고 있지만, 비교적 생산하는 데 비용이 많이 든다. 비용은 일반적으로 원하는 산물의 회수 및 정제비와 연관된다.

박테리아 균주의 개량 및 변형으로 인해 보다 높은 엑소폴리사카라이드의 발효 수율이 얻어지고, 박테리아 생합성과 발효 조건의 최적화를 보다 잘 이해하게 된다. 이는 잠재적 산업 적용을 위해 적절한 양의 중합체를 회수하는 중요한 단계 중 하나를 만족시킨다. 그러나, 발효 공정에서 증가된 엑소폴리사카라이드 농도는 증가된 점도를 야기하여 발효 브로스에서 산소와 영양분을 효과적으로 분산시키는 데 보다 많은 에너지의 주입을 요구한다. 이에 따라, 보다 높은 엑소폴리사카라이드 수율을 제공하는 발효는 이에 상응하여 보다 높은 생산 비용을 야기하게 된다.

엑소폴리사카라이드의 회수는 어렵고 비용이 많이 드는 단계이다. 스핑고모나스 속의 박테리아 균주는 세포 표면에 부착되는 엑소폴리사카라이드를생산한다(Pollock et al., 1999, J. Indust. Microciol. Biotechnol. 23: 436-441). 부착된 중합체는 박테리아 주위에 캡슐을 형성한다. 폴리사카라이드 캡슐은 박테리아로부터 쉽게 분리되지 않는다. 점도를 감소시키기에 충분한 물로 발효 브로스를 희석시킨 후라도, 캡슐은 박테리아 세포에 여전히 부착되어 있고 세포는 원심 분리식 침강에 의해 캡슐로부터 분리될 수 없다. 캡슐을 세포와 분리시키는데는 기타 물리적 또는 화학적 방법이 필요하다. 예를 들어, 산을 이용한 폴리사카라이드의 부분 가수분해를 이용하여 세포에 대한 부착 지점에 가까운 중합체 쇄를 무작위 절단하여 세포로부터 대부분의 폴리사카라이드를 해리시킬 수 있다.

엑소폴리사카라이드를 생산하는 데 사용된 조건에 상관없이 이의 회수는 전형적으로 침전 단계를 수반한다. 침전된 엑소폴리사카라이드는 원심분리에 의해 회수된다. 겔란과 웰란 검을 회수하는 전형적인 방법이 뒤따른다. 발효 직후 배양 브로스를 적어도 90℃로 가열하여 살아있는 박테리아를 죽인다. 두 검은 이소프로필알콜 대략 2 용적을 이용하여 침전시켜 배양 브로스로부터 분리되고, 침전된 폴리사카라이드 섬유를 모아, 압축하고, 건조시킨 다음 분쇄시킨다. 알콜은 증류에 의해 회수된다. 가장 간단한 공정에서 폴리사카라이드는 세포에 부착된 채로 남아 있어, 건조되어 분쇄된 폴리사카라이드가 물에 재현탁될 때 용액은 탁해진다. 겔란 검의 경우 재현탁된 산물이 좀더 투명해지도록 박테리아 세포로부터 폴리사카라이드를 정제하기 위해 부가적인 단계가 도입될 수 있다. 알콜 침전 전, 온도를 원심분리 또는 여과에 적합한 높은 점성인 상태와 액화된 상태 사이의 임계 전이 온도 이상으로 유지하면서 배양 브로스는 원심분리되거나 여과되거나 둘 모두가 행해진다. 이들 공정은 본원에서 참고된 미국 특허 4,326,052(겔란); 4,326,053(겔란); 4,342,866(웰란); 3,960,832(S-7); 및 4,535,153 (S-88)에 기재되어 있다.

전형적인 산물 회수 프로토콜과 관련한 주된 비능률은 엑소폴리사카라이드의 불완전한 회수이다. 박테리아 엑소폴리사카라이드는 다양한 인성도로 생산 세포에 부착된다. 비교적 안정적으로 부착된 엑소폴리사카라이드를 지닌 박테리아는 이를 배지로 내뿜는 성향이 약하여, 침전 단계에서 회수에 이용가능한 엑소폴리사카라이드의 양을 감소시키고 생산 세포로부터 엑소폴리사카라이드를 분리하는 데 필요한 공정 단계를 증가시킨다.

본 발명의 이점, 특성 및 특징은 하기 상세한 설명과 첨부된 청구범위를 고려하여 좀더 명확해질 것이다.

요약

본 발명은 스핑간 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법 및 스핑간 엑소폴리사카라이드를 생산하는 스핑고모나스 박테리아에 관한 것이다. 본 발명은 스핑간 엑소폴리사카라이드가 스핑고모나스 박테리아 표면에 부착되지 않도록 스핑간 엑소폴리사카라이드가 점액 형태로 생산되는 방법을 제공한다. 점액형 스핑간 엑소폴리사카라이드의 생산은 엑소폴리사카라이드가 박테리아 세포에 캡슐형으로 부착되는 발효에 비해 적은 에너지를 요구한다. 추가로, 점액형으로 생산된 스핑간 엑소폴리사카라이드의 분리 및 회수는 캡슐형으로 생산된 스핑간 엑소폴리사카라이드의 회수에 비해 좀더 효과적이다.

일 측면에서, 본 발명은 점액형 스핑간 엑소폴리사카라이드를 제공하는데 효과적인 시간 동안 그러한 온도에서 발효 브로스에서 스핑고모나스 박테리아를 배양하는 단계를 포함하는, 스핑간 엑소폴리사카라이드의 생산방법을 제공한다. 본 발명의 중요한 측면에서, 점액형 스핑간 엑소폴리사카라이드를 생산하기 위해 유전자 돌연변이된 스핑고모나스 박테리아가 액침 발효에 이용된다. 유전자 돌연변이된 스핑고모나스 박테리아의 예는 ATCC PTA-3487(균주 X287, 기탁일: 2001년 6월 28일), ATCC PTA-3486(균주 X530, 기탁일: 2001년 6월 28일), ATCC PTA-3485(균주 Z473, 기탁일: 2001년 6월 28일), ATCC PTA-3488(균주 X031, 기탁일: 2001년 6월 28일) 및 이들의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 유전자 돌연변이된 스핑고모나스 박테리아의 발효는 점액형 엑소폴리사카라이드를 포함하는 발효 브로스를 제공한다. 발효 브로스의 점도는 (발효 도중 엑소폴리사카라이드로 전환되는 당의 양에 좌우되는) 생산되는 스핑고 엑소폴리사카라이드의 양에 좌우된다. 발효 초기의 당 농도 또는 당에서 엑소폴리사카라이드로의 전환 효율이 증가하면, 브로스의 점도는 이에 따라 증가될 것이다. 예를 들어, 약 25℃ 내지 약 35℃의 온도에서 약 48시간 내지 약 96시간 동안 스핑고모나스 균주 X287을 이용하여 발효시키면 점액형 겔란 검이 생성된다. 생성된 발효 브로스는 약 15,000 내지 약 30,000 cp, 바람직하게는 약 15,000 내지 약 20,000 cp의 점도를 가지고, 약 20 내지 약 25 g/L의 총 바이오매스를 가진다. 일반적으로, 이러한 바이오매스의 1/2 내지 3/4은 엑소폴리사카라이드 자체를 나타낸다.

본 발명의 이러한 측면에서, 본 발명의 유전자 돌연변이된 스핑고모나스 박테리아의 발효를 통해 생성된 발효 브로스는 약 20,000 cp 이하의 점도를 가지지만, 상응하는 친주의 발효를 통해 생성된 발효 브로스는 약 40,000 cp 이상의 점도를 가진다. 점액형 엑소폴리사카라이드에 의해 제공된 감소된 점도로 인해 좀더 효과적인 혼합과 공기 주입, 및 낮은 에너지 소모가 일어난다.

발효중 혼합, 통기 및 에너지 소모는 발효 용기의 크기 및 형상, 발효 용기 임펠러의 종류, 크기 및 양, 및 배양액 점도에 좌우된다. 예를 들어, 동일한 발효 장치와 작업 조건하에, 야생형 친주는 정지기까지 증식시킬 수 있으며, 스핑고모나스 박테리아의 경우 600 nm에서 흡광도는 약 15를 초과한다. 정지기에서, 발효 브로스는 용기내의 산소 센서로 측정시 검출가능한 산소를 가지지 않을 것이다. 반면, 정지기까지 증식된 본 발명의 유전자 돌연변이된 박테리아에 대한 발효 브로스는 물에 적어도 약 5% 포화 수준의 용존 산소를 가질 것이다. 부가적으로, 본 발명의 유전자 돌연변이된 박테리아를 이용한 발효의 전 기간 동안 양의 산소 수준 유지는 보다 높은 속도로 엑소폴리사카라이드를 생산한다.

보다 낮은 점도의 점액형 엑소폴리사카라이드를 생산하는 또다른 이점의 예는 외인성 산 또는 염기의 첨가에 의해 용기내의 pH를 조절하는 능력이다. 친주를 이용한 발효에서처럼 점도가 약 20,000 cp를 초과하면, 균일한 용액을 만들기 위한 산 또는 염기의 고속 혼합이 불가능하다. 대신에, 고농도의 산 또는 염기 영역이 만들어진다. 저마다, 농축된 산 또는 염기는 폴리사카라이드를 가수분해하거나 폴리사카라이드로부터 아실 그룹을 절단할 수 있다. 발효의 전 기간 동안 pH의 효과적인 조절은 또한 생산성을 증가시킬 수 있다.

중요한 측면에서, 본 발명은 스핑간 엑소폴리사카라이드가 캡슐형으로 생산되는 발효 브로스에 비해 스핑간 엑소폴리사카라이드의 개선된 하류 회수 및 공정 처리를 야기하는 발효 브로스를 제공하는 데 효과적이다. 본 발명의 이러한 측면에서, 스핑간 엑소폴리사카라이드는 전형적으로 알콜 침전에 의해 회수된다. 알콜 침전에 대한 용적 요구사항은 발효 브로스 용적당 약 2 용적에서 약 1 내지 약 1.5 용적으로 감소될 수 있다. 추가로, 효과적인 침전 온도는 약 90℃에서 약 25℃ 내지 약 50℃로 감소될 수 있다.

발효 후, 및 알콜 침전 이전에, 엑소폴리사카라이드를 함유한 발효 브로스는 부가적인 공정 처리 단계에 의해 처리될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포를 죽이기 위해, 브로스 온도를 적어도 15분간 80℃ 이상으로 올릴 수 있다. 아실 그룹은 약 9 이상의 pH를 달성하기 위해 알칼리를 열처리된 브로스에 첨가하여 폴리사카라이드로부터 제거될 수 있다. 특정 겔란 검의 경우, 이들 두 단계는 발효 브로스 점도가 충분히 감소되도록 하여 물리적 수단, 예를 들면 여과 또는 원심 분리에 의한 침전, 또는 두 공정의 조합에 의해 폴리사카라이드로부터 박테리아 세포를 분리시킬 수 있다. 그러나, 겔란 검이 캡슐형으로 생산되면, 발효 브로스 온도가 80℃ 이상으로 유지되는 동안 분리 단계가 달성되어야 한다. 80℃ 이하의 온도에서, 배양 브로스에서 겔란 검은 배양 배지에서 이가 양이온에 의해 가교 결합된 겔란의 쇄를 지닌 견고한 겔로 고화될 것이다. 겔란 검이 겔을 형성하면, 침전에 의해 겔란을 회수할 수 없고, 겔화된 물질은 버려야 한다. 반면에, 엑소폴리사카라이드가 점액형이면, 점도는 감소되고 겔 형성을 차단하는 데 필요한 온도가 감소된다. 본발명의 이러한 측면에서, 세포-분리 단계 동안의 온도는 약 60℃ 정도로 낮게 감소시킬 수 있다.

본 발명의 이러한 측면에 따라, 본 공정 수율은 브로스 1 리터당 약 10 내지 약 20 그램의 엑소폴리사카라이드이다. 순도는 전형적으로 적어도 약 80%를 초과한다.

상세한 설명

정의

달리 정의된 바가 없으면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 문헌[참조: Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second edition, John Wiley and Sons (New York)]은 본 발명에 사용된 다수 용어의 일반적인 사전적 의미와 함께 기술 용어를 제공한다. 본원에서 언급된 모든 특허 및 공개문헌은 본원에서 참고된다. 본 발명의 목적상, 하기에 용어가 정의되고 있다.

본원에 사용된 용어 "스핑간" 및 "스핑간 엑소폴리사카라이드"는 스핑고모나스 속의 멤버에 의해 분비된 유관하지만 독특한 엑소폴리사카라이드 그룹을 말한다(Pollock, J. Gen. Microbiology 139:1939-1945, 1993). 스핑간의 구조는 다소 모두 유관하다. 각 스핑간의 주쇄는 4종의 당: D-글루코스, D-글루쿠론산, L-만노스 및 L-람노스의 관련 서열로 이루어진다. 스핑간 그룹의 폴리사카라이드 멤버는 중합체 백본과 측쇄를 포함하는 탄수화물에 의해 서로 구별된다. 스핑간 폴리사카라이드는 중합체 백본상에 탄수화물이 부착된 탄수화물 측쇄 및 아세틸 또는 피루빌 그룹을 함유할 수 있다. Mikolajczak, et al., Appl. and Env. Microbiol., 60:402, (1994) 참조. 겔란, 웰란, 람산, S-88, S-7, NW-11, S-198 및 S-657은 스핑간 그룹에서 엑소폴리사카라이드의 예이다.

전형적으로, 스핑간 엑소폴리사카라이드 계통의 멤버는 하기의 반복되는 화학 구조식으로 표현될 수 있다:

상기식에서, Glc는 글루코스이고; GlcA는 글루쿠론산 또는 2-데옥시-글루쿠론산이며; Rha는 람노스이고; Man은 만노스이며; X는 Rha 또는 Man일 수 있으며; Z는 Glc 잔기 2에 부착되고 α-L-Rha-(1-4)-α-L-Rha, α-L-Man 또는 α-L-Rha일 수 있으며; W는 Glc 잔기 1번에 부착되고 β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc, β-D-Glc-(1-6)-β-D-Glc 또는 α-L-Rha일 수 있으며, v와 y는 0, 0.33, 0.5, 0.67 또는 1일 수 있으며, 중합체의 "환원 말단"은 백본의 X 잔기를 향한다. 본원에 사용된 용어 "백본" 또는 "주쇄"는 쇄 W와 Z를 배제하는 구조 부위, 즉 v와 y가 0일 때를 의미한다.

스핑간 폴리사카라이드 계통의 몇몇 멤버는 다양한 위치에서 아세틸화된다. 그러나, 폴리사카라이드는 아실 그룹을 제거하는 통상적인 방법으로 화학적 탈아실화를 겪을 수 있다. 예를 들어, 겔란은 웰란(즉, X=Rha)과 동일한 탄수화물 백본을가지지만, 측쇄 당(즉, v=0 및 y=0)이 결여되어 있고 글루코스 잔기 1은 글리세레이트로 완전히 치환된다. 겔란 서브유닛 구조는 또한 글루코스 잔기 1에서 부분적으로 아세틸화된다. 본원에서 사용된 "탈아실화"는 글리세릴 및 아세틸 그룹의 부족을 의미한다.

전술한 바와 같이, 스핑간 엑소폴리사카라이드의 일례는 겔란 검이다. "겔란 검"은 글리세릴과 아세틸 그룹이 람노스의 환원 측부에 인접한 글루코스 잔기에 부착된 탄수화물 반복구조 - [(L)람노스-(D)글루코스-(D)글루쿠론산-(D)글루코스] - 를 가지는 폴리사카라이드를 의미한다. 표준 실행에서 올리고사카라이드의 환원 말단은 우측에 위치한다. 겔란 검은 평균적으로, 반복단위당 약 하나의 글리세릴 그룹과 두 반복단위당 약 하나의 아세틸 그룹을 가진다.

본원에서 추가로 설명되는 것처럼, 스핑고모나스의 친주는 캡슐형 스핑간 엑소폴리사카라이드를 생성한다. 본원에 사용되는 "캡슐"은 생산 박테리아 세포 표면에 부착되어 있고, 수성 희석 후에도 부착되어 있으며, 침강 또는 원심분리에 의해 부착된 세포로부터 분리시킬 수 없는 폴리사카라이드를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "스핑고모나스"는 전술한 바와 같이, 엑소폴리사카라이드 또는 스핑간을 생성하는 스핑고모나스 속으로부터의 그람-음성 박테리아 균주를 언급한다. 그람-음성 박테리아의 스핑간-생산 계통은 스핑고모나스 속에 속하는 것으로 1993년에 최초로 동정되었다(참조, Pollock, J. Gen. Microb., 139, 1939 (1993)).

본 발명에 유용한 스핑고모나스 박테리아는 유전자 돌연변이되었거나 돌연변이유발이 유도된 친주로부터 유도되는 스핑고모나스 박테리아를 포함한다.

본원에 사용되는 "친주"는 친주의 유전자 함량 또는 표현형을 변형시키고자 하는, 유도된 돌연변이유발과 같은 처리 전의 박테리아 균주 또는 각 박테리아를 의미한다. 이는 친주 또는 박테리아로부터 수득될 수 있는 돌연변이되었거나 유전자-변형된 유도 균주와 친주가 확실히 구별됨을 의미한다.

본원에 사용되는 "유전자 변형"은 자발적이거나 유도된 돌연변이유발이 일어나 돌연변이된 박테리아 또는 박테리아 균주와 친주를 구별하는 성질을 보이는 특징을 의미한다.

본원에 사용되는 "유도된 돌연변이유발"은 화학물질, 전자기선, 바이러스, 플라스미드, 삽입 요소 또는 트랜스포손 같은 생물학적 제제를 포함하는(이에 한정되지 않는다) DNA에서 유전자 돌연변이의 형성을 유도하는 것으로 통상 알려진 제제로 박테리아 세포의 처리를 의미한다.

본 발명의 스핑고모나스 박테리아는 점액 형태로 엑소폴리사카라이드를 생성한다. 본원에 사용되는 "점액"은 생산 박테리아 세포에 부착되어 있지 않고 발효 브로스의 침강 또는 원심분리에 의해 또는 발효 브로스의 열처리 또는 다른 물리적 또는 화학적 처리 부재하에 수성 희석 후에 세포로부터 실질적으로 분리될 수 있는 폴리사카라이드를 의미한다. 점액 형태로 엑소폴리사카라이드를 생성하는 박테리아는 광학현미경으로 관찰하면 캡슐 폴리사카라이드를 생성하는 것들과 구별될 수 있다. 캡슐형 스핑고모나스 박테리아는 응집체로 이들과 함께 유지되는 캡슐을 가지지 않는 균일하게 분산된 점액-형성 박테리아 세포와는 반대로, 세포 표면에 부착된 폴리사카라이드 쇄에 의해 함께 유지되는 다세포성 응집체를 형성한다.

본원에 사용되는 용어 "생합성"은 스핑고모나스 박테리아에 의한 스핑간의 생물학적 생성 또는 합성을 설명한다. 스핑간 엑소폴리사카라이드는 박테리아의 여러 효소에 의해 조절되는 일련의 단계로 각 탄수화물 단위로부터 합성된다.

용어 "바이오매스"는 박테리아 배양액 내의 엑소폴리사카라이드와 박테리아 세포를 언급한다.

균주 개발

본 발명은 점액 형태로 스핑간 엑소폴리사카라이드를 합성하고 분비하기 위해 유전자 변형된 스핑고모나스 박테리아의 균주를 이용한다. 본 발명의 이러한 측면에서, 캡슐 형태로 스핑간 엑소폴리사카라이드를 생성하는 스핑고모나스 친주는 유전자 돌연변이된 스핑고모나스 박테리아를 제공하기 위한 과정에 가해진다. 이용되는 친주의 예는 S60(ATCC 31461), S130(ATCC 31555), S88(ATCC 31554) 및 S7(ATCC 53159)를 포함한다. 본 발명에 유용한 유전자 돌연변이된 스핑고모나스 박테리아의 예는 점액 형태로 겔란 검을 생성하는 ATCC PTA-3487(균주 X287), 점액 형태로 웰란 검을 생성하는 ATCC PTA-3486(균주 X530), 점액 형태로 엑소폴리사카라이드 S-88을 생성하는 ATCC PTA-3485(균주 Z473) 및 점액 형태로 엑소폴리사카라이드 S-7을 생성하는 ATCC PTA-3488(균주 X031)을 포함한다.

발효

본 발명의 또다른 측면은 스핑간 엑소폴리사카라이드의 향상된 생산에 관한 것이다. 스핑간 엑소폴리사카라이드를 생성하기 위해, 유전자 돌연변이된 스핑고모나스 박테리아를 당분야에 익히 공지되었고 본원에 참조로 인용되는, U.S. 특허 제5,854,034호에 일반적으로 설명되어 있는 적당한 발효 조건하에서 배양한다. 요약하면, 유전자 돌연변이된 스핑고모나스 박테리아를 배양하기 위한 적당한 배지는 예를 들면, 글루코스, 락토스, 수크로스, 말토스 또는 말토덱스트린을 포함하는 탄수화물과 같은 탄소원, 예를 들면 무기 암모늄, 무기 니트레이트, 유기 아미노산 또는 단백질성 물질(예, 가수분해된 효모, 대두 분말 또는 카세인, 알콜 박즙 또는 옥수수 침지액)과 같은 질소원, 무기염 및 비타민을 일반적으로 함유하는 수성 배지이다. 다양한 발효 배지가 본 발명에 따른 스핑간의 생성을 원조할 것이다.

탄수화물은 다양한 양으로, 그러나 통상적으로 발효 배지의 약 1 중량% 내지 5 중량%로 발효 브로스에 포함된다. 탄수화물은 발효에 앞서 또는 이와 달리, 발효 중에 한번에 모두 첨가될 수 있다. 질소의 양은 수성 배지의 약 0.01 중량% 내지 약 0.2 중량% 범위일 수 있다. 단독 탄소원 또는 질소원, 및 이들 공급원의 혼합물이 사용될 수 있다.

스핑고모나스 박테리아의 발효에 사용되는 무기염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 니트레이트, 칼슘, 포스페이트, 설페이트, 클로라이드, 카보네이트 및 유사 이온을 함유하는 염이다. 마그네슘, 망간, 코발트, 철, 아연, 구리, 몰리브덴, 요오드염 및 붕산염과 같은 미량 금속 또한 유리하게 포함될 수도 있다. 비오틴, 폴레이트, 리포에이트, 니아신아미드, 판토테네이트, 피리독신, 리보플라빈, 티아민 및 비타민 B₁₂와 같은 비타민과 이들의 혼합물 또한 유리하게 이용될 수 있다.

발효는 약 25℃ 내지 35℃의 온도에서 실행되고, 최적의 생산성은 약 28℃ 내지 32℃ 범위의 온도에서 달성된다. 접종원은 진탕 플라스크 배양 및 소규모 액침 교반 발효를 포함하는 용적의 정률이 증가하는 표준 방법으로 제조된다. 접종원을 제조하기 위한 배지는 생산 배지와 동일할 수 있거나 Luria 발효 브로스 또는 YM 배지와 같은 당분야에 익히 공지된 다수의 표준 배지 중 하나일 수 있다. 탄수화물의 농도는 시드 배양액에서 약 1 중량% 이하로 감소될 수 있다. 하나 이상의 시드 단계가 접종을 위한 목적하는 용적을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 통상의 접종 용적은 전체 최종 발효 용적의 약 0.5% 내지 약 10% 범위이다.

발효 용기는 통상적으로 내용물을 교반하기 위한 교반기를 함유한다. 용기는 또한 자동 pH 및 발포 조절기를 가질 수 있다. 생성 배지가 용기에 첨가되고 가열에 의해 그 자리에서 멸균된다. 이와 달리, 탄수화물 또는 탄소원은 첨가 전에 각각 멸균될 수 있다. 미리 증식시킨 시드 배양액은 냉각 배지(일반적으로 약 28℃ 내지 약 32℃의 발효 온도에서)에 첨가되고 교반된 배양액은 약 48 내지 약 96시간 동안 발효되어, 약 15,000 내지 약 20,000 cp의 점도를 가지는 발효 브로스 및 점액형 스핑간 엑소폴리사카라이드 약 10 내지 약 15 g/ℓ를 생성한다. 상응하는 친주 스핑고모나스 박테리아의 발효는 통상적으로 약 25,000 내지 약 50,000 cp의 점도를 가지는 발효 브로스를 제공할 것이다.

이러한 측면에서, 본 발명은 액침, 교반 통기된 액체 배양액에서 증식한 스핑고모나스 박테리아로부터 수득된 점액형 엑소폴리사카라이드를 제공한다. 액체 배양액내 용존 산소 농도는 배양 24시간 후에 물에 약 5% 포화 이상이다. 친주로의유사한 발효는 24시간 후에 용존 산소 0%를 초래한다. 점액 형태의 엑소폴리사카라이드에 의해 제공되는 저점도는 스핑고모나스 박테리아가 좀더 장기간 동안 배양액에서 생산성이도록 하는 증진된 통기를 초래한다.

본 발명의 또다른 측면에서, 발효는 한 발효로부터의 박테리아가 후속 발효를 위한 접종원으로 사용되는 반-뱃치식 공정으로 실행될 수 있다. 이러한 측면에서, 이들이 생성하는 엑소폴리사카라이드로부터 분리된 스핑고모나스 박테리아는 신선한 발효 발효 브로스에 첨가될 수 있거나, 신선한 발효 브로스가 잔류하는 스핑고모나스 박테리아에 첨가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 측면은 별도의 시드 배양액을 제공할 필요를 제거하였다.

발효 브로스의 공정처리

다수의 접근법이 엑소폴리사카라이드의 회수를 위한 발효 브로스의 추가의 공정처리에 이용될 수 있다. 예를 들면, 엑소폴리사카라이드는 발효 브로스로부터 직접 침전시킬 수 있고, 발효 브로스는 1차 정화된 다음 침전될 수 있으며, 발효 브로스는 탈아실화된 다음 침전될 수 있거나 발효 브로스는 탈아실화된 다음 정화 및 침전될 수 있다.

본 발명의 일면에서, 엑소폴리사카라이드 적어도 약 1% w/v의 양과 약 25,000 cp 이하의 점도를 가지는 발효 브로스는 엑소폴리사카라이드의 회수를 위해 추가 처리된다. 본 발명의 이러한 측면에서, 알콜 약 1 내지 약 1.5 용적이 약 25℃ 내지 약 50℃의 온도에서 발효 브로스에 직접 첨가된다. 이와 달리, 발효 브로스는 본원에 참조로 인용되는, U.S. 특허 제4,326,052호에 설명된 바와 같이 알콜첨가에 앞서, 1차 탈아실화된 다음 정화될 수 있다. 엑소폴리사카라이드의 침전에 효과적인 알콜은 에탄올, 이소프로필알콜, 프로판올, 부탄올 및 이들의 혼합물을 포함한다. 침전은 사용되는 혼합 장치의 유형에 따라 뱃치식 또는 반-연속식 또는 연속식일 수 있다. 혼합이 고점도로 인해 저해되면 물로의 희석이 알콜 첨가 전에 사용된다.

발효 후에, 엑소폴리사카라이드는 이어서 침강 또는 여과에 의해 세포 파편으로부터 분리된다. 침강은 원심분리에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에서, 침전 후에, 균질성 엑소폴리사카라이드 분말을 제공하기 위한 당분야에 공지된 다수의 회수, 압착, 건조 및 분쇄방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 이러한 측면에 따라서, 공정은 엑소폴리사카라이드 약 1 내지 약 2%(최초 발효 브로스 용적을 기준으로, w/v)를 생산한다. 순도는 통상적으로 적어도 약 80%를 초과한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 실행하기 위한 방법을 설명하고 첨부된 청구범위에 의해 한정된 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아닌 설명하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예 1

겔란 검이 통기, 교반, 액침 발효에 의해 야생형 균주 ATCC31461로부터 유도된 스핑고모나스 돌연변이체 균주 X287 및 ATCC31461 친주로부터 생성된다. 균주 X287은 유도된 돌연변이유발의 재현가능한 다단계 방법 및 바람직한 성질의 선택으로 수득된다.

성장 배지는 암모늄 니트레이트 1 g, 가용성 가수분해된 대두 단백질(Soy Peptone from Marcor) 0.5 g, 이염기성 칼륨 포스페이트 3.2 g, 일염기성 칼륨 포스페이트 1.6 g, 마그네슘 설페이트(헵타하이드레이트) 0.1 g, 미네랄 미량 및 글루코스를 함유한다(탈이온수 리터당). 미량의 미네랄은 FeCl₃-6H₂O 2.7 mg, ZnCl₂1.36 mg, MnCl₂-4H₂O 1.98 mg, CoCl₂-6H₂O 240 ㎍, Na₂MoO₄-2H₂O 240 ㎍ 및 CuSO₄-5H₂O 250 ㎍을 함유한다(최종 배지 리터당). 최종 발효 배지는 리터당 글루코스 25 g을 함유하고, 예비배양 배지는 리터당 글루코스 10 g을 함유한다.

동결 세포 바이얼을 해동하여 배플 플라스크 내의 예비배양액 500 ㎖에 첨가하고 약 16-20시간 동안 또는 600 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 세포 밀도가 약 3-5일 때까지 회전 진탕기내, 30℃에서 배양한다. 동결 세포는 동일한 배지를 함유하는 아가 플레이트 상에서 증식한 박테리아 균주의 단일 콜로니로 접종한 이전의 예비배양 플라스크로부터 취한 샘플이다.

약 5-10 용적%의 접종을 제공하기 위한 예비배양액의 양을 발효조에 첨가한다. 발효조는 New Brunswick 모델 3 또는 모델 3000이고 배지 4리터를 함유한다. 발효조는 발효 배지 용적당 공기 1 용적으로 통기되고, 30℃에서 유지된다. 교반 속도는 최소 30% 포화로 세팅된 용존 산소의 양으로 조절된다. 발효 중에 교반 속도는 최고 1000 rpm에 도달하는데 이어서 0-30%의 용존 산소 수준으로 감소한다.

하기 표는 친주 ATCC31461과 점액-형성 돌연변이체 균주 X287의 액침 발효의결과를 보여준다. 폴리사카라이드가 세포에 부착되지 않은 X287 돌연변이체 배양액의 경우, 감소된 점도가 더욱 효율적인 혼합과 통기 및 더욱 낮은 에너지 소비를 초래한다.

균주	지속기간(시간)	A600	IPA 침전물(g/ℓ)	소모된글루코스(g/ℓ)	점도(12 rpm에서의 cp)
ATCC31461	27	16.7	12.8	22.7	21700
X287	32	15.7	15.1	24.4	12900

알콜 침전에 의한 산물 회수 중에 2 용적의 이소프로필알콜이 야생형 균주 ATCC31461에 의해 제조된 겔란 검을 침전시키는 데 필요하다. 반대로 균주 X287에 의해 점액 형태로 제조된 겔란 검은 이소프로필알콜 1 용적만으로도 발효 브로스로부터 침전된다. 또한, 점액 형태로 제조된 겔란 검은 25-30℃에서 이소프로필알콜로 침전될 수 있지만 야생형 겔란은 알콜 첨가 전에 가열 단계를 필요로 한다.

실시예 2

웰란 검이 다수의 돌연변이체 균주로부터 점액 형태로 생성되는데, 이들은 유도되거나 자연 돌연변이유발 및 바람직한 성질의 선택으로 이루어지는, 야생형 친주 ATCC31555에 적용되는 다단계 방법에 의해 수득된 균주 X530 및 X319가 전형적이다.

박테리아 균주 X530은 진탕 플라스크의 액체 배지(실시예 1에 설명)에서 증식한다. 균주 X530은 점액 형태로, 세포에 부착되지 않은 웰란 검을 합성한다. 배양액의 외관은 광학 현미경으로 관찰한다. 야생형 친주는 각 세포에 부착된 캡슐 폴리사카라이드에 의해 함께 유지되는 다세포성 응집체를 형성하지만, 균주 X530의세포는 응집체를 형성하지 않고 단일 세포로 배양 배지에 균일하게 분포되도록 자유롭다. 하기의 측정이 실행되었고 하기에 표에 일람되었다: 배양액 점도(Brookfield LVTDV-Ⅱ 점도계의 경우 스핀들 #4로 12 rpm에서의 센티포이즈), 세포 밀도(600 nm에서 흡광도) 및 이소프로필알콜 2 용적으로 25℃에서 배양 브로스로부터 직접 침전된 바이오매스(폴리사카라이드와 세포)의 중량(g/ℓ).

균주	세포 밀도 A600	배양액 점도 cp	침전된 바이오매스 g/ℓ
ATCC 31555	14.7	6610	7.8
ATCC 31555	14.8	8300	8.3
X530 점액	14.7	5910	9.8
X319 점액	17.7	4960	8.7

또한, 침전은 90℃에서 수행되고 알콜-브로스 혼합물에 침전된 폴리사카라이드의 외관이 기록되었다. 균주 X530의 배양액에 이소프로필알콜 2 용적의 첨가는 25℃ 또는 90℃에서 점착성 덩어리의 형성을 초래하는 반면에, 야생형 친주에 대한 침전된 폴리사카라이드는 25℃에서는 분산된 조각난 덩어리를, 90℃에서는 점착성 덩어리를 형성하였다.

실시예 3

폴리사카라이드 S-88은 몇몇 돌연변이체 균주로부터 점액형으로 생성되며, 이러한 균주 중 X099 및 Z473이 대표적이며, 이들은 유도 또는 자연 돌연변이유발과 바람직한 특성의 선택으로 이루어진, 야생형 친주 ATCC31544에 적용된 다단계 처방에 의해 수득된다.

생장배지는 (물 1 리터당): 1 g 암모늄 니트레이트, 0.5 g 가용성 가수분해 대두 단백질(Marcor로부터의 대두 펩톤), 3.2 g 이염기성 칼륨 포스페이트, 1.6 g일염기성 칼륨 포스페이트, 0.2 g 마그네슘 설페이트(헵타하이드레이트), 미량 미네럴, 및 글루코스를 함유한다. 미량 미네럴은 (최종 배지 1 리터당): 2.7 mg FeCl₃-6H₂O, 1.36 mg ZnCl₂, 1.98 mg MnCl₂-4H₂O, 240 ㎍ CoCl₂-6H₂O, 240 ㎍ Na₂MoO₄-2H₂O, 및 250 ㎍ CuSO₄-5H₂O를 함유한다. 최종 발효배지는 1 리터당 30 g 글루코스를 함유하고, 예비배양 배지는 1 리터당 20 g 글루코스를 함유한다.

동결 세포의 바이얼을 해동시키고 배플링 플라스크내 500 ml의 예비배양액에 가한 다음 약 16 내지 20시간 동안 또는 600 nm에서의 흡광도로 측정한 세포밀도가 약 3 내지 5가 될 때까지 회전 진탕기상 30℃에서 배양한다. 동결 세포는 동일 배지를 함유하는 아가 플레이트 상에서 증식시킨 박테리아 균주의 단일 콜로니로 접종한 선행 예비배양 플라스크로부터 취한 샘플이다.

소정량의 예비배양액을 발효조에 가하여 약 5 내지 10 용적%의 접종이 되게 한다. 발효조는 뉴 브런스윅 모델 III이며 배지 4리터를 함유한다. 발효조를 발효배지 용적당 공기 1 용적으로 통기하고, 30℃에서 유지시킨다. 교반속도는 최소 30% 포화로 세팅한 용존 산소량으로 조절된다. 발효 동안, 교반속도는 최대 1000 rpm에 도달하고 이 뒤에는 0 내지 30%로 용존 산소 수준의 감소가 따른다.

하기의 표는 친주 ATCC31554 및 점액 형성 돌연변이체 균주 X099 및 Z473으로 액내배양한 결과를 보여준다. 폴리사카라이드가 세포에 부착되지 않는 X099 및 Z473 돌연변이체 배양액의 경우, 브로스의 증가된 점도와 IPA 침전물의 증가된 중량에 의해 표시되는 바와 같이 생산성이 증가된다. 야생형 친주 ATCC31554의 경우에 2 용적과는 대조적으로, 배양 브로스 용적당 이소프로필알콜 1 용적만으로 폴리사카라이드가 침전되었다. 균주 X099 및 Z473의 세포는 저속 원심분리(약 5000xG)로 폴리사카라이드로부터 제거될 수 있고, 이는 ATCC31544 야생형 친주로는 가능하지 않았다.

균주	지속기간(시간)	A600	IPA 침전물(g/l)	소모된글루코스(g/l)	점도(12 rpm에서 cp)
ATCC31554	36	14.0	11.6	21.9	8600
X099	36	15.8	15.0	23.1	14300
Z473	36	15.7	12.0	20.8	13100

실시예 4

폴리사카라이드 S-7은 발효로 배양될 때 돌연변이체 균주 X031로부터 점액 형태로 및 ATCC21423에 의해 캡슐 형태로 생산된다. 균주 X031은 ATCC21423 균주로부터 유도된 자연 돌연변이체이다. 생장배지는 (물 1리터당): 1 g 암모늄 니트레이트, 0.5 g 가용성 가수분해 대두 단백질(Marcor로부터의 대두 펩톤), 3.2 g 이염기성 칼륨 포스페이트, 1.6 g 일염기성 칼륨 포스페이트, 0.2 g 마그네슘 설페이트(헵타하이드레이트), 미량 미네럴, 및 글루코스를 함유한다. 미량 미네럴은 (최종 배지 1 리터당): 2.7 mg FeCl₃-6H₂O, 1.36 mg ZnCl₂, 1.98 mg MnCl₂-4H₂O, 240 ㎍ CoCl₂-6H₂O, 240 ㎍ Na₂MoO₄-2H₂O, 및 250 ㎍ CuSO₄-5H₂O를 함유한다. 최종 발효배지는 1 리터당 30 g 글루코스를 함유하고, 예비배양 배지는 1 리터당 20 g 글루코스를 함유한다.

동결 세포의 바이얼을 해동시키고 배플링 플라스크내 500 ml의 예비배양액에 가한 다음 약 16 내지 20시간 동안 또는 600 nm에서의 흡광도로 측정한 세포밀도가약 3 내지 5가 될 때까지 회전 진탕기상 30℃에서 배양한다. 동결 세포는 동일 배지를 함유하는 아가 플레이트 상에서 증식시킨 박테리아 균주의 단일 콜로니로 접종한 선행 예비배양 플라스크로부터 취한 샘플이다.

하기의 표는 친주 ATCC21423 및 점액 형성 돌연변이체 균주 X031로 액내배양한 결과를 보여준다. 폴리사카라이드가 세포에 부착되지 않는 X031 돌연변이체 배양액의 경우, 감소된 점도는 더욱 효율적인 혼합과 통기, 및 더 낮은 에너지 소모롤 유도한다. 균주 X031의 세포는 저속 원심분리(약 5000xG)로 폴리사카라이드로부터 제거될 수 있고, 이는 ATCC21423 야생형 친주로는 가능하지 않았다. 야생형 균주 ATCC21423의 세포는 5 내지 7의 산성 범위내 pH, 승온(약 90 내지 121℃)으로 폴리사카라이드의 부분 가수분해 후에 저속 원심분리로 제거될 따름이다. 중합체내 내부 위치에서 폴리사카라이드 쇄를 파괴함으로써 세포 및 폴리사카라이드 분획이 끊어진다.

균주	지속기간(시간)	A600	IPA 침전물(g/l)	소모된글루코스(g/l)	점도(12 rpm에서 cp)
ATCC21423	48	8.5	17.0	26.0	31100
X031	48	9.6	17.7	30.5	20400

실시예 5

스핑고모나스 돌연변이체 균주 X287 및 이의 친주 ATCC31461을 실시예 1에서와 같이 액침 통기 액체 발효에 의해 배양한다. 하기 표는 발효 지속기간 동안 점도와 용존 산소 변화의 시간 경과를 나타낸다.

균주	지속기간(시간)	용존 산소(%)	점도(cp)
ATCC31461	12	29	250
	24	0	18,000
	48	0	26,400
	72	0	29,700

X287	12	36	725
	24	28	6,460
	48	10	11,000
	72	0	14,200

본 발명의 실시에 있어서 다양한 수정 및 변화가 전술한 본 발명의 상세한 설명을 참작하여 당업자에 예상된다. 결과적으로, 이러한 수정 및 변화도 특허청구의 범위내에 포함시키고자 한다.

본 발명의 박테리아에 의해 박테리아 세포 표면에 부착되지 않은 점액형 엑소폴리사카라이드가 생산된다.

Claims

점액형 스핑간 엑소폴리사카라이드 제공에 유효한 시간 동안 및 그러한 온도에서 스핑고모나스 박테리아를 발효 브로스에서 배양한 다음;

발효 브로스로부터 스핑간 엑소폴리사카라이드를 회수하는 단계를 포함하는, 엑소폴리사카라이드의 생산방법.
제 1 항에 있어서, 스핑고모나스 박테리아가 ATCC PTA-3485(기탁일: 2001년 6월 28일), ATCC PTA-3486(기탁일: 2001년 6월 28일), ATCC PTA-3487(기탁일: 2001년 6월 28일), ATCC PTA-3488(기탁일: 2001년 6월 28일) 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제 1 항에 있어서, 발효가 약 25 내지 약 35℃의 온도에서 약 48 내지 약 96시간 동안 수행되는 방법.
제 1 항에 있어서, 스핑간 엑소폴리사카라이드가 알콜 침전으로 회수되는 방법.
제 4 항에 있어서, 알콜 약 1 내지 약 1.5 용적이 발효 브로스에 첨가되는 방법.
점액형 스핑간 엑소폴리사카라이드 제공에 유효한 시간 동안 및 그러한 온도에서 ATCC PTA-3485, ATCC PTA-3486, ATCC PTA-3487, ATCC PTA-3488 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 스핑고모나스 박테리아를 발효 브로스에서 배양한 다음;

발효 브로스로부터 스핑간 엑소폴리사카라이드를 알콜 침전으로 회수하는 단계를 포함하고,

방법이 발효 브로스 리터당 적어도 약 10 그램 스핑간 엑소폴리사카라이드의 제공에 유효한 엑소폴리사카라이드의 생산방법.
제 6 항에 있어서, 발효가 약 25 내지 약 35℃의 온도에서 약 48 내지 약 96시간 동안 수행되는 방법.
제 6 항에 있어서, 알콜 약 1 내지 약 1.5 용적이 발효 브로스에 첨가되는 방법.
브로스 리터당 스핑간 엑소폴리사카라이드 약 10 내지 약 20 그램을 포함하고, 스핑간 엑소폴리사카라이드가 점액형인 발효 브로스.
제 9 항에 있어서, 발효 브로스가 약 15,000 내지 약 30,000 cp의 점도를 갖는 발효 브로스.
점액형 스핑간 엑소폴리사카라이드 제공에 유효한 시간 동안 및 그러한 온도에서 ATCC PTA-3485, ATCC PTA-3486, ATCC PTA-3487, ATCC PTA-3488 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 스핑고모나스 박테리아를 발효 브로스에서 배양한 다음;

발효 브로스로부터 스핑간 엑소폴리사카라이드를 알콜 침전으로 회수하는 단계를 포함하고,

방법이 브로스 리터당 적어도 약 10 그램 스핑간 엑소폴리사카라이드의 제공에 유효한 방법에 의해 생산된 엑소폴리사카라이드.
제 11 항에 있어서, 발효가 약 25 내지 약 35℃의 온도에서 약 48 내지 약 96시간 동안 수행되는 엑소폴리사카라이드.
제 11 항에 있어서, 알콜 약 1 내지 약 1.5 용적이 발효 브로스에 첨가되는 엑소폴리사카라이드.
ATCC PTA-3485, ATCC PTA-3486, ATCC PTA-3487, ATCC PTA-3488 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 스핑고모나스 균주로부터 유도된 박테리아.
엑소폴리사카라이드가 스핑고모나스 박테리아에 의해 생산되는 점액형 엑소폴리사카라이드.
제 15 항에 있어서, 점액형 엑소폴리사카라이드가 ATCC PTA-3485, ATCC PTA-3486, ATCC PTA-3487, ATCC PTA-3488 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 스핑고모나스에 의해 생산되는 점액형 엑소폴리사카라이드.
제 15 항에 있어서, 점액형 엑소폴리사카라이드가 하기 화학식의 스핑간 엑소폴리사카라이드인 점액형 엑소폴리사카라이드.

화학식

상기식에서,

Glc는 글루코스이고,

GlcA는 글루쿠론산 또는 2-디옥시-글루쿠론산이며,

Rha는 람노스이며,

Man은 만노스이며,

X는 Rha 또는 Man이며,

Z는 Glc 잔기 2에 부착되고 α-L-Rha-(1-4)-α-L-Rha, α-L-Man 또는 α-L-Rha이며,

W는 Glc 잔기 1번에 부착되며 β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc, β-D-Glc-(1-6)-β-D-Glc 또는 α-L-Rha이며,

v 및 y는 0, 0.33, 0.5, 0.67 또는 1이다.
하기 화학식의 점액형 엑소폴리사카라이드.

화학식

상기식에서,

Glc는 글루코스이고,

GlcA는 글루쿠론산 또는 2-디옥시-글루쿠론산이며,

Rha는 람노스이며,

Man은 만노스이며,

X는 Rha 또는 Man이며,

Z는 Glc 잔기 2에 부착되고 α-L-Rha-(1-4)-α-L-Rha, α-L-Man 또는 α-L-Rha이며,

W는 Glc 잔기 1번에 부착되며 β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc, β-D-Glc-(1-6)-β-D-Glc 또는 α-L-Rha이며,

v 및 y는 0, 0.33, 0.5, 0.67 또는 1이다.
제 18 항에 있어서, 점액형 엑소폴리사카라이드가 ATCC PTA-3485, ATCC PTA-3486, ATCC PTA-3487, ATCC PTA-3488 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 스핑고모나스에 의해 생산되는 점액형 엑소폴리사카라이드.
스핑고모나스 박테리아를 액침 통기 액체 배지에서 증식시키고, 용존 산소의 농도가 배양 24시간 후 물의 약 5% 포화를 초과하는, 스핑고모나스 박테리아에 의해 생산된 점액형 엑소폴리사카라이드.
제 20 항에 있어서, 점액형 엑소폴리사카라이드가 ATCC PTA-3485, ATCC PTA-3486, ATCC PTA-3487, ATCC PTA-3488 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 스핑고모나스에 의해 생산되는 점액형 엑소폴리사카라이드.
제 21 항에 있어서, 점액형 엑소폴리사카라이드가 하기 화학식의 스핑간 엑소폴리사카라이드인 점액형 엑소폴리사카라이드.

화학식

상기식에서,

Glc는 글루코스이고,

GlcA는 글루쿠론산 또는 2-디옥시-글루쿠론산이며,

Rha는 람노스이며,

Man은 만노스이며,

X는 Rha 또는 Man이며,

Z는 Glc 잔기 2에 부착되고 α-L-Rha-(1-4)-α-L-Rha, α-L-Man 또는 α-L-Rha이며,

W는 Glc 잔기 1번에 부착되며 β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc, β-D-Glc-(1-6)-β-D-Glc 또는 α-L-Rha이며,

v 및 y는 0, 0.33, 0.5, 0.67 또는 1이다.