CN103087941B - 多糖粘液形成菌的靶基因缺失 - Google Patents

多糖粘液形成菌的靶基因缺失 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多糖粘液形成菌的靶基因缺失。本发明涉及鞘氨醇胶多糖制备领域。更具体地，本发明涉及一种粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其含有至少一种有利于粘液形式的多糖产生的基因修饰，其中所述突变体鞘氨醇单胞菌菌株含有基因M、基因N或这两个基因中的突变、插入或缺失。

Description

多糖粘液形成菌的靶基因缺失
本申请是申请日为2006年2月3日，申请号为“200680009973.5”，发明名称为“多糖粘液形成菌的靶基因缺失”的申请的分案申请。
本申请要求2005年2月4日提交的美国临时申请第60/649,559号的权益。
技术领域
本发明涉及鞘氨醇胶多糖制备领域。特别地，其涉及用于改进制备鞘氨醇胶的菌株的定点基因方法。
背景技术
鞘氨醇单胞菌(sphingomonas)菌株，例如ATCC 53159和ATCC 31461产生大量的荚膜多糖。尽管在某些条件下，多糖可以由细胞释放[5，6]，但在具有丰富碳源的生长过程中(如发酵)，多糖牢固附着于细胞表面。提高丢坦糖胶(diutan)和吉兰糖胶(gellan)发酵产率的尝试受到荚膜性质的多糖的限制，所述荚膜性质的多糖可以破坏营养素的吸收。另外，如果用于多糖的生物合成的位点数量有限，就会有由各细胞能产生多糖的最大量。已经观察到多糖吉兰糖胶与细胞凝集有关，这是由于不产生任何多糖的突变体在悬浮液中均匀地生长[3]。这些细胞凝集块可以干扰多种技术，例如通过光密度测定细胞数量，细胞的离心(例如用于分离DNA或蛋白质)，以及用于多糖纯化的细胞分离或裂解。
先前尚未确定与鞘氨醇单胞菌中多糖附着于细胞表面有关的附着机制和基因。已经分离了以粘液形式产生多糖的鞘氨醇单胞菌菌株ATCC31461、ATCC 31555、ATCC 31554和ATCC 21423的诱导突变体，但是未确定突变基因，且未公开诱导和筛选突变体的方法[10]。已经分离了用于吉 兰糖胶[3，8]、丢坦糖胶[1]和鞘氨醇胶S-88[9]生物合成的基因。许多这些基因的功能通过生物化学试验给出或者通过与数据库例如GenBank中的已知功能的基因的同源性给出。例如，已经鉴定了与四糖重复单元[7，8]的装配和前体dTDP-L-鼠李糖[3，9]的合成有关的基因。预期仅影响多糖附着于细胞表面的基因仍具有产生多糖的表型(即固体培养基和粘性发酵液上的粘液样菌落)。
除了不在基因簇中的用于吉兰糖胶合成的四种基因外，还描述了跨越21kb的18种用于吉兰糖胶生物合成的基因的基因簇。Harding N.E.，Y.N.Patel，and R.Coleman，2004。伊乐藻鞘氨醇单胞菌ATCC 31461中具有吉兰糖胶多糖生物合成所需的基因的结构。J Ind Microbiol Biotech 31：70-82，参考文献3。其DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登录号AY217008)。基因簇中的基因有gelM、gelN以及gelI。构建了大多数相邻基因gelM和gelN的缺失。通过插入灭活gelI基因。gelM-gelN缺失株和gelI突变株显示产生数量有所减少的吉兰糖胶和更具流动性的发酵液，且显示所产生的吉兰糖胶具有与野生株的吉兰糖胶相同的组成。多糖至细胞的附着未有报道。
伊乐藻鞘氨醇单胞菌的gelR、gelS及gelG基因似乎以与S-88sps基因簇中相同的顺序存在于操纵子中，但不邻近18个基因的基因簇中的基因(参考文献3)。GelR蛋白较其S-88同源物稍小(659和670个氨基酸相比)，具有49％的同源性，且与表层蛋白和其他膜蛋白具有同源性。gelR、gelS及gelG基因的DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登录号AY220099)。该报道中未构建gelR的突变(参考文献3)。Yamazaki等报道在基因spsR中具有突变的菌株仍为粘液样，表明它们产生多糖，但多糖不具有流变学或附着于细胞的特征([9]和T.J.Pollock等，DNA segments and methods for increasing polysaccharide production.U.S.Patent No.5,854,034)。
Yamazaki描述了四种鞘氨醇单胞菌菌株的典型突变体，其产生作为粘液而非附着于细胞的多糖。美国专利第6,605,461号。Yamazaki未描述如何筛选粘液表型的诱变培养物。Yamazaki未鉴定出哪个基因或哪些基因被诱变。
Sa-Correia综述了关于吉兰糖胶合成的基因的分离的工作。Sa-Correia I.， A.M.Fialho，P.Videira，L.M.Moreira，A.R.Marques and H.Albano。Gellan gum biosynthesis in Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461：Genes，enzymes and exopolysaccharide production engineering.J Ind Microbiol Biotechnol.29：170-176。Sa-Correia描述了某些基因的部分测序，包括urf32和urf26(＝上述的参考文献3的gelM和gelN)。这些基因的完整序列于2003年4月存放于GenBank(GenBank登录号AY242074)。这些基因的功能未有报道。在GenBank递交中，仅分别将基因urf32和urf26指定为推定的膜蛋白和推定的运输蛋白。未存放gelI或gelR的序列。
Coleman描述了用于丢坦糖胶生物合成的基因的分离和某些基因功能的研究。R.Coleman，2001，Cloning and analysis of Sphingomonas sp.ATCC53159polysaccharide genes.Master’s Thesis，San Diego State University。描述了dpsM和dpsN基因(由Coleman命名为orf3和orf4)，但未指明功能。
描述了来自鞘氨醇单胞菌菌株ATCC 31554的用于S-88多糖的生物合成的基因簇。Yamazaki M.，L.Thorne，M.Mikolajczak，R.W.Armentrout和T.J.Pollock.1996.Linkage of genes essential for synthesis of a polysaccharide capsule in Sphingomonas strain S88.J Bacteriol 178：2676-2687和美国专利第5,854,034号。未描述基因urf32和urf26的功能(dpsM、gelM和dpsN、gelN的同源物)和spsI(gelI、dpsI的同源物)。将spsR基因(gelR、dpsR的同源物)描述为编码与细菌和真菌多糖裂解酶大不相似的蛋白。其DNA序列存放于GenBank中(登录号U51197)。
本领域仍需要改进制备工业上实用的鞘氨醇胶的方法和改进鞘氨醇胶的性质。
发明内容
本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属细菌含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和N的一种基因或两种基因的突变，所述方法包括：分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和/或N的全部或部分；诱导所述片段突变以形成突变的片段；将所述突 变的片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N；分离所述第二种细菌的子代，其中所述突变的片段已经整合入基因组并置换所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。
本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属细菌含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和N的一种基因或两种基因的突变，所述方法包括：分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA的两个非连续片段，其中所述片段侧邻或含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和/或N；将所述两个非连续片段连接在一起；将所述连接的非连续片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N；分离所述第二种细菌的子代，其中所述连接片段已经整合入基因组并置换所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。
本发明提供了一种组合物，其含有丢坦糖胶多糖，所述丢坦糖胶多糖赋予流体对于由菌株ATCC 53159产生的等量丢坦糖胶增加的粘度。在本发明的一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC 53159至少30％。在本发明另一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC 53159至少40％。在本发明又一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC 53159至少50％。在本发明再一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC 53159至少60％。在本发明再一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC 53159至少70％。在本发 明再一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC 53159至少80％。在本发明再一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC53159至少90％。
本发明提供了一种分离和纯化的鞘氨醇菌属细菌，其含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和N的一种基因或两种基因的缺失。在本发明的一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以是伊乐藻菌种。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以不是伊乐藻菌种。在本发明又一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以是与作为ATCC 53159存放的细菌相同的菌种的鞘氨醇单胞菌亚种。在本发明再一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是丢坦糖胶。在本发明再一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是吉兰糖胶。在本发明再一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以不是吉兰糖胶。在本发明再一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是韦兰糖胶。在本发明再一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是鼠李糖胶。本发明的实施方案还提供了一种培养物发酵液，其含有本段上述的所有细菌，并且已经进行从培养物发酵液中除去细菌的步骤。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以不含有外源性DNA。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelM缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsM缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelM和gelN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。
本发明提供了一种制备鞘氨醇胶多糖的方法，其包括在适于制备鞘氨醇胶多糖的条件下于培养基中培养含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和N的一种基因或两种基因的缺失的分离和纯化的鞘氨醇菌属细菌，由此在所述培养基中制备鞘氨醇胶多糖。所述方法还可以包括从所述培养基中的细菌分离鞘氨醇胶多糖的步骤。在本发明的一个实施方案 中，所述分离步骤可通过离心进行。在本发明另一个实施方案中，所述分离步骤可通过沉降进行。在本发明另一个实施方案中，所述分离步骤可包括使用碱处理培养基。在本发明另一个实施方案中，所述物理分离步骤可包括使用酶处理培养基。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是丢坦糖胶。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是吉兰糖胶。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以不是吉兰糖胶。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以是伊乐藻菌种。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以不是伊乐藻菌种。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以是与作为ATCC53159存放的细菌相同的菌种的鞘氨醇单胞菌亚种。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是韦兰糖胶。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是鼠李糖胶。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelM缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsM缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelM和gelN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。
本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因I的突变，所述方法包括：分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因I的全部或部分；诱导所述片段突变以形成突变的片段；将所述突变的片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因I；分离所述第二种细菌的子代，其中所述突变的片段已经整合入基因组并置换所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因I。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由 基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。
本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因I中的突变，所述方法包括：分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段，其中所述片段侧邻或含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因I；将所述突变的片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因I；分离所述第二种细菌的子代，其中所述片段已经整合入基因组并置换所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因I。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。
本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因R的突变，所述方法包括：分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因R的全部或部分；诱导所述片段突变以形成突变的片段；将所述突变的片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因R；分离所述第二种细菌的子代，其中所述突变的片段已经整合入基因组并取代所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因R。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。
本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属细菌含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因R的一种基因或两种基因的突变，所述方法包括：分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段，其中所述片段侧邻或含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的 基因R；将所述片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因R；分离所述第二种细菌的子代，其中所述片段已经整合入基因组并取代所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因R。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。
根据本发明的一个实施方案，提供了一种制备细菌的方法。所述细菌是鞘氨醇单胞菌属，并含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的M、N、I或R基因的一种或多种基因的突变。在某些出版物中(例如参考文献8和9)，所述基因M和N还分别称为urf2、urf26基因(未知的阅读框)。分离了鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段。所述片段含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和/或N或I或R的全部或部分。诱导所述片段中的片段以形成突变的片段。将所述突变的片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌。所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分离了所述第二种细菌的子代，其中突变的片段整合入所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因组并置换的野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇单胞菌可以是伊乐藻菌(伊乐藻菌)或者不是伊乐藻菌。
根据本发明另一个实施方案，提供了制备鞘氨醇单胞菌属细菌的另一种方法，所述鞘氨醇单胞菌属细菌含有选自鞘氨醇多糖生物合成基因簇的基因M、N、I和R的一种或多种基因的突变。分离了鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA的两个非连续片段。所述片段侧邻或包括鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和N。相似地，可分离侧邻基因I或R的片段。将所述两个非连续片段连接在一起。将所述连接的非连续片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌。所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分离了所述第二种细菌的子代，其中所述连接的片段整合入所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合 成基因簇的基因组并置换野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇单胞菌可以是伊乐藻菌或者不是伊乐藻菌。
根据本发明又一个实施方案，提供了一种组合物。所述组合物含有吉兰糖胶多糖，所述吉兰糖胶多糖赋予改进的流变学性质，包括凝胶强度。
根据本发明又一个实施方案，提供了一种组合物。所述组合物含有丢坦糖胶多糖，所述丢坦糖胶多糖赋予液体较由ATCC53159菌株产生的等重的丢坦糖胶增加的粘度。
根据本发明又一个实施方案，提供了分离和纯化的鞘氨醇单胞菌属的细菌。所述细菌含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M、N、I或R的一种或多种基因的突变。所述细菌可以在适于产生鞘氨醇胶多糖的条件下于培养基中培养而在所述培养基中产生鞘氨醇胶多糖。所述细菌的培养物发酵液可以直接或在使用乙醇沉淀之后用作增粘剂或胶凝剂。可选地，所述培养物发酵液可进行下述步骤：在其用作增粘剂或胶凝剂之前从所述培养物发酵液去除细菌或从所述发酵液回收。所述鞘氨醇单胞菌可以是伊乐藻菌或者不是伊乐藻菌。
一经阅读该说明书，对本领域技术人员来说显而易见的这些和其他实施方案提供了本领域用于制备增粘剂和胶凝剂的新的方法、菌株以及组合物。
附图简述
图1.鞘氨醇单胞菌菌株ATCC 31554、ATCC 31461和ATCC 53159中多糖生物合成的基因簇的比较。
图2.S60WTC gelM-gelN突变体的粘液形成特征。
图3.S60WTC gelN和gelI突变体的粘液形成特征。
图4.dpsN的缺失位点的DNA序列(SEQ ID NO：19)，和融合肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。
图5A-5C.dpsN突变体的粘液形成特征。
图6A-6B.dpsM突变体的粘液形成特征。
具体实施方式
在两种鞘氨醇单胞菌菌株中，已经鉴定了控制多糖附着于细菌细胞的的基因。gelM(dpsM)和gelN(dpsN)任一者或二者的缺失或gelI的失活导致多糖作为粘液释放至培养基中而非作为荚膜多糖附着于细胞表面。粘液型多糖的形成使得细菌培养物易于处理，改进了在发酵过程中的混合，可以增加产量，且在某些情况下，改进多糖的流变学性质。定点诱变基于多种原因较随机诱变用于筛选粘液形成突变体更有利，所述多种原因包括速度和无关突变的避免。发现基因gelR的失活可以改进粘液形式的胶凝多糖的流变学性质(凝胶强度)。
可以对任何鞘氨醇单胞菌菌株中的dpsM、dpsN、gelM、gelN和gelI的直向同源物进行灭活以获得粘液形成表型。可以对gelR的直向同源物进行灭活以防止多糖降解，从而导致改进的流变学性质。合适的鞘氨醇单胞菌包括但不限于产生鼠李糖胶(rhamsan，ATCC 31961)、韦兰糖胶(welan，ATCC 31555)、吉兰糖胶(ATCC 31461)和丢坦糖胶(ATCC 53159)的那些菌株，以及产生多糖的菌株S7(ATCC 21423)、S88(ATCC 31554)、S198(ATCC 31853)和NW11(ATCC 53272)。ATCC号指美国典型培养物收藏所(American Type Culture Collection)的菌株的存放号。这些细菌通过伊乐藻菌ATCC 31461和鞘氨醇单胞菌ATCC 53159来举例说明，但也可以使用其他菌株。可使用的合适的鞘氨醇单胞菌包括adhaesiva鞘氨醇单胞菌，aerolata鞘氨醇单胞菌，alaskensis鞘氨醇单胞菌，aquatilis鞘氨醇单胞菌，aromaticivorans鞘氨醇单胞菌，asaccharolytica鞘氨醇单胞菌，aurantiaca鞘氨醇单胞菌，荚膜鞘氨醇单胞菌，chlorophenolica鞘氨醇单胞菌，chungbukensis鞘氨醇单胞菌，下水道鞘氨醇单胞菌，海胆鞘氨醇单胞菌，伊乐藻鞘氨醇单胞菌，faeni鞘氨醇单胞菌，herbicidovorans鞘氨醇单胞菌，koreensis鞘氨醇单胞菌，macrogoltabidus鞘氨醇单胞菌，mali鞘氨醇单胞菌，melonis鞘氨醇单胞菌，游泳池鞘氨醇单胞菌，parapaucimobilis鞘氨醇单胞菌，paucimobilis鞘氨醇单胞菌，pituitosa鞘氨醇单胞菌，樱桃鞘氨醇单胞菌，玫瑰鞘氨醇单胞菌，sanguinis鞘氨醇单胞菌，鞘氨醇单胞菌，stygda鞘氨醇 单胞菌，subarctica鞘氨醇单胞菌，suberifaciens鞘氨醇单胞菌，地下鞘氨醇单胞菌，taejonensis鞘氨醇单胞菌，terrae鞘氨醇单胞菌，trueperi鞘氨醇单胞菌，ursincola鞘氨醇单胞菌，wittichii鞘氨醇单胞菌，xenophaga鞘氨醇单胞菌，yabuuchiae鞘氨醇单胞菌，以及矢野鞘氨醇单胞菌。可根据基因定位和鞘氨醇胶生物合成基因簇中的结构、根据总的同源性和/或根据结构域同源性鉴定直向同源物。通常，与dpsM、dpsN、gelM、gelN、gelI或gelR基因之一的总的同源性的水平将大于44％，常大于55％、66％、77％、88％或98％。直向同源物理想地与这四种基因的至少之一具有大于80％的同源性。
定点诱变可用于在所需的已知靶基因或基因组区产生突变。这消除了随机诱导的诱变或自发诱变的试验与误差。缺失的形成确保了突变将不会复原，例如可能在点(替代)突变和插入突变中可见的。缺失也具有不应用外源性DNA的益处，例如药物抗性标记或其他环境不需要的标记。
基因组DNA的分离片段是不连接在正常情况下与其结合的基因组DNA的DNA，其含有鞘氨醇胶生物合成基因簇的M和/或N、I或R或侧邻的DNA。作为非限制性实施例，所分离的DNA可通过由天然来源纯化、通过合成或通过扩增来获得。所分离的DNA通常位于体外的DNA片段上，但是所分离的DNA还可以位于载体上，例如质粒或转导噬菌体，其含有鞘氨醇单胞菌基因组的所需部分。侧邻的DNA通常来自紧邻M和/或N、I或R的约500bp基因或约1-2kb基因内的基因组区。
本领域任何已知的方法可用于将突变引入所分离的片段，所述片段含有鞘氨醇胶生物合成基因簇的基因M和/或N、I或R的全部或部分。例如，可使用限制性内切酶和再连接非连续的核苷酸而引入缺失。可通过扩增和连接基因的两个非连续片段或侧邻靶基因的DNA的两个非连续片段来形成缺失。可以使用核酸内切酶消化和连接在所分离的片段中产生插入。化学诱变可用于基因组DNA的分离片段。可选择任何诱变方法并根据具体情况而使用。
在诱导突变之后，基因组DNA的片段可再导入受者细菌。通常情况下，但不是一定，受者将是与片段的供者相同的物种。可使用本领域已知 的任何方法用于将外源性DNA导入细菌。合适的方法包括但不限于电穿孔、接合、原生质体形成、氯化钙沉淀和转化、脂质体和病毒转导。可根据具体情况选择和使用任何核酸导入方法。
如果导入受者细菌中的突变基因组DNA片段不具有复制自身的途径，那么它必须在受者细菌中整合入复制子以得到维护。通常，这种整合事件将整合整个摄入的质粒。可以检测导入的DNA上的标记，以鉴定所述DNA已经整合。为了检测整合的实现，可以筛选或选择所导入的DNA上的标记的丧失。实现该目的的合适的标记为本领域已知，且任何标记可用作此处的指示物。为了确定其中所导入的鞘氨醇胶基因取代了受者的野生型基因的分离株，可通过例如PCR测定DNA的大小或序列。
如下文所证明的，通过鞘氨醇胶生物合成基因簇的基因M和/或N产生粘液形式的鞘氨醇胶，突变体可以较附着于细菌细胞上的形式具有改进的流变学性质。所述改进的流变学性质通过相同重量的材料提供更具粘力的能力而得到反映。所述改进可以是轻度的，例如至少5％、10％、15％、20％或25％，或其可为更显著的，相对于由形成荚膜的亲代产生的鞘氨醇胶改进至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。流变学性质可使用本领域已知的任何技术测定。合适的技术包括但不限于自来水溶液中的低切变率粘度(Low Shear Rate Viscosity，LSRV)，和高盐溶液中的海水粘度(Sea Water Viscosity，SWV)。
由例如gelN突变体产生的粘液形式的吉兰糖胶和推定的裂解酶基因gelR的突变相结合导致高凝胶强度的吉兰糖胶的形成。凝胶强度通常大于1000，而荚膜菌株通常产生凝胶强度为600至900但小于1000的吉兰糖胶。
根据本发明的纯化细菌是已经被微生物学纯化的细菌，例如使用液体稀释技术或于固体培养基上划线以形成单菌落。微生物学领域已知的标准技术可用于该目的。
根据本发明的突变体可使用用于亲代菌株相同或相似的技术来培养和增殖。所述突变体的液体培养物性质可以得到改进，允许增加通风和混合。所述突变体的培养物发酵液也可以提供较附着形式的多糖具有较高效 的回收。另外，所述突变体还可以提供较附着形式的多糖具有改进的澄明度的产物。细菌可任选通过过滤、离心或通过沉降从所述突变体产生的多糖去除。所述培养物发酵液可根据需要在去除细菌之前或之后被化学、酶或温度(热或冷)处理。
涉及吉兰糖胶附着于细胞表面的伊乐藻菌ATCC 31461的基因为gelM和gelN(图1，SEQ ID NO：13)和gelI(图1，SEQ ID NO：25)。已经构建了具有大部分基因gelM和gelN缺失从而产生粘液形成表型的菌株。已经构建了gelN特定缺失，并构建了基因gelI的插入。这两种突变均产生了粘液形成表型。在SEQ ID NO：13中，gelM和gelN的编码序列分别位于核苷酸501-1382和1366-2064。在SEQ ID NO：25中，gelI的编码序列分别位于核苷酸501-1403。编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：26。发现基因gelR的缺失导致粘液形式的吉兰糖胶的凝胶强度改进。在SEQ ID NO：27中，gelR的编码序列分别位于核苷酸478-2457。编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：28。涉及丢坦糖胶附着于细胞表面的鞘氨醇单胞菌ATCC53159的基因为dpsM和dpsN(图1，SEQ ID NO：14)，并根据与gelI的同源性推测dpsI。已经构建了dpsM和dpsN的各基因的缺失，两者均产生了粘液形成表型。在SEQ ID NO：14中，dpsM和dpsN的编码序列分别位于核苷酸456-1337和1321-2019。编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：18和17。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，用于吉兰糖胶合成的相同或相似的方法也可以用于丢坦糖胶合成。基因dpsI和dpsR的这种突变可容易构建。在SEQ ID NO：29中，dpsI的编码序列分别位于核苷酸501-1472。编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：30。在SEQ ID NO：31中，dpsR的编码序列分别位于501-2498。编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO.32。
上述公开内容大体上描述了本发明。本文所公开的所有参考文献明确地通过引用并入。通过参考本文提供的下述具体实施例，可以获得更完整的理解，所述实施例仅用于说明目的，不意于限制本发明的范围。
实施例1——吉兰糖胶粘液形成突变体的制备
对于伊乐藻鞘氨醇单胞菌的突变体的构建，使用了名为S60wtc1的ATCC 31461的衍生物，其具有改进的DNA摄取。该菌株可容易地由本领域技术人员制备。PCR扩增用于扩增侧邻基因gelM-gelN的区域。见参考文献3。通过双交换同源性重组，将扩增的片段克隆至pLO2载体中并通过接合导入S60wtc中以置换具有缺失的基因组上的基因gelM和gelN。载体pLO2不在S60wtc中复制，所以对于卡那霉素抗性的最初选择选择了其中质粒通过同源重组整合入染色体的那些菌落。所述载体还含有基因sacB。该基因赋予了对蔗糖的敏感性。这种对蔗糖的选择性可用于筛选丧失质粒的分离株并保留缺失或野生型基因的一个拷贝。
(1伊乐藻菌ATCC 31461具有低的DNA摄取效率，特别是大质粒(约10-7)。分离具有增加的DNA摄取效率的ATCC 31461的自发突变体。怀疑这些少数的细胞为成功的质粒受者，例如广泛宿主范围的质粒pLAFR3，表现受者群体具有增加的摄取该质粒DNA能力的突变。为了使得质粒丧失，在非选项性条件下增殖三种含有pLAFR3的转接合子(即无四环素抗生素)，连续传代约30代。检测了三种独立的质粒处理的菌株(即来自每一起始转接合子的四环素敏感性衍生物)，所有三种显示的增加的接合率(4.2×10-3、0.6×10-2以及1.5×10-2)，表现与野生型菌株相比具有105倍的增加。该增加的接合率是稳定的且可再生的。这些菌株之一被命名为S60wtc。见参考文献3。)
使用提供转移功能的pRK2013，并使用于YM-Sm(25ug/ml)-Km(7.5ug/ml)培养基上选择的转接合子，通过三亲代偶配将含有gelM-gelN缺失区域的质粒导入S60wtc。链霉素防止大肠杆菌菌株的生长。分离卡那霉素抗性质粒整合体。蔗糖敏感性用于选择消除载体的第二重组事件。在非选择性条件下，即无抗生素，将五个分离株传代两次。然后将整分等份铺于含有8％蔗糖的培养基上。分离蔗糖抗性菌落，并检测卡那霉素敏感性。分离基因组DNA，并使用PCR测定哪些Kms分离株保留了缺失。对于缺失的预期大小的扩增片段由四种菌株的基因组DNA产生。于YM培养基上纯化这四种缺失菌株。四种菌株均显示比野生型粘性较小、较软、较平坦且黄色较深。
实施例2——gelM-gelN缺失菌株的特征
在摇瓶发酵中评价gelM-gelN缺失分离株。与较坚固、粘度较大的S60wtc发酵液相比，ΔgelM-gelN培养物发酵液为液体且光滑。与S60wtc纤维相比，由突变菌株使用异丙醇沉淀产生较长、较厚的纤维。然而，缺失突变体的全部可沉淀物质的产量减少22％，且仅产生30％的野生型的发酵液粘度。所产生的吉兰糖胶具有正常的糖、甘油和乙酰基取代基组成。
使用几种技术评价突变体的粘液形成特征，包括显微镜评价、细胞凝集、细胞沉淀物形成以及热沉降试验，如图2所示。
热沉降试验包括在高压灭菌器中加热吉兰糖胶发酵液10分钟以熔化吉兰糖胶，然后将热发酵液转移至大试管中并在95℃过夜培养(以维持发酵液为液体)。对于荚膜菌株，细胞附着多糖并保持悬浮。对于粘液形成菌，细胞未附着多糖并在过夜培养过程中沉降。通过该试验显示gelM-gelN缺失菌株为粘液形成菌株。
对于离心试验，在含有1％葡萄糖的DM2培养基中过夜培养菌株并在Eppendorf离心机中以最大速度进行离心。基因gelM-N的失活导致细胞表面多糖的附着完全丧失，使得细胞可通过离心而沉淀。
通过显微镜评价，大部分S60wtcΔgelM-N细胞游离并具有动力，而S60wtc处于树胶基质中。在细胞培养物中，S60wtcΔgelM-N细胞在悬浮液中生长，而S60wtc细胞形成凝块。
实施例3——吉兰糖胶粘液形成突变体的构建
构建了gelN的缺失用于吉兰糖胶生物合成。将PCR引物设计成扩增gelN基因的上游DNA片段(500bp)和下游DNA片段(401bp)[3]。使用的引物示于表1中。
表1.用于构建gelN缺失突变体的引物
引物SacI-GelN引物1和XbaI-GelN引物2用于将基因gelM的500bp片段扩增为SacI-XbaI片段(共516bp)。引物XbaI-GelN引物3和SphI-GelN引物4用于将atrD基因的401bp片段扩增为XbaI-SphI片段(共418bp)。由于gelM基因的末端与gelN基因重叠了17bp，保留了gelM的终止密码子和gelN的起始密码子，以及gelN的天然终止密码子。将PCR片段顺序连接于质粒载体pLO2的多酶切点的接头(polylinker)[4]，产生带有gelN缺失的克隆pLO2-gelNdeln#1。
然后，通过接合和同源重组将质粒pLO2-gelNdeln#1用于将缺失转移至菌株S60wtc2。S60wtc菌株是作为自发突变体衍生自ATCC31461的菌株，摄取质粒DNA的能力增加[2]。通过卡那霉素抗性选择染色体整合体。随后在无抗生素的情况下培养大约30代使得除去质粒。然后，由于编码质粒的基因sαcB丧失，通过蔗糖(8％)耐性筛选丧失质粒的重组子，然后筛选菌落的卡那霉素敏感性。sαcB基因编码用于由蔗糖合成果聚糖的果聚糖蔗糖酶。果聚糖对细胞具有毒性。丧失基因sαcB的细胞可以在蔗糖条件下生长。耐受蔗糖的分离株可为野生型或缺失。由几个分离株制备基因组DNA，以鉴定较野生型基因而保留gelN缺失的那些分离株，如通过PCR测定。与野生型gelN+分离株的硬菌落相比，具有gelN缺失的分离株具有较软和较稀薄的菌落。
实施例4——gelN缺失突变体的特征
GelN缺失突变体具有与gelM-gelN缺失突变体相似的性质。通过离心可容易地沉淀细胞。在细胞培养物中，gelN缺失突变体在悬浮液中生长，而野生型细胞形成凝块。因此，基因gelN的失活可导致粘液表型，如图3所示。
在摇瓶发酵中，评价gelN缺失突变体的五种单个的分离株。gelN突变体的平均产量(全部可沉淀物质，TPM，1.10g/100ml)与S60wtc对照的平均产量(1.08g/100ml)具有可比性。在20LApplikon发酵罐中使用含 有有机氮和无机氮、盐和玉米糖浆的培养基评价gelN突变体。使用异丙醇沉淀吉兰糖胶多糖，并干燥和称重。突变体的全部可沉淀物质的平均产量为野生型对照的平均产量的94％，然而，发酵液粘度减少约40％。发酵液粘度的这一减少促进了发酵罐中的混合。
表2.gelN突变体的发酵特征
在Brookfield LVF粘度计中使用4号转子在60rpm下测量粘度。
实施例5——产生具有改进质量的吉兰糖胶粘液的突变体的构建
吉兰糖胶的粘液突变体具有较低的发酵液粘度，如实施例4所述，这促进发酵罐中的混合。胶凝多糖在加热和冷却之后形成凝胶，吉兰糖胶由于其独特的结构和流变学性质而用于多种食品用途中。因此，评价了由粘液突变体产生的吉兰糖胶的凝胶强度。使用柱塞破坏或破裂所制备的凝胶表面来测定凝胶强度。
(2见脚注1关于摄取DNA能力增加的的突变体的用途。)
将吉兰糖胶发酵液调整至pH4.6(防止去乙酰化)并通过加热至约100℃持续几分钟来灭菌。通过添加三倍体积的异丙醇沉淀吉兰糖胶产物，并在60℃下干燥纤维2小时并研磨。
通过在去皮重的600ml不锈钢烧杯中添加2ml 0.3M CaCl2·2H2O原溶液至295ml去离子水来制备钙溶液。在700rpm下搅拌溶液的同时，添加3.0g吉兰糖胶产物并使得分散1至2分钟。将烧杯置于预热的94-95℃水浴中，覆盖并加热15分钟，然后搅拌3分钟。使用加热的去离子水将溶液重量调整至300g，混合并然后在94-95℃下放置4分钟。将溶液转移至 六个环形模(ring molds)(0.5英寸高，1.375英寸外径，0.125英寸壁厚)，并使用塑料盖板覆盖并使得在室温(20-21℃)下冷却20至24小时。从模子中取出圆盘，将其放置于有机玻璃盘上。在TA-TX2Texture Analyzer中使用Kobe柱塞(TA-19)以1.0mm/s测定凝胶强度或断裂的力(以g/cm2记录)。
粘液突变体的吉兰糖胶较野生型荚膜菌株的吉兰糖胶具有较低的凝胶强度，如表4所示。该结果与产生粘液形式的丢坦糖胶的ATCC 53159突变体相比，具有改进的流变学性质特征，如实施例11所述。认为粘液形式的吉兰糖胶可被伊乐藻菌产生的吉兰糖胶裂解酶降解。因此，构建了具有基因gelR缺失的菌株，其产生与降解多糖的蛋白质如裂解酶具有同源性的蛋白质。
在伊乐藻菌菌株S60wtc和GBAD-1菌株中构建了gelR缺失(美国专利申请第20060003051号[11])。将PCR引物设计成扩增基因gelR的上游DNA片段(502bp)和下游DNA片段(435bp)。所使用的PCR引物示于表3。
表3.构建gelR缺失的引物
引物SacI-GelR引物1和XbaI-GelR引物2用于将gelR的498bp上 游片段扩增为SacI-XbaI片段(共502bp)。引物XbaI-GelR引物3和SphI-GelR引物4用于将gelR的419bp下游片段扩增为XbaI-SphI片段(共435bp)。使用限制性酶消化PCR片段并将其顺序地连接于质粒载体pLO2的多酶切点的接头[4]，产生带有gelR缺失的克隆pLO2-gelRdeletn#4。
通过使用提供转移功能的辅助质粒pRK2013，由大肠杆菌DH5α接合，将不能在鞘氨醇单胞菌中复制的质粒pLO2-gelRdeletn#4转移至伊乐藻菌菌株S60wtc和GBAD-1[2]。于含有卡那霉素和链霉素的YM培养基上通过卡那霉素抗性筛选染色体整合体(反向选择大肠杆菌)。随后在无抗生素的情况下培养鞘氨醇单胞菌整合体大约30代，使得去除质粒。由于丧失编码基因sacB的质粒，通过蔗糖耐性筛选已丧失质粒的重组子，筛选菌落的卡那霉素敏感性。PCR用于检测哪些分离株保留了gelR缺失。
然后将gelN缺失转移至GBAD-1菌株的gelR缺失突变体，如上实施例3所述。质粒pLO2-gelNdeln#1用于通过接合和同源性重组将gelN缺失转移至GBADgelR。通过于含有Km(20ug/ml)和Sm(25ug/ml)的YM琼脂上筛选染色体整合体的卡那霉素抗性。随后在无抗生素的情况下培养使得去除质粒。由于丧失编码基因sacB的质粒，通过蔗糖耐性筛选已丧失质粒的重组子，然后筛选这些菌落的卡那霉素敏感性。
gelR缺失突变体较野生型菌株表现有不同的菌落形态。gelR缺失菌株与具有透明边缘的S60wtc或GBAD-1的gelR+的较光滑的树胶状菌落相比具有较小的粗糙树胶状菌落。gelN-gelR缺失突变体具有与gelN粘液突变体相似的菌落形态。
实施例6——gelN-gelR突变体的特征
在20LApplikon发酵罐中使用含有有机氮和无机氮、盐和玉米糖浆的培养基评价这些菌株。使用异丙醇沉淀吉兰糖胶多糖，干燥并称重。通过实施例5中所述的方法测定凝胶强度。GBAD-1gelNgelR菌株产生的吉兰糖胶的凝胶强度较gelN粘液突变体或野生型荚膜菌株产生的吉兰糖胶的凝胶强度高。
表4.突变体的吉兰糖胶的流变学性质
实施例7——gelI突变体的构建
构建了基因gelI的插入突变。将PCR引物设计成扩增基因gelI的插入片段(见参考文献3)。将扩增的片段克隆至pLO2质粒载体并通过接合导入S60wtc，在YM--Sm(25ug/ml)-Km(7.5ug/ml)培养基上筛选。筛选那些转接合子的卡那霉素抗性，所述转接合子具有通过同源重组而插入基因gelI从而使该基因失活的质粒。gelI突变体具有改变的菌落形态，与gelM-gelN和gelN缺失菌株的菌落形态相似，即粘性但较软的菌落。
实施例8——gelI突变体菌株的特征
在摇瓶发酵中评价gelI突变体。所述突变体与野生型菌株相比具有粘性较小的发酵液，且全部的可沉淀物质的产量减少约20％。所产生的吉兰糖胶具有正常的糖、甘油和乙酰基取代基组成(参考文献3)。
使用几种技术评价gelI突变体的粘液形成特征，包括上述的显微镜评价、细胞凝集、细胞沉淀形成以及热沉降试验。gelI插入突变体具有与gelM-gelN和gelN缺失突变体相似的特征。显微镜评价显示细胞游离并且有动力。在细胞培养物中，gelI突变体在悬浮液而非凝块中生长。通过离心，细胞容易从DM2培养基沉淀。在热沉降试验中细胞也很好地沉降。因此，基因gelI的突变也产生了粘液表型，如图3所示。
实施例9——丢坦糖胶粘液形成突变体的制备
鞘氨醇单胞菌ATCC 53159(S-657)产生具有与吉兰糖胶相似的结构的多糖(丢坦糖胶)(即其具有葡萄糖-葡萄糖醛酸-葡萄糖-鼠李糖重复单位)，但具有附着于一个葡萄糖残基的两个鼠李糖残基的侧链。丢坦糖胶具有两个乙酰基取代基，并缺少甘油基团。丢坦糖胶可用作油田和水泥应用中的增粘剂。鞘氨醇单胞菌菌株产生作为荚膜牢固附着于细胞表面的多糖。附着的确切机制尚属未知。荚膜可通过破坏氧摄取而限制繁殖力。多糖的功能可通过其附着于细胞而非游离于溶液中而受阻碍。
菌株构建
构建了鞘氨醇单胞菌ATCC 53159的相应基因dpsM和dpsN的缺失，其产生丢坦糖胶(S-657)。独立地使各基因缺失，并测定对荚膜至粘液的影响。简言之，PCR用于扩增侧邻靶基因DNA的同源的两个片段。将这些片段克隆至窄宿主范围的质粒pLO2，所述质粒pLO2不能在鞘氨醇单胞菌中复制并含有两个选择性标记kanR和sacB。对于其中质粒已整合入染色体中的一个同源性区域的细胞进行卡那霉素抗性筛选。然后在非选择性条件下，培养卡那霉素抗性菌株，使得通过二次重组丧失质粒。通过对蔗糖的耐性筛选质粒的丧失。sacB基因编码用于由蔗糖合成果聚糖的果聚糖蔗糖酶。果聚糖对细胞具有毒性。丧失基因sαcB的细胞可以在蔗糖的条件下生长。耐受蔗糖的分离株可为野生型或缺失。通过PCR确认缺失的存在。检测突变体的粘液或荚膜产生。在最终的菌株中无外源性DNA、质粒或抗生素抗性基因。
dpsN和dpsM缺失菌株的详细构建
使用与所述的伊乐藻菌缺失突变体相似的基因置换策略，在质粒上构建dpsM和dpsN的缺失并将其转移至ATCC 53159的基因组[3]。PCR用于扩增侧邻靶基因的DNA区域，然后将片段克隆至质粒pLO2中[4]，然后将其用于替换染色体中靶基因的缺失。用于PCR的引物示于表5。将用于克隆的限制性位点(以斜体字显示)添加至引物的末端。
表5.用于构建缺失突变体的引物
将缺失构建体设计成保持剩余用于丢坦糖胶合成的基因完整无缺。对于dpsN缺失来说，引物SacI-DpsN引物1和XbaI-DpsN引物2用于将dpsM基因的497bp片段扩增为SαcI-XbαI片段(共513bp)。引物XbaI-DpsN引物3和SphI-DpsN引物4用于将基因atrD的396bp片段扩增为XbaI-SphI片段(共413bp)。由于基因dpsM的末端与基因dpsN的起始部重叠17bp，保留dpsM的终止密码子和dpsN的起始密码子，以及dpsN的天然终止密码子。因此，该构建体导致形成13个氨基酸的小肽，如图2所示。将PCR 片段顺序地连接于质粒载体pLO2的多酶切点的接头[4]，产生带有dpsN缺失的克隆pLO2-dpsNdeln#3。
通过使用提供转移功能的辅助质粒pRK2013，由大肠杆菌DH5α接合[2]，将不能在鞘氨醇单胞菌中复制的这种质粒pLO2-dpsNdeln#3转移至鞘氨醇单胞菌菌株ATCC 53159。于含有7.5ug/ml卡那霉素和25ug/ml链霉素的YM培养基上筛选染色体整合体的卡那霉素抗性(反向筛选大肠杆菌)。随后在无抗生素的情况下培养鞘氨醇单胞菌大约30代，使得去除质粒。然后，由于编码基因sαcB的质粒丧失，通过蔗糖(8％)耐性筛选已丧失质粒的重组子，然后筛选菌落的卡那霉素敏感性。由几个分离株制备基因组DNA，以鉴定较野生型基因而保留dpsN缺失的那些分离株，如PCR所测定。
相似地，构建dpsM的缺失。引物SacI-DpsM引物1和XbaI-DpsM引物2用于将基因dpsE的474bp片段扩增为SacI-XbaI片段(共490bp)。引物Xbai-DpsM引物3和SphI-DpsM引物4用于将基因dpsN的509bp片段扩增为XbaI-SphI片段(共525bp)。由于基因dpsM的末端与dpsN基因的起始部重叠了17bp，保留了dpsM的终止密码子和dpsN的起始密码子。将终止密码子并入XbaI克隆位点。7氨基酸肽可由dpsM起始位点形成。将PCR片段顺序地连接于质粒载体pLO2[4]的多酶切点的接头，产生带有dpsM缺失的克隆pLO2-dpsMdeln#1。将该质粒接合至ATCC 53159，筛选卡那霉素抗性整合体，随后在无抗生素情况下培养，并检测蔗糖耐受性，筛选卡那霉素敏感性重组子。从所筛选的重组子分离基因组DNA，并通过PCR筛选缺失的存在。
实施例10——丢坦糖胶粘液形成突变体的特征
几个试验的结果显示dpsM和dpsN缺失均导致荚膜形成菌至粘液形成菌的转变。
1.在高碳发酵培养基中生长约16小时的两种缺失突变体(#3和#5)和两种dpsM缺失突变体(#1and#5)的显微镜评价表明来自这些突变体的细胞没有形成鞘氨醇单胞菌荚膜菌株S-657特有的大的细胞凝集物。
2.野生型ATCC 53159细胞在含有1％葡萄糖的已知成份培养基(DM2)中生长24小时，并稀释10倍，形成可见的凝块，而dpsM和dpsN粘液突变体形成与非粘液样菌株DPSI相似的均匀悬浮液。
3.在含有1％葡萄糖的DM2培养基中生长24小时的培养物的离心显示，dpsM和dpsN粘液突变体的细胞可被沉淀，而野生型ATCC 53159(S-657)的那些细胞仍附着多糖并因此没有沉淀。
在摇瓶发酵中，与野生型对照相比，dpsN缺失突变体的六种独立分离株显示全部可沉淀物质平均增加5.4％。在20LApplikon发酵罐中使用含有有机氮和无机氮、盐和不同碳浓度(3-5％)的培养基评价所选择的dpsN和dpsM突变体分离株。使用异丙醇沉淀多糖，并干燥和称重。dpsN突变体始终表现较野生型荚膜对照菌株全部可沉淀物质轻度增加。dpsM突变体提供了更为变异的和大体较低的繁殖力，如表6所示。
表6.dps突变体多糖产量的增加
实施例11——丢坦糖胶粘液形成多糖的特征
测定了通过使用异丙醇沉淀来从这些发酵物中回收的丢坦糖胶的流变学性质，如表7所示。dpsM和dpsN粘液突变导致丢坦糖胶的粘度改进。
表7.粘液突变体的丢坦糖胶的流变学性质
还观察到粘液突变体的纤维质量(如长度)得到改进。由于多糖分子在溶液中游离，而非附着于细胞表面，促进了这些分子的沉淀。低切变率粘度测量
低切变率粘度是在3rpm下0.25％丢坦糖胶溶液的粘度。通过在10升去离子水中溶解10gNaCl和1.47g CaCl2·2H2O制备标准或合成的自来水。直接于400ml高型烧杯中称量4.5g聚乙二醇(PEG)200。称量0.75g等份的丢坦糖胶产物，并在PEG200中分散，形成均匀的液浆。将299ml合成的自来水添加至烧杯中，并在800±20rpm下搅拌混合物约4小时。从搅拌台去除烧杯，并放置于25℃水浴中，使得放置30分钟。使用BrookfieldLV Viscometer使用2号转子在3rpm下测量粘度。
海水粘度测量
使用下述步骤测量海水粘度。通过每980g去离子水溶解41.95g海盐(ASTM D-1141-52，来自Lake Products Co.，Inc.Maryland Heights，Missouri)制备海水溶液，根据需要使用HCl或NaOH调整pH至8.2。将307g海水溶液转移至混合杯中，将0.86g丢坦糖胶产物经15-30秒缓慢添加至混合杯中，并使得在9B5型Fann Multi-Mixer(Fann Instruments，Inc，Houston TX)中于11,500rpm下混合45分钟。添加3滴Bara Defoam(NL Baroid/NL Industries，Inc.，Houston，TX)并再继续搅拌30秒。从混合器去除混合杯并将其浸于冷水中以降低液体的温度，然后将其置于25℃恒温水浴中。将溶液转移至400ml高型烧杯。
在低速(3rpm)下混合的同时，测量Fann粘度(Fann粘度计，35A型)。从刻度盘读取切应力值，并记录为在3rpm下的SWV值。
还在Brookfield LV DV-II或DV-II粘度计上使用LV-2C转子测量粘度。在0.3rpm下测量0.06sec-1读数。
实施例12——材料和方法
培养基。每升YM含有：3g酵母提取物，5g蛋白胨，3g麦芽提取物，以及10g葡萄糖。每升DM2培养基含有：2.68g K2HPO4，1.31g KH2PO4，2.0g NH4SO4，0.1g MgSO4·7H2O，15mg CaCl2·2H2O，8.34mg FeSO4·7H2O，0.05mg MnCl2·4H2O，0.03mg CoCl2·6H2O，0.8mg CuSO4·5H2O，0.02mgNa2MoO4·2H2O，1.0mg ZnSO4·7H2O，0.2mg H3BO3以及10g葡萄糖。每升吉兰糖胶烧瓶发酵培养基含有：0.23g NaCl，0.165g CaCl2·2H2O，2.8gK2HPO4，1.2g KH2PO4，1.9g NaNO3，1.0g N-Z-胺型EKC(Sheffield Products)，36.46g Star-Dri玉米糖浆，2.5mg FeSO4·7H2O，24μg CoCl2·6H2O以及0.1g MgSO4·7H2O。
粘液的离心试验。在含有1％葡萄糖的DM2培养基中于30℃培养菌株约24小时，在350rpm下摇动，然后在Eppendorf离心机中以最大速度(10,000rpm)离心5分钟。
热沉降试验。在吉兰糖胶烧瓶发酵培养基中培养菌株。在高压灭菌器中加热发酵液10分钟以液化吉兰糖胶。然后将热发酵液转移至大试管中并使得在95℃过夜沉降(以维持发酵液为液体)。对于荚膜菌株，细胞附着多糖并保持悬浮。对于粘液形成菌，细胞未附着多糖并且在过夜培养过程中沉淀。
PCR扩增。使用了来自Stratagene(LaJolla，CA)的高保真度PCR酶“PfuUltra热启动DNA聚合酶”。
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所引用的每一参考文献的内容明确地并入本文。
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Claims (12)

1.一种粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其含有至少一种有利于粘液形式的多糖产生的基因修饰，其中所述突变体鞘氨醇单胞菌菌株含有基因dpsM、基因dpsN或基因dpsM和dpsN中的突变、插入或缺失。
2.权利要求1所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其中所述多糖是丢坦糖胶。
3.权利要求2所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其中所述丢坦糖胶是粘液形式的多糖。
4.权利要求3所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其中所述丢坦糖胶含有比由野生型菌株ATCC 53159天然产生的丢坦糖胶更长的纤维。
5.权利要求3所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其中所述丢坦糖胶赋予流体相对于由野生型鞘氨醇单胞菌菌株ATCC 53159天然产生的等量丢坦糖胶增加的粘度。
6.权利要求5所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其中所述增加的粘度为大于由野生型菌株ATCC 53159产生的等量丢坦糖胶至少30％。
7.权利要求5所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其中所述增加的粘度为大于由野生型菌株ATCC 53159产生的等量丢坦糖胶至少50％。
8.权利要求5所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其中所述增加的粘度为大于由野生型菌株ATCC 53159产生的等量丢坦糖胶至少80％。
9.权利要求5所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其中所述增加的粘度为大于由野生型菌株ATCC 53159产生的等量丢坦糖胶至少90％。
10.权利要求1所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，还含有将所述菌株从荚膜形成菌转变成粘液形成突变体的基因gelI或dpsI中的第二种基因突变、插入或缺失。
11.权利要求1所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，还含有基因gelR或dpsR中的第二种基因突变、插入或缺失。
12.权利要求1所述的粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其中所述突变体鞘氨醇单胞菌菌株是野生型鞘氨醇单胞菌菌株ATCC 53159的变体，其中所述变体已被基因改造以消除dpsM、dpsN基因或这两个基因的表达。
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