JPS62186797A - 新規ヘテロ多糖の生合成法 - Google Patents

新規ヘテロ多糖の生合成法

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JPS62186797A
JPS62186797A JP61241202A JP24120286A JPS62186797A JP S62186797 A JPS62186797 A JP S62186797A JP 61241202 A JP61241202 A JP 61241202A JP 24120286 A JP24120286 A JP 24120286A JP S62186797 A JPS62186797 A JP S62186797A
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デビッド・アイ・スターリング
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野） 本発明は、任意メチロトローフ性細菌の新菌種であるメ
チロフィルス・ビスコゲネス（ＭｅＬｌ＋ｙｌｏｐｈｉ
ｌｕｓ　ｖｉｓｃｏｇｅｎｅｓ）に関する。メチロフィ
ルス・ビスコゲネスの菌株＾ＴＣＣ３９８９３は、リブ
ロース−リンｆａ経路によりメタノールを同化して、好
気性１合度条イ′（下で細胞外ヘテロ多糖ポリ５４を形
成することができる。 （従来の技術） Ｃ１化合物からのｊｉｉ細胞タンパク質（ＳＣＰ）の製
造については、このＩＯ年間に学術的もしくは工業的ム
実験室で広く研究されてきた。三菱瓦斯化学（１１，ヘ
キスト社、ＩＣ１社などの企業がパイロットプラントで
の研究を行ってきたが、現在ではＩＣ１社のみが本格規
模のＳＣＰ工場を稼動させている。ＩＣ１社のこの製品
は［ブルティーン（ｒ’ｒｕｔｅｅｎ）　Ｊなる登録商
標で呼ばれ、この製品は絶対メチロトローフ性の細菌で
あるメチロフィルス・メチロトローフ（Ｍｅｔｈｙｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ　ｍｅｔｈｙｌｏＬｒｏｐｈｕｓ）の酩酊
により製造され、これは最終的に分離・乾燥されて粉末
もしくは顆粒状で得ている。 メチロフィルス・メチロトロフスはホルムアルデヒド固
定のりブロース−リン酸経路（ＲＭ　Ｐ　’）を利用す
る絶対メチロトローフである。メチロフィルス・メチロ
トロフスの菌株Ａｓ−１は、単一の極性鞭毛を持ったダ
ラム陰性の非着色桿菌である。 ＳＣＰの生産において、メタノール供給原料は操業コス
１−の最も大きな割合を占めており、従って微生物増殖
速度の増大はＳ　Ｃｌ）生産の操業コスＩ・に直接彫り
してくる。この理由により、ＩＣ１社は、組換えＤＮＡ
技術を応用してメチロフィルス・メチロトロフスの細菌
のゲノムを変質さ口°ることにより菌体収量を増大させ
ている。大腸菌（Ｅｓｃｂｃｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
から得たより効率的なグルタミン酸・デヒロドゲナーゼ
窒素同化系に対する遺伝子をクローニングし、メチロフ
ィルス・メチロ１０フスの菌株に挿入・した。この菌株
は予めＤＮＡ突然変異により遮断されたその効率がより
小さいグルタミン酸・シンターゼ窒素同化系を有してい
た（Ｊ、　Ｗｉｎｄａｓｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２８７，３９６（１９８０）に記載〕。 メタノールは一般に単細胞タンパク質製造用の基質とし
て検討されているが、メタノールをｓｃＰ製造に通（δ
とする因子により、これはまたエキソ多糖類のような蓄
積された細胞外代謝産物の製造用の供給原料としても有
用である。メタノールを付加価値のある製品に転化させ
る多くの微生物学的方法が発表されているが、それらは
一般にアミノ酸のような低容積／高価格の化合物である
。 たとえば、Ｊ、　ＢｏｌｂｏＬおよびＣ１＾ｎ　ｔｈｏ
ｎｙは、Ｉ’ｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌ、　５＋４３　（１９７８）に、おいて−シ
ュードモナス　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　Ａ　Ｍ　
１のピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠乏変異沫がメタノー
ルでの増殖中にアミノ酸であるアラニンとバリンを蓄積
できることを見出した。Ｙ、　Ｔａｎ１　らは、Ａｇｒ
ｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｃｍ、、　４２．２２７５　
（１９７Ｂ）に、アルスロバクタ−・グロヒ゛フォルミ
ス（八ｒｔｈｒｏｈａｃｔｏｒ　ｇｌ。 ｂｉｆｏｒｍｉｓ）の菌株を使用してメタノールから５
．２ｇ／ｆまでの１．−セリンが製造されることを述べ
ている。しかし、日常ｌｉ’４費型の大贋化学物質への
メタノールの止転化に関しては現在まだ報告がない。 （発明が解決しようとする問題点） よって、本発明の目的は、ＣＩ化合物を蓄積した量の細
胞外代謝産物に止転化させる酩酊方法を提供することで
ある。 本発明の別の目的は、メタノール基質を蓄積した量のエ
キソ多糖に生酔化させるための、嘗速増殖培地を提供す
ることである。 本発明のさらに別の目的は、新規な任意メチロトローフ
性菌種を提供することである。 本発明のまた別の目的は、菌株ＡＴＣＣ３９８９３の菌
学的性質を有するメチロトローフ性細菌菌株を提供する
ことである。 本発明のさらに別の目的は、水溶液に擬似塑性およびチ
キソトロピー性を付与するのに適した性質を示す新規な
ヘテロ多糖を提供することである。 本発明のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明
、！３よび実施例から明らかとなろう。 （問題点を解決ずろための下段） 本発明の１」的は、下記の菌学的性質：（ａｌ好気性、
グラｌ、陰性、桿状、運動性で、トオ性鞭毛を持った細
胞； （Ｉ））リブロース−リン酸経路によりメタノールを同
化することができるメチロトローフ性：（し）フルクト
ースにより増殖可能；および（ｄｌ約３０〜４３℃の培
地温度で最適増殖速度；で特徴づけられる新規な細菌菌
株の提供により達成される。 −ａに、本発明の新規な細菌菌株は、グルコース・デヒ
ドロゲナーゼ活性を示す。 別のＢ様において、本発明は菌株ΔＴＣＣ３９１１９３
の菌学的性質を有する細菌培養菌を提供し、この培養菌
はメタノールを細胞外に蓄積するヘテロ多糖に好気的に
止転化させることができる。 寄託番号＾ＴＣＣ３９８９３の菌株の二次培養物は、米
国メリーランド州ロックビル所在のアメリカン・タイプ
・カルチャー　コレクション（八ＴＣＣ）の永久微生物
コレクションから請求により入手することができる。こ
の微生物の寄託は、特許手続き上のブダペスト条約の要
件に従っている。 菌株＾ＴＣＣ３９８９３の菌学的性質を有する細菌菌株
は、メチロフィルス・メチロトローフのような既知のメ
チロトローフ性菌種のいずれにも属さない。分類学的同
定のために、ＡＴＣＣ３９８９３菌株の菌学的性質を有
する細菌菌株を包含するこの新規な任意メチロトローフ
性の菌種をメチロフィルス・ビスコゲネスと命名した。 本明細書で使用した「メチロトローフ」なる用語は、１
もしくは２以上の炭素原子を含有するが、炭素−炭素結
合を含有していない炭素化合物により非独立栄養的に増
殖することのできる微生物を意味する。「独立栄養的」
とは、二酸化炭素基質による増殖を意味する。 本明細書において「任意メチロトローフ」とは、１種も
しくは２種以上の従属栄俣基’ｆｆ（例、フルクト−ス
）上で増殖できるメチ＋：＋　ｌ−ローフを意味する。 本明細書で使用した「ＣＩ化合物」なる用語は、メタノ
ール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ホルムアミド、−酸化
炭素、ジメチルエーテル、メチルアミン、ジメチルアミ
ン、トリメチルアミンおよびトリメチルアミンＮ−オキ
シドのように、炭素−炭素結合を全く含有しない有機化
合物を意味する。 本明細書において、「エキソ多糖」とは、キサンにトサ
ンタン・ガム）で例示されるような、醗酵培地中に細胞
外代謝産物として蓄積する多糖を意味する。 本明細田において、「ヘテロ多糖」とは、少なくとも２
種類の異なる単糖単位、たとえばマンノースおよびガラ
クト−ス、から構成される多＄Ｊ、’ｉを意味する。 本明細書で使用した［リブロース−リン酸経路Ｊ　　（
１？ＭＰ）　とは、ホルムアルデヒド３分子が縮合して
ピルビン酸１分子か、またはジヒドロキンアセ１−ンリ
ンｆｌｌ１分子のいずれかを生成する」：化学回路を意
味する。 リブロース−リン酸経路およびその変形例の解明に関す
る生化学の文献には、Ｊ、　ＳＬｒｏｅｍ　ａｔ　ａｔ
、。 バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、
）、　１４４、４（ｉ５　（１９７４）　　；　　ｃ、
＾ｎＬｂｏｎｙ、サイエンティフィック・プログレス（
Ｓｃｉ、　Ｉ’ｒｏｇ、）（　６ムＩＧ７　（１９７５
）；およびＣｏ１ｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、バイオケミカル
・ジャーナル（Ｉｌｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）、　Ｌ１８
．５１３　（＋９７５）がある。 リブロース−リン酸経路には、Ｇ−ホスホグルコン酸デ
ヒドラーゼ／ホスホ−２−ケト−３−ジグルコン酸アル
ドラーゼ；フルクトースビス＋１ン酸アルドラーゼ；グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ；３−へキスロ
ースリン酸シンターゼ；ホスホフルクトキナーゼ、ホス
ホグルコイソメラーゼ；ホスホ−３−へキスロースイソ
メラーゼ；ホスホリボイソメラーゼ；リブロース−５−
リン酸３−エピメラーゼ；トランスアルドラーゼ；トラ
ンスケトラーゼ；セドヘプツロースビスリン酸アルドラ
ーゼ；およびセドヘプツロース−１，７＝ジホスフアタ
ーゼを包含する酵素が関与している。 ＲＭＰ回路においては、３分子のホルムアルデヒドが３
分子のりブロース５−リン酸と効果的に縮合されて３分
子のフルクトース６−リン酸が生成し、次いでこの化成
物からこの回路により３分子のりブロース５−リン酸が
再生されるので、全体としては１分子のジヒドロ−トン
アセトンリン酸もしくはピルビン酸が生産されろ。かか
る代謝産物は、細胞生合成の基質として機能する。 この回路の２つの重要な酵素は、ホルムアルデヒドとり
ブロース５−リン酸との縮合、およびこの生成物のツル
クト−ス６−リン酸への転化の各反応を触媒する酵素で
あるヘキスロースリン酸シンクーゼおよびヘキスロース
リン酸イソメラーゼであると考えられる。Ｒ’ＭＰ回路
の２つの認められた変安回路、すなわちジヒドロートン
アセトンリン酸を生成するフルクトースビスリン酸変異
回路と、ピルビン酸を生成するエントナー・ドゥトロフ
変異回路がある。 メチロフィルス・ビスコｌｉ 米国テキサス州ビシロノプ所在のメタノール製造工場の
操業部イ」近で採取した土壌および水の８１℃料を使用
して一連の分離を行った。試料をまずメタノール利用微
生物の存在についてスクリーニングした。 各試料の一部を、メタノール（０，５χＶ／ν）ならび
に適当な栄養培地、たとえば第１表に例示した無機塩類
（ＭＳ）培地＋塩化アンモニウム１ｇ／ｌを入れた２５
０　ｍｌの三角フラスコに接種した。このフラスコを、
３０〜５５℃の範囲内の各種温度で保温して培養を行っ
た。増殖の表示となる検出可能ｆ
【混濁が認められたら
、各試料を２ｍｌづつ取り出し、これを使用して上と同
様の培地を入れた滅菌フラスコにそれぞれ接種した。最
初の各試料について、次代の二次培養液を多数採取し、
次いでこの培養液を平板寒天培地で画線培養して、独立
した微生物誘導コロニーを得、これからメタノール同化
微生物の純粋培養菌を得た。このようにして＾ＴＣＣ３
９８９３菌株を単離し、これを生物学的に純粋な培養菌
として得た。 メチロフィルス・ビスコゲネスの各菌株は新規な組合・
已の性質を示し、それによりこれらは他のメチロトロー
フ性細菌から区別される。ＡＴＣＣ３９８９３菌株など
のメチロフィルス・ビスコゲネス種の細菌は、Ｃ９同化
のりブロース−リン酸経路を利用し、３５〜４０℃で典
型的には１〜３時間の増殖速度倍加時間を有する１型の
任意メチロトローフである。 ＡＴＣＣ３９８９３菌株はメタノール、フルクト−スお
よびグルコースを基質として増殖する。また、ギ酸もし
くはメタノールの形態の外来エネルギー供給が存在する
場合には、この菌株はより広範囲の従属栄養基質（例、
コハク酸およびピルビン酸）でも増殖しよう。これは、
既知のどの微生物についても報告されたことのない特性
である。同定のために、この現象を示す細菌を、ここに
「γ：う在的任意メチロトローフ」と叶ふことにする。 ＡＴＣＣ３９８９３菌株の特徴を包含する性質を有する
細菌はさらに、固体培地での淡Ｉｃ色コロニーの非粘液
性増殖によっても特徴づりられる。ＡＴＣＣ３９８９３
型のメーｆ−ロトローフ性細菌菌株の別の菌学的’ｌｌ
１ｉｈは、ヘキスロースリン酸ソンターゼ／へ−１−ス
ロースリン酸イソメラーゼ活性ｒＪ、　ｐ、　Ｖａｎ　
Ｄｉｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、エフ・イー・エム・ニス
　マイクロバイオロジカル・レター　（ＦＵＭＳ　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌａｔｔｅｒ）、ｊ、　９７　（１
９７８）　）が、タンパク質１＋ｍ＋ｒにつき１分間の
ＮＡＤＩ＋生成址で少なくとも約４００ナノモルである
ことである。 任意メチロトローフであるＡＴＣＣ３９８９３型菌株の
顕著な別の特性は、メタノール基質を止転化さきて、水
溶液に擬似塑性とチキソトロピー性とを付与するエキソ
多糖を蓄積した量で生成する能力である。ＡＴＣＣ３９
８９３菌株の細菌は、細胞増殖の有無にかかわらず多様
な培養条件下で培地中に多量の蓄積したエキソ多才ＪＩ
を生成することができる点で特に顕著である。ＡＴＣＣ
３９８９３菌株の細菌は、利用可能な炭素源のうらエキ
ソ多糖の生合成に利用される割合が大きいという固有の
能力を有している。 ＡＴＣＣ３９８９３型の細菌菌株の別の特徴は、指数増
殖期とは異なる非対数増殖パターンを示すことである。 訂ｃｃ　３９８９３ｉ１ｆ株の培養菌は、１！１壓：ｔ
り限対数増殖を団止する自然の代謝機能不全を示す。醗
酵培地にビタミン、アミノ酸、もしくは酵母ニートスな
どの多様な増殖因子をｔｒｉ給しても、ごのｊト）Ｊ数
増殖は影ツされない。 メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株は、炭素源、窒素
源、塩類、および各種増殖促進物質を含有する栄養１ｊ
“５地中で好気”３Ｍできる。 適当な窒素源には、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、アンモニア、リン酸ニアンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、硝酸す１ヘリウム、尿素、コーン浸出液、カゼイ
ン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどがある。 好適な無機塩類としては、カルシウム塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩、マンガン塩、亜り：
）塩、銅塩などがある。細菌増殖促進物質としては、大
豆タンパク質加水分解物、酵８上エキス、ビタミンおよ
びアミノ酸が挙げられる。 栄養培地中での微生物の培養は、典型的には振盪培養も
しくは液内培養により３５〜４０℃の温度および約６，
７〜７．１のｐＨで好気的に行われる。 王まツＪ」ト陳１仄 前述した培養条件を採用すると、本発明のメチロフィル
ス・ビスコゲ不スの菌株はエキソ多糖ヲ高濃度かつ高い
炭素源利用率で生産し、蓄積する。 菌株＾ＴＣＣ３９８９３は、メタノールを増殖炭素源と
して使用した場合、培地１１に対しでて約Ｌｏｇ／ρま
での量でエキソ多糖を生産することができる。 エキソ多糖の収率は、メタノールの使用量に基づいて通
常は約３０〜６０％の範囲内となろう。 よって、別の態様において、本発明は、増殖炭素ａ（例
、ＣＩ化合物もしくはフルクトース）を含有する栄養培
地中でメチロフィルス・ビスコゲネスの菌株を好気培養
して、ヘテロ多糖を蓄積する鼠の細胞外生産物として生
成さ−Ｕることからなる、ヘテロ多＃Ｈの製造方法を提
供する。 さらに別の態様において、本発明は、増殖炭素源として
メタノールを含有する栄養培地中でメチロフィルス・ビ
スコゲネスの菌株ＡＴＣＣ３９８９３モしくはその変異
株を好気培俣して、ｍ積置の細胞外生産物としてヘテロ
多糖ポリ５４を生成させ、この生産物を場合により培地
から回収することからなる、ヘテロ多糖の製造方法を提
供する。 醗酵操作の完了後、全菌体を遠心分離、限外口過もしく
は加熱滅菌などの慣用手段によりブロスから取り除く。 残った上清液からヘテロ多糖は凍結乾燥、もしくは水溶
性有機溶剤（例、アセトン、メタノール、エタノールな
ど）による沈殿などの適宜手段により回収される。ヘテ
ロ多ｖ３の沈殿は、）８液をカルシウム塩で処理するご
とによっても行うことができる。 得られた粗製のヘテロ多糖の精製は、これを水に＋Ｉｒ
　ｆ’ａ解させ、この水）８液を次いで透析および凍結
乾燥して、精製生成物とすることにより実施できる。 こうして得られた新規生成物であるヘテロ多糖ポリ５４
の平均分子量は、約８００，０００〜１，５００．００
０の範囲内である。 ヘテロ！、　糖ポリ５４の粘度は、ブルックフィールド
ＲＶ　Ｔ粘度計のスピンドル！ｌｈ４により２５℃で測
定して、＋２　ｒｐｍでの０．５％粘度が２１００　ｃ
ｐｓである。ヘテロ多糖ポリ５４の水溶；夜は無色透明
で、度似グ性およびチキソトロピー性の粘度特性を示す
。この水）６液の粘度特性は、肖１３０′Ｃまでの温度
、および杓１２までのｐ　ｌ−１値で安定である。 低セン断速度条件下で、ヘテし！多番ノ３ポリ５４は、
−Ｃに市販のキサンタン・ガムの灼５〜３０倍という見
掛は粘度を示す。ペテロ多＋１．１！ポリ５４および市
販のキサンタン・ガム（例、ケルヂン、　Ｋｅｌｚａｎ
）のセン断条件下での粘度特性の比較データを、添付の
第１図に示す。 ヘテロ多糖ポリ５４の水溶；夜の擬像塑性を、第２図に
、１％（−／ν）ポリ５４の流れ曲線として示す。第２
図で上昇曲線と下降曲線が（］１違することは、このポ
リマー）容ン＆力くチー１−ソ１−ロビー１生であるこ
とを実証している。ヘテロ多ｌＪ９ポリ５４は、水溶液
中において増粘剤として使用するのに優れた性質を有し
ている。ヘテロ多糖ポリ５４は１１１独で使用すること
も、または親水性ガム質材料のような１種もしくは２種
以上の他の水溶性多糖と併用することもできる。親水性
ガム質材料の例は、キナンクン・ガムおよびタラリン１
′・ガム、ならびにグアー　ガムおよびローカスＩ−ヒ
ーーン・ガノ、（ｌｏｃｕｓｔ　ｂｅ＋Ｉｎ　５ｕｍ）
のようなボリガラクｌマンナン系ガム類である。 水溶液中での粘度助人効果の相乗的な・強化が、ヘテロ
多Ｉ唐ポリ５４を、グアー・ガム、覧−１−カスト・ビ
ーン・ガム、タラ・ガム、デンプンもしくはカルボキン
メチルセルロースとＮｕｌ１合せて使用した場合に認め
られる。 ヘテロ多υ９ポリ５４のその他の物理化学的および構造
上の特徴は次の通りである。 Ａ、糊！ＵわＬ套駐すリーー グルコース　　１０ ガラクトース　７〜１０ マンノース　　　１〜３ グリクＩ′Ｊン　　Ｉ〜３ ヘテロ多糖ポリ５４は約１〜３重■％の窒素を含有する
。ポリ５４はまたピルビン酸もしくはタンパク質含有量
を示さず、４単糖単位あたり約１個のアセチル基を含有
する。グリクロン酸（ｇｌｙｃｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ
）成分は、グルクロン酸および／またはガラクツロン酸
および／またはマンヌロン酸からなる。 Ｂ、デ１予ＵふＫＬｏ Ｃ３９，２ ８６，１ ０４３、Ｉ Ｎ　　　　　２．１７ 本平均値；灰分補正済 Ｃ６雌嘉 はっきりした融点は示さず、約１５０℃以上の温度で分
解する。 Ｄ、透ノしく≦夕」−火 １７４０ｃｍ−’で吸収帯（脂肪族エステル基を示す）
。 １６５０ｃｍ−’および１５４０ｃｍ−’で吸収帯（ア
ミド基を示す）。 Ｅ、茅ノＰ丸収スペクト上 紫外波長範囲で検出可能なピークを示さず。 Ｆ、産舵刑痒（１） 水にｌ１ＪＬ８であるが、−１’Ｇ仔機溶剤のす・・、
てに不）容１生。 Ｇ、　↓ヒ方【ン［刀し 測定可能な比旋光度を示さず。 本発明のヘテロ多糖は、米国特許第４，５１４，５６３
に記載の多糖とは、組成および特性のいずれについても
異なるものである。米国特許第４，５１４，５６３に記
載の多糖の主成分は、ｆａｔグルコース、（ｂｌガラク
トース、（ｃｌマンノース、および（ｄｌグルクロン酸
であり、ｆａｔ　：　ｆｂｌ　：　ｆｃ）　：　ｆｄｌ
のモル比は、１０：３〜６：０．５〜２　　：　　０．
５〜２である。 米国特許第４，５１４，５６３に記載の代表的な多糖は
、アセトバクター・ボリサノ力ロゲネス（Ａｃｅ　ｔｏ
ｌ＋ａｃｔｅｒ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｇｅｎｅｓ
）　ＭＴ−１１−２もしくはＭＰ−８のような酢酸細菌
により生産される。この多糖は、アセチルもしくはピル
ビン酸成分をＮ有しておらず、また窒素も全く含有して
いない。１％水溶液での粘度は、２５℃においてプルツ
クフィール１“型粘度計により３０　ｒｐｍのスピンド
ル回転速度で測定して５００〜１２００　ｃｐｓである
。 以下の実施例は本発明をさらに例示するためのものであ
る。使用した要素および具体的成分は代表例として示し
たものであって、本発明のｌＴｎ囲内で以上の説明に基
づいて各種の変更をなすことができる。 メタノール同イい、Ｉ菌の増殖に対しては、無機塩（１
培地（ＭＳ）（第１表）を使用した。この培地に、Ｉｇ
＃の硝酸カリウムを補給して硝酸無機塩類培地（ＮＭＳ
）とするか、またはＩｇ／１２の塩化アンモニウムを補
給してアンモニウム無機塩類培地（ＡＭＳ）とした。炭
素源のメタノールは０．２〜０．５χ（ν／ｖ）の濃度
で使用するのが好ましい。 固体培地に対しては、滅菌の前に１７ｇ＃！のジフコ社
製細菌用寒天（ハタトアガー）を基本の無機塩類培地（
リン酸塩は存在さセず）に添加する。 次いで、滅菌した無機塩類培地に冷却後に滅菌リン酸塩
溶液を無菌添加する。 醗酵操作は、ニュー・プランズウィノク・マイクロファ
ーム醗酵装置（容ｆｆ１ｌ、Ｈりを使用して行う。使用
容積はｔＯＸとし、醗酵装置の滅菌後にメタノールを無
菌添加する。２１／ｍｉｎの空気ＩＪ（給速度で、２０
０ｒρｍの１ｓ２１Ｔ、４度を恒常的に使用する。 このの酵装置は、ｐＨおよび溶解酸素制御手段を６１Ｎ
えている。 ・＼キス１１−スリン酸シンターゼの触媒作用の生成物
であるヘキスロース６−リン酸の分析法がないので、ヘ
キスロースリン酸シンターゼ／ヘキスロースリン酸イソ
メラーゼを同時に分析する。ヘキスロースリン酸イソメ
ラーゼにより、ヘキスロース６−リン酸はグルコース６
−リン酸に転化され、このグルコース６−リン酸はグル
コース６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用し、同時に起
こるＮＡＤＰ”還元を３４Ｏｎ＋ｍで追跡することによ
り測定することができる。この酵素分析溶液は次の成分
を含有する　（最終濃度）ニリン酸緩衝液５０　ｍＭ、
　ｐＨ７，２；塩化マグネシウム２．５ｍＭ；グルコー
ス６−リン酸デヒドロゲナーゼ０．７華位；ホスホグル
コイソメラーゼ０．７５単位；ホスホリボースイソメラ
ーゼ１．７５単位；リボース５−リン６１５　ｍＭ　；
　Ｎ＾ＤＰ’　０．２５　ｍＭ　　；ならびにホルムア
ルデヒド５　ｍＭ。 少しでもヒドロキシピルビン酸レダクターゼが存在する
ことは、微生物においてセリン経路のホルムアルデヒド
同化が起こったことを示す。この酵素は、次の成分を含
有する（　ＪＩ　Ｐ：９５度）酵素分析溶液により測定
できるニリン酸カリウムＩ　Ｍ。 ρ１１Ｇ、３；ヒドロキシピルビン酸す、チウム０．０
１　Ｍ；およびＮＡＤＨ２ｍＭ　、　ＮＡＤＩＩの消失
を３４０　ｎｍで測定する。 グリセロールおよびジヒドロキシアセトンの測定は、グ
リセロールデヒドロゲナーゼ／ジヒドロキシアセトンレ
ダクターゼ（グリセロール：ＮＡＤ”２−オキシ１ルダ
クターゼ、　ＥＣ１，１，１，６）により行われる。こ
の酵素は、エンテロバクタ−・アエロゲネス（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）から誘導され
、シグマ・バイオケミカルズ社より人手できる。 グリセロールの測定に対しては、反応混合物（１，０ｍ
ｌ）は、５０μｍｏｌのトリス−１１ｃＩ緩衝液（シグ
マ・バイオケミカルズ社）、　ｐＨ９，７；　０．２　
μｍｏｌのＮＡＤ’　　；　Ｌ単位の酵素；および１５
μｍｏ＋のグリセロール（もしくは試験溶：夜／酩酊ブ
［１ス、２０〜５０μｍ）を含有する。分析は、基質の
添加Ｇこより開始され、その後、ペックマン２５型ＵＶ
分光光度計により３４０ｎ−での吸光度の増大を監視す
る。 ジヒドロ−１−ジアセトンの測定に対しては、反応混合
物（１，０ｍｌ）は、５０μａ＋ｏｌのリン酸緩衝液。 ｐＨ６，０；　０．５　μｍｏｌのＮＡ［ｌＩＩ　；　
１単位の酵素；および１５μｍｏｌのジヒドロキシアセ
トン（もしくは試験溶液／醗酵ブロス、２０〜５０μｍ
）を含有する。 分析は、Ｉ’ｌの添加により開始され、その後３４０ｎ
ｍでの吸光度の減少を監視する。 生成したエキソ多糖（例、ヘテロ多糖ポリ５４）は、メ
チロフィルス・ビスコゲネスの菌株の培養作業が完了し
てから回収する。醗酵装置からブロスを取り出し、全菌
体を遠心分子＝Ｉ！　（１３，０００ｘ　ｕで１０分間
）により取り除く。生成したエキソ多糖をイソプロパツ
ールの添加により溶液から析出さゼて単離する。 エキソ多ＩＪ！類の水溶液のレオロジー特性の測定は、
ウェルズ（Ｈｅｌｌｓ）／ブルックフィールド・コーン
／プレート・ディジタル式粘度計、あるいは同軸シリン
ダ・センサ・システムを取りつけたしオマソト　（ｎｈ
ａｏｍａｔ）　３０型粘度計により行う。 比較用粘度測定に使用したキサンタンガムは、ゲルコ社
（Ｋｅｌｃｏ　Ｃｏ、）から市販の製品であるケルザン
である。 エキソ多糖の単糖含有量の分析は、加水分解−気液クロ
マトグラフィー法により行う。この分析法は、エートソ
多糖をトリフルオロ酢酸水溶液中で加水分解させ、次い
でホウ水素化ナトリウムにより還元し、無水酢酸でアセ
チル化する操作を包含する。生成した単糖のポリ酢酸エ
ステル誘導体を次いでガスクロマトグラフィーにより　
４Ｆ！　ｋｊｔ試料と対比させて分析する。 尖止透 本実施例は、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株の培
養による蓄積した量のエキソ多υ、ｌｉ代」ｊ産物の生
産を例示する。 ＡＴＣＣ３９８９３菌株の接種液５００　ｍｌを、ＭＳ
培地、Ｉｇ／ｊ！の塩化アンモニウムおよび増殖炭素源
として０．５％（ｖ／ｖ）のメタノールを使用して増殖
させる。フラスコは３７℃で２日間インキュベーション
する。こうして得られた培ｙ液を使用して、ＭＳ培地１
０ｍ塩化アンモニウムＩｇ／４、およびメタノール０．
５％（Ｖ／ν）を入れた容１１４１！のニュー・ブラン
ズウィンク・マイクロファーム台酵装置を接種する。 最初の醗酵条件は次の通りである：３７℃、撹拌２０Ｏ
ｒｐｍ、空気流１２ｊ！／ｌｌ１ｉｎ、およびｐＨ７，
０゜ｐ　ＩＩ　ハｍｈｌ　中ホホ７．０　Ｌ：＝　７４
ｆ１１　ｔ　ル。醗酵培地ｔＪ】０）炭素が消耗してき
たらメタノールを断続的に追加して、０．５％（ｖ／ｖ
）の濃度を保持する。メタノールの濃度は気液クロマト
グラフィーにより測定する。２４〜３６時間の醗酵後、
撹拌速度を４００　ｒｐｍに増す。 メタノールが培養液により利用されなくなったら（通常
５〜７日後）、醗酵を終了させる。次いで、得られた非
常に粘稠な醗酵プロスをイソプロパツールで希釈して（
アルコール：プロス＝２：１）、エキソ多糖の析出を助
長する。得られた析出物を日別した後、１００％イソプ
ロパツールで・次いで７０％イソプロパツールで洗浄す
る。析出したエキソ多糖をその後、強制空気循環式乾燥
器により５５℃で乾燥する。乾燥したエキソ多糖を次い
でウィリーミルにより粉砕して粉末状とする。かくして
得られたエキソ多糖生成物の物理化学的性質は、ヘテロ
多糖ポリ５４について上に述べたものと一致している。 別法として、ヘテロ多糖ポリ５４を次に述べる方法によ
り醗酵ブロスから回収し、精製する。 醗酵終了後、醗酵ブロスを脱イオン水によりｌ：Ｉの割
合で希釈し、Ｌｏ、００Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離し
て、微生物菌体および固体物質を分離する。 残ったプロスを次いで脱イオン水を用いて水の体積をし
ばしば変化させながら７２時間透析する。 透析したプロスに体積で２倍量のイソプロパツールを加
えると、ヘテロ多糖ポリ５４が白色繊維状沈殿として析
出する。この沈殿を捕集し、イソプロパツールで洗浄し
、減圧乾焔器で乾燥する。 この白色沈殿を脱イオン水に再溶解させ、得られた）６
液を上述のように遠心分＾１］する。イソプロパツール
で生成物を沈殿させ、次いで口過および乾燥して、精製
ヘテロ多糖ポリ５４を得る。 Ｍｇ５Ｏ，・７１１□ＯＩｇ ＣａＣＩｔ　　　　　　　　　Ｏ，２ｇＮａｇｌｌＰＯ
ａ　　　　　　　　Ｏ，３３ｇＫＩＩｚＰＯｔ　　　　
　　　　Ｏ，２６ｇＦｅｌＥＤＴＡ　　　　　　　　５
．ＯｍｇＮａＩＭｏＯｎ・２１１ｔＯ２，ＯｍｇＣｕＣ
Ｉｚ　・２１１ｔ０　　　　　１．ＯｍｇＦｅｌｏｎ　
・７Ｈ，０５００ｐｇ ＺｎＳＯａ　＋　７！ＩＪ　　　　　４００１’　ｇＭ
ｎＣｌｔ　−４１１ｚＯ２０ｉｔ　ｇ）１ユＢ０．　　
　　　　　１５μｇ ＣｏＣＩ２　・６１１ｇ０　　　　５０μｇＮｉＣ１ｚ
・６１１□０　　　　１０μｇＥＤＴ八　　　　　　　
　　　　　　　　　２５０　μｇ）１□ＯＩ　Ｌ　ｐＨ
（ｉ、８
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヘテロ多Ｉｊ３ポリ５４および市販の−１−
サンクン・ガムのセン断条件下での粘度特性を本すグラ
フ、および 第２図は、ヘテロ多糖ポリ５４の１％（Ｗ／Ｖ）水溶液
の流れ曲線を示すグラフである。 ｔ［人　セラニーズ・コーポレーンヨン代理人　弁理士
　広　瀬　章　− ス届 ＬＯ″− 賛８

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）増殖炭素源を含有する栄養培地中で好気性条件下
    に細菌メチロフィルス・ビスコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏ
    ｐｈｉｌｕｓ　ｖｉｓｃｏｇｅｎｅｓ）の菌株を培養す
    ることからなる、エキソ多糖の製造方法。
  2. （２）増殖炭素源がＣ＿１化合物である、特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  3. （３）増殖炭素源としてメタノールを含有する栄養培地
    中でメチロフィルス・ビスコゲネスの菌株を好気培養し
    て、蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖生成物を生成させる
    ことからなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. （４）特許請求の範囲第３項記載の醗酵方法により製造
    されたヘテロ多糖。
  5. （５）増殖炭素源としてメタノールを含有する栄養培地
    中で、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株ＡＴＣＣ　
    ３９８９３もしくはその変異株を好気培養し、蓄積した
    量の細胞外ヘテロ多糖ポリ５４を生成させることからな
    る、特許請求の範囲第３項記載の醗酵方法。
  6. （６）モル比でグルコース約１０、ガラクトース７〜１
    ０、マンノース１〜３およびグリクロン酸１〜３からな
    る単糖類から構成され、単糖３〜５単位に対して約１個
    のアセチル基を含有し、水溶液に擬似塑性およびチキソ
    トロピー性を付与する、親水性ガム質ヘテロ多糖。
  7. （７）約１〜３重量％の窒素を含有する、特許請求の範
    囲第６項記載のヘテロ多糖。
  8. （８）グリクロン酸がグルクロン酸、ガラクツロン酸も
    しくはマンヌロン酸からなる、特許請求の範囲第６項記
    載のヘテロ多糖。
  9. （９）特許請求の範囲第５項記載の方法により製造され
    たヘテロ多糖ポリ５４。
  10. （１０）（１）特許請求の範囲第９項記載のヘテロ多糖
    ポリ５４と、（２）水溶性多糖との混合物からなる、水
    溶液用の増粘剤組成物。
  11. （１１）多糖が親水性ガム質材料である、特許請求の範
    囲第１０項記載の組成物。
  12. （１２）多糖がグアー・ガムである、特許請求の範囲第
    １０項記載の組成物。
  13. （１３）多糖がローカストビーン・ガムである、特許請
    求の範囲第１０項記載の組成物。
  14. （１４）多糖がキサンタン・ガムである、特許請求の範
    囲第１０項記載の組成物。
  15. （１５）多糖がタラ・ガムである、特許請求の範囲第１
    ０項記載の組成物。
  16. （１６）多糖がタマリンド・ガムである、特許請求の範
    囲第１０項記載の組成物。
  17. （１７）多糖がデンプンである、特許請求の範囲第１０
    項記載の組成物。
  18. （１８）多糖がカルボキシメチルセルロースである、特
    許請求の範囲第１０項記載の組成物。
  19. （１９）（１）特許請求の範囲第９項記載のヘテロ多糖
    ポリ５４と、（２）水溶性多糖との混合物を、増粘剤と
    して含有する水溶液。
  20. （２０）多糖が親水性ガム質材料である、特許請求の範
    囲第１９項記載の水溶液。
  21. （２１）多糖がデンプンである、特許請求の範囲第１９
    項記載の水溶液。
JP61241202A 1986-02-06 1986-10-09 新規ヘテロ多糖の生合成法 Pending JPS62186797A (ja)

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