JPS637778A - 任意メチロトロ−フ性細菌の新菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、任意メチロトローフ性細菌菌種であるメチロ
フィルス・ビスコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ
　ｖｉｓｃｏｇｅｎｅｓ）の新菌株ＡＴＣＣ５３４１２
およびその変異株、ならびにそれを利用したエキソ多糖
の製造方法およびメタノールの醗酵方法に関する。メチ
ロフィルス・ビスコゲネスの菌株ＡＴＣＣ５３４１２は
、リブロース−リン酸経路によりメタノールを同化して
、好気性培養条件下で細胞外ヘテロ多糖ポリ５４を形成
することができる。

（従来の技術） Ｃ１化合物からの単細胞タンパク質（ＳＣＰ）の製造に
ついては、このＩＯ年間に学術的もしくは工業的な実験
室で広く研究されてきた。三菱瓦斯化学■、ヘキスト社
、ＩＣ１社などの企業がパイロットプラントでの研究を
行ってきたが、現在ではＩＣＩ社のみが本格規模のＳＣ
Ｐ工場を稼動させている。ＩＣ１社のこの製品は「プル
ティーン（Ｐｒｕｔｅｅｎ）　Ｊなる登録商標で呼ばれ
、この製品は絶対メチロトローフ性の細菌であるメチロ
フィルス・メチロトロフス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕ
ｓ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒ。

ｐｈｕｓ）の醗酵により製造され、これは最終的に分離
・乾燥されて粉末もしくは顆粒状で得ている。

メチロフィルス・メチロトロフスはホルムアルデヒド固
定のりブロース−リン酸経路（ＲＭＰ）を利用する絶対
メチロトローフである。メチロフィルス・メチロトロフ
スの菌株ＡＳ−１は、１木の８ｉ！鞭毛を持ったゲノム
陰性の非着色桿菌である。

ＳＣＰの生産において、メタノール供給原料は操業コス
トの最も大きな割合を占めており、従って微生物増殖速
度の増大はｓｅｐ生産の操業コストに直接影響してくる
。この理由により、ＩＣＩ社は、組換えＤＮＡ技術を応
用してメチロフィルス・メチロトロフスの細菌のゲノム
を変質させることにより菌体収量を増大させている。大
腸苗（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）から得たよ
り効率的なグルタミン酸・デヒロドゲナーゼ窒素同化系
に対する遺伝子をクローニングし、メチロフィルス・メ
チロトロフスの菌株に挿入した。この菌株は、予めＤＮ
Ａ突然変異により遮断されたその効率がより小さいグル
タミン酸・シンターゼ窒素同化系を有していた（Ｊ、　
Ｗｉｎｄａｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２
８７＋　３９６（１９８０）に記載〕。

メタノールは一般に単細胞タンパク質製造用の基質とし
て検討されているが、メタノールをＳＣＰ製造に適格と
する因子により、これはまたエギソ多糖類のような蓄積
された細胞外代謝産物の製造用の供給原料としても有望
である。メタノールを付加価値のある製品に転化させる
多くの微生物学的方法が発表されているが、それらは−
般にアミノ酸のような低容積／高価格の化合物である。

たとえば、Ｊ、　Ｂｏｌｂｏｔ　＃よびＣ，Ａ４１ｔｈ
ｏｎｙは、Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌ、　５＋　４３　（１９７８）において、シ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　Ａ　Ｍ　Ｉ
のピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠乏変異株がメタノール
での増殖中にアミノ酸であるアラニンとバリンを蓄積で
きることを見出した。Ｙ、　Ｔａｎ１　らは、Ａｇｒｉ
ｃ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　４２．２２７５　（１
９７８）に、アルスロバクタ−・グロビフォルミス（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ　ｇｌ。

ｂｉｆｏｒｍｉｓ）の菌株を使用してメタノールから５
，２ｇ／ｌまでのし一セリンが生産されることを述べて
いる。しかし、日常消費型の大量化学物質へのメタノー
ルの生転化に関しては現在まで未だに報告がない。

（発明が解決しようとする問題点） よって、本発明の目的は、Ｃ１化合物を蓄積した量の細
胞外代謝産物に生転化させる醗酵方法を提供することで
ある。

本発明の別の目的は、メタノール基質を蓄積した量のエ
キソ多糖に生成比させるための、急速増殖培養基を提供
することである。

本発明のさらに別の目的は、メチロフィルス・ビスコゲ
ネスの菌株ＡＴＣＣ５３４１２もしくはその変異株を特
徴づける菌学的性質を有するメチロトローフ性細菌菌株
を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、水溶液に凝似望性およびチ
キソトロピー性を付与するのに適した性質を示すペテロ
多糖を提供することである。

本発明のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明
および実施例から明らかとなろう。

（問題点を解決するための手段） 本発明の目的は、下記の菌学的性質： ＋８＋好気性、ゲノム陰性、桿状、運動性で、極鞭毛を
持った細胞； （ｂｌリブロース−リン酸経路によりメタノールを同化
することができるメチロトローフ性；（Ｃ＋フルクトー
スにより増殖可能；およびｆｄｌ約３０〜４３℃の培地
温度で最適増殖速度：で特徴づけられる新規な細菌菌株
の提供により達成される。

別の態様において、本発明は菌株ＡＴＣＣ５３４１２の
菌学的性質を有する細菌培養株を提供し、この培養閑は
メタノールを細胞外に蓄積するヘテロ多糖に好気的に止
転化させることができる。

寄託番号ＡＴＣＣ５３４１２の菌株の二次培養株は、米
国メリーランド州ロックビル所在のアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）の永続的微生
物コレクションから請求により入手することができる。

この微生物の永続的寄託は、特許手続き上のブダペスト
条約の要件に従ってなされた。

菌株ＡＴＣＣ５３４１２の菌学的性質を有する細菌菌株
は、メチロフィルス・メチロトローフのような既知のメ
チロトローフ性菌種のいずれにも属さない。分類学的同
定のために、ＡＴＣＣ５３４１２菌株およびその変異株
の菌学的性質を有する細菌菌株を包含するこの新規な任
意メチロトローフ性の菌種は、メチロフィルス・ビスコ
ゲネスと命名された。

本明細書で使用した「メチロトローフ」なる用語は、１
もしくは２以上の炭素原子を含有するが、炭素−炭素結
合を含有していない炭素化合物により非独立栄養的に増
殖することのできる微生物を意味する。「独立栄養的」
とは、二酸化炭素基質による増殖を意味する。

本明細書において［任意メチロトローフ」とは、１種も
しくは２種以上の従属栄養基質（例、フルクトース）上
で増殖できるメチロトローフを意味する。

本明細書で使用した「Ｃ８化合物」なる用語は、メタノ
ール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ホルムアミド、−酸化
炭素、ジメチルエーテル、メチルアミン、ジメチルアミ
ン、トリメチルアミンおよびトリメチルアミンＮ−オキ
シドのように、炭素−炭素結合を全く含有しない有機化
合物を意味する。

本明細書において、「エキソ多糖」とは、キサン（キサ
ンタン・ガム）およびポリ５４　（Ｐｏｌｙ　５４）で
例示されるような、醗酵培地中に細胞外代謝産物として
蓄積する多糖を意味する。

本明細書において、「ヘテロ多糖」とは、少なくとも２
゛種類の異なる単ｌＰｉ単位、たとえばマンノースおよ
びガラクトース、から構成される多糖を意味する。

本明細書で使用した「リブロース−リン酸経路Ｊ　　（
ＲＭＰ）とは、ホルムアルデヒド３分子が縮合してピル
ビン酸１分子か、またはジヒドロキンアセトンリン酸１
分子のいずれかを生成する生化学回路を意味する。

リブロース−リン酸経路およびその変形例の解明に関す
る生化学の文献には、Ｊ、　Ｓｔｒｏｅｍ　ｅｔ　ａｌ
、。

バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、
）＋　１４４、４６５　（１９７４）　　；　　Ｃ，Ａ
ｎｔｈｏｎｙ、サイエンティフィツク・プログレス（Ｓ
ｃｉ、　Ｐｒｏｇ、）、　６２．１６７　（１９７５）
：およびＣｏ１ｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、バイオケミカル・
ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）、　１４８．５
１３　（１９７５）がある。

リブロース−リン酸経路には、６−ホスホグルコン酸デ
ヒドラーゼ／ホスホ−２−ケト−３−デオキシグルコン
酸アルドラーゼ；フルクトースニリン酸アルドラーゼ；
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ；３−へキス
ロースリン酸シンターゼ；ホスホフルクトキナーゼ；ホ
スホグルコイソメラーゼ；ホスホル３−ヘキスロースイ
ソメラーゼ；ホスホリボイソメラーゼ；リブロース−５
−リン酸３−エピメラーゼ；トランスアルドラーゼ；ト
ランスケトラーゼ；セドヘプツロースニリン酸アルドラ
ーゼ；およびセドヘプツロース−１゜７−ジホスフアタ
ーゼを包含する酵素が関与している。

ＲＭＰ回路においては、３分子のホルムアルデヒドが３
分子のりブロース５−リン酸と効果的に縮合して３分子
のフルクトース６−リン酸が生成し、次いでこの生成物
からこの回路により３分子のりブロース５−リン酸が再
生されるので、全体としては１分子のジヒドロキシアセ
トンリン酸もしくはピルビン酸が生産される。かかる代
謝産物は、細胞生合成の基質として機能する。

この回路の２つの重要な酵素は、ホルムアルデヒドとり
ブロース５−リン酸との縮合、およびこの生成物のフル
クトース６−リン酸への転化の各反応を触媒する酵素で
あるヘキスロースリン酸シンターゼおよびヘキスロース
リン酸イソメラーゼであると考えられる。ＲＭＰ回路の
２つの認められた変異回路、すなわちジヒドロキシアセ
トンリン酸を生成するフルクトースビスリン酸変異回路
と、ピルビン酸を生成するエントナー・ドゥドロフ変異
回路がある。

メチロフィルス・ビスコゲネス　！ 米国テキサス州ビションブ所在のメタノール製造工場の
操業部付近で採取した土壌および水の試料を使用して一
連の分離を行った。試料をまずメタノール利用微生物の
存在についてスクリーニングした。

各試料の一部を、メタノール（０，５χｖ／ｖ）ならび
に適当な栄養培地、たとえば第１表に例示した無機塩１
’ｉ（ＭＳ）培地＋塩化アンモニウム１ｇ／ｌを入れた
２５０　ｍｌの三角フラスコに接種した。このフラスコ
を、３０〜５５℃の範囲内の各種温度で保温して培養を
行った。増殖の表示となる検出可能な混濁が認められた
ら、各試料を２ｍｌづつ取り出し、これを使用して上と
同様の培地を入れた滅菌フラスコにそれぞれ接種した。

最初の各試料について、次代の二次培養液を多数採取し
、次いでこの培養液を平板寒天培地で画線培養して、独
立した微生物ｍＲコロニーを得、これからメタノール同
化微生物の純粋培養菌を得た。このようにしてＡＴＣＣ
３９８９３１株を単離し、これを生物学的に純粋な培養
菌として得た。新規苗株ＡＴＣＣ３９８９３の分離およ
び特性に関しては、特願昭６１−２４１２０１号に説明
されている。

本発明のメチロフィルス・ビスコゲネスの菌株＾ＴＣＣ
５３４１２は、上記メチロフィルス・ビスコゲネス菌株
ＡＴＣＣ３９８９３の培養菌から自然突然変異株として
単離された新規微生物である。

メチロフィルス・ビスコゲネスの各菌株は新規な組合せ
の性質を示し、それによりこれらは他のメチロトローフ
性細菌から区別される。メチロフィルス・ビスコゲネス
の菌株ＡＴＣＣ５３４１２は、Ｃ８同化のりブロース−
リン酸経路を利用し、３５〜４０℃で１．５〜２時間と
いう非常に短い増殖速度倍加時間を有する任意メチロト
ローフである。この増殖速度倍加時間は、上記苗株ＡＴ
ＣＣ３９８９３の増殖速度の約２倍であり、既知のあら
ゆるメチロトローフ性細菌の増殖速度を上回るものであ
る。

ＡＴＣＣ５３４１２菌株はメタノール、フルクトースお
よびグルコースを基質として増殖する。また、ギ酸もし
くはメタノールの形態の外来エネルギー供給が存在する
場合には、この菌株はより広範囲の従属栄養基質（例、
コハク酸およびピルビン酸）でも増殖しよう。これは、
既知のどの微生物についても報告されたことのない特性
である。同定のために、この現象を示す細菌を、ここに
「潜在的任意メチロトローフ」と呼ぶことにする。

ＡＴＣＣ５３４１２菌株の特徴を包含する性質を有する
細菌はさらに、メタノール寒天培地での淡橙色コロニー
の粘液性増殖によっても特徴づけられる。

ＡＴＣＣ５３４１２型菌株のメチロトローフ性細菌の別
の菌学的特徴は、ヘキスロースリン酸シンターゼ／ヘキ
スロースリン酸イソメラーゼｉ性（Ｊ、　Ｐ。

Ｖａｎ　Ｄｉｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｔ、、エフ・イー・エ
ム・ニス・マイクロバイオロジカル・レター（ＦＢＭＳ
門１ｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｌｅｔｔｅｒ）、　４．９７　（１９７８）　）が、タ
ンパク質１■につき１分間のＮＡＤＨ生成量で少なくと
も約４００ナノモルであることである。

任意メチロトローフであるＡＴＣＣ５３４１２型菌株の
顕著な別の特性は、メタノール基質を主転化させて、水
溶液に擬似塑性とチキソトロピー性とを付与するエキソ
多糖を蓄積した量で生成する能力である。ＡＴＣＣ５３
４１２菌株の細菌は、細胞増殖の有無にかかわらず多様
な培養条件下で培地中に多量の蓄積したエキソ多糖を生
成することができる点で特に顕著である。ＡＴＣＣ５３
４１２菌株の細菌は、利用可能な炭素源のうちエキソ多
糖の生合成に利用される割合が大きいという固有の能力
を有している。

メチロフィルス・ビスコゲネスＡＴＣＣ５３４１２型の
菌株は、炭素源、窒素源、塩類、および各種増殖促進物
質を含存する栄養培地中で好気培養することができる。

適当な窒素源には、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、アンモニア、リン酸ニアンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、硝酸ナトリウム、尿素、コーン浸出液、カゼイン
、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどがある。

好適な無機塩類としては、カルシウム塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩、マンガン塩、亜鉛塩
、銅塩などがある。細菌増殖促進物質としては、大豆タ
ンパク質加水分解吻、酵母エキス、ビタミンおよびアミ
ノ酸が挙げられる。

栄養培地中での倣生物の培養は、典型的には振盪培養も
しくは液内培養により３５〜４０℃の温度および約６．
７〜７．１のｐＨで好気的に行われる。

本明細書で使用した「変異株」とは、親菌株から誘導さ
れた菌株であって、親菌株とは表現型および／または遺
伝子型が異なり、エキソ多糖を生合成することができる
というメチロトローフ性視苗株の能力を示すメチロフィ
ルス・ビスコゲネスの菌株を意味する。

工土ヱ芝糖豊生皇 前述した培養条件を採用すると、本発明のメチロフィル
ス・ビスコゲネスの菌株はエキソ多糖ヲ高濃度かつ高い
炭素源利用率で生産し、蓄積する。

菌株ＡＴＣＣ５３４１２は、メタノールを増殖炭素源と
して使用した場合、培地１１に対してで約１０ｇ／ｌま
での量でエキソ多糖を生産することができる。

エキソ多糖の収率は、メタノールの使用量に基づいて通
常は約３０〜６０％の範囲内となろう。

よって、別の態様において、本発明は、増殖炭素源（例
、Ｃ０化合物もしくはフルクトース）を含有する栄養培
地中でＡＴＣＣ５３４１２型のメチロフィルス・ビスコ
ゲネス閏株を好気培養して、ヘテロ多糖を蓄積する量の
細胞外生産物として生成させることからなる、ヘテロ多
糖の製造方法を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、増殖炭素源として
メタノールを含有する栄養培地中でメチロフィルス・ビ
スコゲネスの菌株ＡＴＣＣ５３４１２もしくはその変異
株を好気培養して、蓄積量の細胞外生産物としてヘテロ
多糖ポリ５４を生成させ、この生産物を培地から回収す
ることからなる、ヘテロ多糖の製造方法を提供する。

醗酵操作の完了後、全菌体を遠心分離、限外口過もしく
は加熱滅菌などの慣用手段によりブロスから取り除く、
残った上清液からヘテロ多糖は凍結乾燥、もしくは水溶
性有機溶剤（例、アセトン、メタノール、エタノールな
ど）による沈殿などの適宜手段により回収される。ヘテ
ロ多糖の沈殿は、溶液をカルシウム塩で処理することに
よっても行うことができる。

得られた粗製のヘテロ多糖の精製は、これを水に再溶解
させ、この水溶液を次いで透析および凍結乾燥して、精
製生成物とすることにより実施できる。

こうして得られた新規生成物であるヘテロ多糖ポリ５４
の平均分子量は、約ａｏｏ、ｏｏｏ〜１，５００，００
０の範囲内である。

ヘテロ多糖ポリ５４の粘度は、ブルックフィールドＲＶ
Ｔ粘度計のスピンドル寛４により２５℃で測定して、１
２　ｒｐｍでの０．５％粘度が２１００　ｃｐｓである
。

ヘテロ多糖ポリ５４の水溶液は無色透明で、擬似塑性お
よびチキソトロピー性の粘度特性を示す。この水溶液の
粘度特性は、約１３０℃までの温度、および約１２まで
ＯｐＨ値で安定である。

低セン断速度条件下で、ヘテロ多糖ポリ５４は、−般に
市販のキサンタン・ガムの約２〜３０倍という見掛は粘
度を示す、ヘテロ多糖ポリ５４および市販のキサンタン
・ガム（例、ケルザン、　Ｋｅｌｚａｎ）のセン断条件
下での粘度特性の比較データは、特開昭６１−２４１２
０１号に示されている。

ヘテロ多糖ポリ５４のその他の物理化学的および構造上
の特徴は次の通りである。

Ａ、枦の　　　（モル％） グルコース　　ｌＯ ガラクトース　７〜１０ マンノース　　　１〜３ グリクロン　　１〜３ グリクロン酸（ｇｌｙｃｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）成分
は、グルクロン酸および／またはガラクツロン酸および
／またはマンヌロン酸を含む。

ヘテロ多糖ポリ５４は、ピルビン酸もしくはタンパク賞
含有量を示さず、４単糖単位あたり約１個のアセチル基
を含有し、約１〜３重量％の窒素を含有する。

Ｂ、メ１」」Ｌゼ幻−゛ Ｃ３９，２ Ｈ６，１ ０４３、Ｉ Ｎ　　　　２．１？ 本平均値；灰分補正済 以下の実施例は本発明をさらに例示するためのものであ
る。使用した要素および具体的成分は代表例として示し
たものであって、本発明の範囲内で以上の説明に基づい
て各種の変更をなすことができる。

メタノール同化細菌の増殖に対しては、無機塩類培地（
ＭＳ）（第１表）を使用した。この培地に、ｌ　ｇ／　
１の硝酸カリウムを補給して硝酸無機塩類培地（ＮＭＳ
）とするか、または１ｇ／ｌの塩化アンモニウムを補給
してアンモニウム無機塩類培地（、へＭＳ）とした。炭
素源のメタノールは０．２〜０．５χ（ｖ／ν）の濃度
で使用するのが好ましい。

固体培地に対しては、滅菌の前に１７ｇ＃！のジフコ社
製細菌用寒天（バタトアガー）を基本の無機塩類培地（
リン酸塩は存在させず）に添加する。

次いで、滅菌した無機塩類培地に冷却後に滅菌リン酸塩
溶液を無菌添加する。

醗酵操作は、ニュー・プランズウィソク・マイクロファ
ーム醗酵装置（容１１４１　）を使用して行う。使用容
積は１０１とし、醗酵装置の滅菌後にメタノールを無菌
添加する。２１２７ｍ１ｎの空気供給速度で、２０Ｏｒ
ｐｍの攪拌速度を恒常的に使用する。

この醗酵装置は、ｐＨおよび溶解酸素制御手段を備えて
いる。

ヘキスロースリン酸シンターゼの触媒作用の生成物であ
るヘキスロース６−リン酸の分析法がないので、ヘキス
ロースリン酸シンターゼ／ヘキスロースリン酸イソメラ
ーゼを同時に分析する。ヘキスロースリン酸イソメラー
ゼにより、ヘキスロース６−リン酸はグルコース６−リ
ン酸に転化され、このグルコース６−リン酸はグルコー
ス６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用し、同時に起こる
ＮＡＤＰ″還元を３４０　ｎｍで追跡することにより測
定することができる。この酵素分析溶液は次の成分を含
有する　（最終濃度）ニリン酸緩衝液５０　ｍＭ、　ｐ
Ｈ７，２；塩化マグネシウム２．５ｍＭ；グルコース６
−リン酸デヒドロゲナーゼ０．７車位；ホスホグルコイ
ソメラーゼ０．７５ｊＲ位；ホスホリボースイソメラー
ゼ１．７５華位；リボース５−リン！２５１１１Ｍ　；
　ＮＡＯＰ’　０．２５　ｍＭ　　；ならびにホルムア
ルデヒド５ｍＭ。

少しでもヒドロキシピルビン酸レダクターゼが存在する
ことは、微生物においてセリン経路のホルムアルデヒド
同化が起こったことを示す。この酵素：よ、次の成分を
含有する（最終濃度）酵素分析ｚ液により測定できるニ
リン酸カリウム１恥ｐｌ＋　６．３　；ヒドロキンピル
ビン酸リチウム０．０１　Ｍ；およびＮ、１ｎｌｌ　２
　ｍＭ　、　ＮＡＤＩＩの消失を３４０　ｎｍで測定す
る。

グリセロールおよびジヒドロキシアセトンの測定は、グ
リセロールデヒドロゲナーゼ／ジヒドロキシアセトンレ
ダクターゼ（グリセロール：ＮＡＤ’２−オキシドレダ
クターゼ、　ＥＣ１，１，１，６）により行われる。こ
の酵素は、エンテロバクタ−・アエロゲネス（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）から誘導され
、シグマ・バイオケミカルズ社より入手できる。

グリセロールの測定に対しては、反応混合物（１，０ｍ
ｌ）は、５０μｍｏｌのトリス−１１ｃｌ纒衝液（シグ
マ・バイオケミカルズ社）＋　ｐｌ（９，７；０．２　
μｍｏｌのＭＡＤ“　；１単位の酵素；および１５μｍ
ｏｌのグリセロール（もしくは試験溶液／醗酵ブロス、
２０〜５０μｍ）を含有する。分析は、基質の添加によ
り開始され、その後、ペックマン２５型ＵＶ分光光度計
により３４０　ｎｍでの吸光度の増大を監視する。

ジヒドロキシアセトンの測定に対しては、反応混合物（
１，０ｍｌ）は、５０μｍｏｌのリンｔ１２１１　ｊＪ
：　？Ｐｉ　。

ｐＨ６，０；０．５　μｍｏｌのＮＡＤＨ：　１単位の
酵素：および１５μｍｏ！　のジヒドロキシアセトン（
もしくは試験溶液／醗酵プロス、２０〜５０μｍ）を含
有する。

分析は、基質の添加により開始され、その後３４０ｎｍ
での吸光度の減少を監視する。

生成したエキソ多Ｉ唐（例、ヘテロ多糖ポリ５４）は、
メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株の培養作業が完了
してから回収する。醗酵装置がらプロスを取り出し、全
菌体を遠心分Ｍ　（１３，０００ｘ　ｇで１０分間）に
より取り除く。生成したエキソ多糖を通常はイソプロパ
ツールの添加により溶液から析出させて単離する。

エキソ多糖類の水溶液のレオロジー特性の測定を、ウェ
ルズ（Ｗｅｌ　Ｉｓ）　／　７’ルツクフイールド・コ
ーン／プレート・ディジタル式粘度計、あるいは同軸シ
リンダ・センサ・システムを取りつけたレオマット　（
Ｒｈｅｏｍａｔ）　３０型粘度計により行う。

エキソ多糖の単季唐含有量の分析は、加水分解−気液ク
ロマトグラフィー法により行う。この分析法は、エキソ
多糖をトリフルオロ酢酸水溶液中で加水分解させ、次い
でホウ水素化ナトリウムにより還元し、無水酢酸でアセ
チル化する操作を包含する。生成した単糖のポリ酢酸エ
ステル誘導体を次いでガスクロマトグラフィーにより、
標準試料と対比させて分析する。

実施例１ 本実施例は、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株ＡＴ
ＣＣ３９８９３の培養菌から変異菌株を単離する方法を
説明する。

ＡＴＣＣ３９８９３のリファンピシン耐性菌株の日常的
な継代培養中に、増殖培地に自然変異株が形成した。こ
の変異株はメタノール／アンモニウム無機塩寒天プレー
ト上でのコロニー形態が普通とは違っていたために検出
された。

このプレート上で増殖させたＡＴＣＣ３９８９３のコロ
ニーは小さく、九個で、淡橙色で、本質的に非粘液性で
あった。変異株の方のコロニーは、より大きく　（直径
約４ｕ）、色がオフホワイトないし透明であり、本質的
に非常に粘液性であった。

この新菌株（ＡＴＣＣ５３４１２）は、リファンピシン
耐性を示し、ＡＴＣＣ３９８９３菌株と同様の培養学的
および生化学的特性を示し、さらにＡＴＣＣ３９８９３
菌株との染色体ＤＮＡ　：　ＤＮＡハイブリッド形成を
行うことから、ＡＴＣＣ３９８９３の変異株であると決
定された。

自然突然変異の産物であると考えられるこの変異株ＡＴ
ＣＣ５３４１２は、ヘテロ多糖ポリ５４に相当するエキ
ソ多糖を構成的に合成することができる。

菌株ＡＴＣＣ５３４１２は、ＡＴＣＣ３９８９３の２〜
３倍の最適増殖速度を存する。

λ隻舅主 本実施例は、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株の培
養によるＭ積した量のエキソ多糖代謝産物の生産を例示
する。

ＡＴＣＣ５３４１２菌株の接種液５００　ｍｌを、ＭＳ
培地、１ｇ／ｌの塩化アンモニウムおよび増殖炭素源と
して０．５％（ｖ／ｖ）のメタノールを使用して増殖さ
せる。フラスコは３７℃で２日間インキュベーションす
る。こうして得られた培養液を使用して、ＭＳ培地１０
１　、塩化アンモニウムＩｇ／ｊ！、およびメタノール
０．５％（ｖ／ｖ）を入れた容量１４１の二ニー・プラ
ンズウィノク・マイクロファーム酩酊装置を接種する。

最初の醗酵条件は次の通りである：３７°Ｃ，攪！牢２
００　ｒｐｍ、空気流量２１　／ｍｉｎ、およびｐＨ７
，０゜ｐＨは醗酵中はぼ７．０に制御する。醗酵培地中
の炭素が消耗してきたらメタノールを断続的に追加して
、０．５９Ａ（ｖ／ｖ）の濃度を保持する。メタノール
の濃度は気液クロマトグラフィーにより測定する。２４
〜３６時間の醗酵後、撹拌速度を４０Ｏｒｐｍに増す。

メタノールが培養液により利用されなくなったら（通常
５〜７日後）、醗酵を終了させる。次いで、得られた非
常に粘稠な醗酵ブロスをイソプロパツールで希釈して（
アルコール：ブロス−２：１）、エキソ多糖の析出を助
長する。得られた析出物を口側した後、１００％イソプ
ロパツールで、次いで７０％イソプロパツールで洗浄す
る。析出したエキソ多糖をその後、強制空気Ｗｉ環式乾
燥器により５５℃で乾燥する。乾燥したエキソ多糖を次
いでウィリーミルにより粉砕して粉末状とする。かくし
て得られたエキソ多糖生成物の物理化学的性質ハ、ヘテ
ロ多糖ポリ５４について上に述べたモノと一敗している
。

芽−」−一表 Ｍｇ５Ｏｔ・７Ｈ２０１ｇ ＣａＣＩｇ　　　　　　　　　　　　０．２　ｇＮａ２
ＨＰＯ４０，３３ｇ ＫＩｂＰＯｔ　　　　　　　　　　　Ｏ，２６ｇＦｅＥ
ＤＴＡ　　　　　　　　　　　５．ＯｔａｇＮａ２Ｍｏ
Ｏｅ　・２Ｈｘ０　　　　　２．ＯｍｇＣｕＣｌｚ　・
２ＨｚＱ　　　　　　　　１．（ｌ　ｌ１ｇＦｅ５Ｏｎ
　・７Ｈｚ０　　　　　５００　　μｇＺｎＳＯｎ　・
ＩＨ＊０　　　　　　４００　　ＩｇＭｎＣＩｇ　’　
４Ｈｚ０　　　　　　２０　　μｇ８３Ｂ０．　　　　
　　　　　　１５　　μｇＣｏＣ１ｇ　’　６Ｌ０　　
　　　　５０　　ＩｇＭｎＣＩｇ・６Ｈ１０１０μｇ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）メチロフィルス・ビスコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏ
   ｐｈｉｌｕｓ　ｖｉｓｃｏｇｅｎｅｓ）の菌株ＡＴＣＣ
   ５３４１２を特徴づける菌学的性質を有する生物学的に
   純粋な培養菌。
2. （２）メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株ＡＴＣＣ５
   ３４１２の分類学的性質を示し、メタノールを細胞外ヘ
   テロ多糖に好気醗酵することのできる培養菌。
3. （３）前記細胞外ヘテロ多糖が、ヘテロ多糖ポリ５４で
   ある、特許請求の範囲第２項記載の培養菌。
4. （４）メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株ＡＴＣＣ５
   ３４１２。
5. （５）増殖炭素源を含有する栄養培地中でメチロフィル
   ス・ビスコゲネスの菌株ＡＴＣＣ５３４１２もしくはそ
   の変異株を好気条件下に培養することからなる、エキソ
   多糖の製造方法。
6. （６）増殖炭素源がＣ＿１化合物である、特許請求の範
   囲第５項記載の方法。
7. （７）増殖炭素源としてメタノールを含有する栄養培地
   中で、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株ＡＴＣＣ５
   ３４１２もしくはその変異株を好気培養して、蓄積量の
   細胞外ヘテロ多糖生成物を生産することからなる醗酵方
   法。
8. （８）増殖炭素源としてメタノールを含有する栄養培地
   中で、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株ＡＴＣＣ５
   ３４１２を好気培養して、蓄積量の細胞外ヘテロ多糖ポ
   リ５４を生産することからなる、特許請求の範囲第７項
   記載の醗酵方法。