KR900003711B1 - 발효방법, 이에 따라 생산된 헤테로폴리사카라이드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents
발효방법, 이에 따라 생산된 헤테로폴리사카라이드 및 이를 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
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Description
제 1 도는 폴리 54 및 잔탄검의 점도 비교 그래프.
제 2 도는 1%(W/V) 폴리 54의 유동 곡선 그래프이다.
본 특허출원은 1985년 2월 11일에 출원된 동시 계류중인 특허출원 S.N.700,564의 일부 계속 출원이다. 지난 10년간, C1-화합물로부터의 단세포 단백질(SCP)의 생산이 학술 및 공업 실험실에서 깊이 연구되었다. 미쓰비시 가스 화학회사, 호에크스트, 및 I.C.I.와 같은 기업들은 시험공장 연구소들을 운영해 왔으나 지금은 단지 I.C.I.만이 전규모 SCP공장을 운영하고 있다. "Pruteen"은 I.C.I.제품의 등록상표이며 결국 분리되고 분말 또는 과립으로 건조된 절대적 메탄산화 세균, 메틸로필러스 메틸로트로푸스(Methylophilus methylotrophus) 의 발효에 의해 제조된 것이다. 메틸로필러스 메틸로트로푸스는 포름알데히드 고정의 리불로오스 모노포스페이트 회로(RMP)를 사용하는 절대적 메탄산화세균이다. 메틸로필러스메틸로프로푸스 균주 AS-1은 그람 음성이고, 한개의 극성편모를 갖는 무색 간균이다.
SCP생산에 있어서, 메탄올 공급원료는 조작비용 중 높은 퍼센트를 구성하여, 미생물 성장속도 수득율의증가는 SCP생산의 조작비용에 직접적으로 영향을 미친다. 이 이유 때문에, I.C.I.는 메틸로필러스 메틸로트로푸스(Methylophilus methylotrophus) 미생물의 게놈을 개조하여 세포수율을 높이는데 제조합 DNA기술을 적용했다. 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)로부터의 더욱 효과적인 글루타메이트 디히드로게나제 질소동화계를 위한 유전자를 클로닝하고 메틸로필러스 메틸로트로푸스 균주에 삽입한다. 이 균주는 윈다스일행의 Nature 287 396(1980)에 기술된 바와같이, DNA변이 수단에 의해 차단된 효율이 적은 글루타메이트 실라제 질소동화계를 갖는다.
메탄올이 일반적으로 단세포 단백질 생산의 기질로 생각되어지지만, SCP제조에 적합하게 하는 요인들은 엑소폴리사카라이드 같은 축적된 세포의 대사물 생성의 포텐설 피이드스톡으로 메탄올이 추천된다. 메탄올을 가치-부여 생성물로 전환시키는 다수의 미생물 공정이 개시되어 왔으나 일반적으로 이들은 아미노산과같은 저부피/고가 화합물이다. 그러므로 Proc. Soc. Gen. Microbial, 5, 43(1987)에서 J. 볼보르 및 C.안토니는 슈도모나스(Pseudomonas) AMI의 피루베이트 디하이드로 게네스 결함 변이주를 메탄올에서 배양할 때 알라닌과 발린의 아미노산을 축적할 수 있음을 발견하였다. Agric. Biol, Chem.,42, 2275(1978)에서 Y. Tani일행은 아트로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis) 균주를 사용하여 메탄올로부터 L-세린을 리터당 5.2g까지 생산하는 것을 기술했다. 현재까지 메탄올이 용적 화학제의 상품 형태로 생전한되는 보고가 없었다.
따라서, 본 발명의 목적은 C1-화합물을 세포외 대사물의 축적된 양으로 생전환하는 발효방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 메탄올 기질을 엑소폴리사카라이드의 축적양으로 생-산화(bio-oxidation)하기 위한 금속성장 배양배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 신규의 조건적 메탄산화 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 균주 ATCC 39893(KCTC 8238P : 1987년 3월 25일)의 동정특성을 갖는 메탄산화 미생물 균주를 제공하는 것이다.
본 발명외 목적은 수성용액에의 가소성 및 요변성을 부여하는데 적당한 성질을 나타내는 신규한 헤테로폴리사카라이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 잇점은 하기의 설명 및 실시예로 자명해질 것이다.
본 발명의 하나 또는 그 이상의 목적은 (a) 호기성, 그람-음성, 막대형, 운동성 및 극성 편모세포 : (b) 리불로오스 모노포스페이트 통로를 거쳐 메탄올을 동화시킬 수 있는 메탄산화균 : (c) 푸럭토오스상에서 성장가능 : (d) 30。- 43℃의 배양배지 온도에서 최적의 성장속도를 나타냄으로 구성된 동정특성을 갖는 세균의 신규종을 제공함으로 성취할 수 있다.
일반적으로 본 발명의 신규 세균균주는 글루코오스 디히드로게나제 활성을 나타낸다.
특정 구체예에서 본 발명은 균주 ATCC 39893의 동정특성을 갖는 세균배양물을 제공하고 상기 배양물은 메탄올을 헤테로폴리사카라이드의 세포외 축적으로 생전환시킬 수 있다.
기탁번호 ATCC 39893균주의 부배양기는 매릴렌드 20852, 록크빌래, 파크로운드라이브, 12301 미국형 배양수접소의 영구적 미생물 수집에 요청하여 얻을 수 있다. 미생물 기탁은 특허공정의 목적을 위해 브다폐스트 조약에 따른다.
균주 ATCC 39893의 동정특성을 갖는 세균균주는 메틸로필러스 메틸로트로푸스(Methylophilus methylotrophus)와 같은 공지의 메탄산화종의 어떤 일원도 아니다. 분류학적 확인을 위해서 메틸로필러스비스코게네스(MethyIophilus viscogenes)는 균주 ATCC 39893의 동정특성을 갖는 세균균주를 포함하는 새로운 조건적 메탄산화종으로 지정한다.
여기서 사용된 "메탄산화균"이라는 용어는 탄소-탄소결합을 갖지 않고 하나 또는 그 이상의 탄소원자를 갖는 탄소화합물상에서 비-독립영양균적으로 성장할 수 있는 미생물을 말한다. "독립영양적"은 이산화탄소 기질상에서 성장하는 것을 말한다.
여기서 사용된 "조건적 메탄산화균"이라는 용어는 하나 또는 그 이상의 이종성기질, 예를 들면 푸럭토오스상에서 성장할 수 있는 메탄산화균을 달한다.
여기서 사용된 "C1-화합물"이라는 용어는 어떠한 탄소-탄소 결합도 갖지 않는 메탄올, 포름알데히드, 포로메이트, 포름아미드, 일산화탄소, 디메틸에테르, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민 및 트리메틸아민N-옥사이드와 같은 유기화합물을 말한다.
여기서 사용된 "엑소폴리사카라이드"라는 용어는 발효배지에 세포외 대사물로 축적된, 잔탄검으로 예시되는, 폴리사카라이드를 말한다.
여시서 사용된 "헤데로폴리사카라이드라는 용어는, 적어도 두개의 서로 다른 종류의 만노오스 및 갈락토오스 같은 단당류 단위체로 구성된 폴리사카라이드를 말한다.
여기서 사용된 "리불로오스 모도포스페이트 경로"(RMP)라는 용어는 포름알데히드 3분자가 축합되어 피루베이트 1분자 또는 디히드록시아세톤 포스페이트 1분자를 생산하는 생화학적 회로를 말한다.
리불로오스 모노포스페이트 경로 및 그 변경의 설명에 관한 생화화적 문헌에는 스트름 일행의 생화확. J.144, 465(1974) : C. 안토니의 Sci. Prog.,62,167(1975) ; 및 콜비 일행의 생화학. J.,148,513(1975)이 있다.
리불로오스 모노포스페이트 통로는 G-포스포글루코네이트 디히드라제/포스포-2-케토-3-디글루코네이트 알도라제 ; 푸럭토오스 디포스페이트 알도라제 ; 글루코오스-6-포스페이트 디히드로게나제 ; 3-헥술로스 포스페이트 신타제 ; 포스포푸럭토키나제 ; 포스포글루코아이소머라제 ; 포스포-3-헥술로스 아이소머라제 ; 포스포리보아이소머라제 ; 리불로스-5-포스페이토 3-에피머라제 ; 트랜스알도라제 ; 트랜스케토라제 ; 세도헵률로스 디포스페이트 알도라제 ; 및 세도헵툴로스-1,4-디포스파타제를 포함하는 효소들을 함유한다.
RMP회로는 효과적으로 포름알데히드 3분자와 리불로오스 5-포스페이트 3분자를 축합시켜서 푸럭토오스6-포스페이토 3분자를 형성하고 이것은 다시 회로를 경유하여 디히드록시아세톤 포스페이트 또는 피루브산1분자를 생산하면서 리불로오스 5-포스페이토 3분자를 재생산한다. 이들 대사물들을 세포적 생합성의 기질로 작용한다.
이 회로의 두개의 주요 효소는 헥술로오스 포스페이트 신타제 및 헥술로오스 포스페이트 아이소머라제이고 이들은 포름알데히드 및 리불로오스 5-포스페이트를 축합하고 생성물을 푸럭토오스 6-포스페이트로 전한시키는 효소들이다. RMP회로의 알려진 두 변경, 즉, 디히드록시아세톤 포스페이트를 생산하는 푸럭토오스 비포스페이트 변경 및 피루브산을 생산하는 엔트너-도우도로프 변경이 있다.
메틸로필러스비스코게네스(Methylophilus viscogenes) 종덱사스 비숍의 메탄올 제조공장의 작업지 부근에서 유래된 토양 및 물의 표본상에서 일련의 분리를 수행한다. 표본에서 메탄올-이용 미생물의 존재를 선별한다.
각 표본 일부분을 메탄올(0.5% V/V) 및 적당한 영양배지, 예를 들면 표 I 에 나타난 것과 같은 무기염(MS)배지, +염화암모늄을 러터당 1g 포함하는 250ml들이 얼렌미어 플레스크에 주입한다. 플레스크는 30。- 55℃범위의 여러가지 온도에서 항온 처리한다. 발생한 성장을 나타내는 탁도를 검출한 후, 표본 2ml를제거하여 유사한 배지의 살균 플라스크에 주입한다. 다수의 연속적 부배양기들을 각각의 원 표본에서 취하고 배양기를 한천 평판 배지상에 도말하여 메탄올-동화 미생물의 순수배양을 얻을 수 있는 단일 미생물-유도 집락을 얻는다. 이러한 방식으로 균주 ATCC 39893을 분리하고 생물학적으로 순수한 배양물로 얻는다.
메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogenes) 균주는 다른 메탄산화 세균으로부터 구별되는 성질의 신규한 조합을 나타낸다. 균주 ATCC 39893파 같은 메틸로필러스 비스코케네스(Methylophilusviscogenes) 세균은 C1동화의 리불로오스 모노포스페이트 통로를 이용하고, 35。-40℃에서 1-3시간의 배가시간을 나타내는 성장속도를 갖는 형태1의 조건적 메탄산화균이다.
균주 ATCC 39893은 메탄올, 푸럭토오스 및 글루코오스상에서 성장한다. 첨가로 이것은 포르메이트 또는 메탄올 형태의 외부에너지 공급이 존재할때 넓고 다양한 이종성 기질(예를 들면 석시네이트 및 피루베이트)상에서 성장한다. 이것은 임의의 공지 미생물에는 없었던 성질이다. 확인을 위해서, 이 현상을 나타내는 세균을 "잠재조건적 메탄산화균"으로 정의한다.
균주 ATCC 39893의 것들로 구성된 특성을 갖는 세균은 고체 배지상에 연한 오렌지색 집락의 비-점액성 성장으로 확인된다. 메탄산화 세균의 균주 ATCC 39893형의 다른 동정특성은 단백질 mg당 분당 적어도 약400나노몰의 NADH를 형성하는 헥술로오스 포스페이트 신타제/헥술로스 포스페이트 아이소머제 활성(J.P.van DijkenetaI : FEMS. Microbial. Lett,4, 97,1978)이다.
조건적 메탄산화균의 균주 ATCC 39893형의 중요한 성질은 메탄올 기질을 수성용액에 의가소성 및 요변성을 부여하는 엑소 폴리사카라이드의 축적양으로 생전환시키는 능력이다. 균주 ATCC 39893세균은 다양한 배양조건하에서 세포성장의 부재 또는 존재시 배양배지내에 다량의 축적된 엑소폴리사카라이드를 생산하는능력에 있어서 특히 유일하다. 균주 ATCC 39893세균은 유용한 탄소원 다량을 엑소폴리사카라이드 생합성으로 돌리는 고유의 능력을 가진다.
세균 균주 ATCC 39893형의 다른 특성은 대수 성장기에 반대되는 성장의 비대수적 패턴이다. 균주ATCC 39893 배양물은 비제한 대수성장을 방지하는 자연대사 장애를 나타낸다. 발효배지에 비타민, 아미노산 또는 효모 추출액과 같은 여러가지 성장인자를 보충해줄 때, 비대수성장에 영향을 미치지 않는다.
메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogenes) 균주는 탄소원, 질소원, 염 및 여러가지 성장촉진제로 구성된 영양 배지에서 호기적으로 배양할 수 있다.
적당한 질소원에는 황산암모늄, 염화암모늄, 암모니아, 인산이암모늄, 질산암모늄, 질산나트름, 우레아, 옥수수담금액, 카제인, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물 및 이와 유사한 것이 있다.
적당한 무기염에는 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 인산염, 철염, 망간염, 아연염, 구리염 및 이와 유사한것이 있다. 세균성장 촉진제는 대두 단백질 가수분해물, 효모추출물, 비타민 및 아미노산이 있다.
영양 배지내에서의 미생물의 배양은 전형적으로 배양기를 흔들거나 담금으로서 약 6.7-7.1의 pH 및35。- 40℃의 온도에서 호기적으로 수행한다.
상기한 배양조건을 사용하여, 본 발명의 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogenes) 균주는 높은 속도로 탄소원을 이용하면서 엑소폴리사카라이드를 고농도로 생산하고 축적한다.
균주 ATCC 39893은 메탄올이 성장 탄소원으로 사용될때 배양배지를 기준으로 리터당 약 10g까지의 양으로 엑소폴리사카라이드를 생산할 수 있다. 엑소폴리사카라이드의 수율은 전형적으로 사용된 메탄올의 양을 기준으로 약 30-60%범위이다.
따라서 다른 구체예에서 본 발명은 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogenes) 균주를 성장탄소원(예를 들면, C1-화합물 또는 푸럭토오스)을 포함하는 영양배지에서 호기적으로 배양하여 축적된 세포외 생산물로 헤테로폴리사카라이드를 생성하는 것으로 구성된 헤테로폴리사카라이드 생산방법을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 메틸로필러스 비스코게네스(MethyloPhilus viscogenes) 균주 ATCC 39893또는 그 변종을 성장 탄소원으로서 메탄올을 포함하는 영양배지에서 호기적으로 배양하여 축적된 세포의 생산물로 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 생산하고 임의적으로 배양배지로부터 상기 생성물을 회수하는 것으로 구성된 헤테로폴리사카라이드 생산방법을 제공한다.
발효작업이 완료된 후, 전세포를 원심분리, 한외여과 또는 가열살균과 같은 관례적 수단으로 육즙으로부터 제거한다. 헤테로폴리사카라이드를 수용성 유기용매, 예를 들면, 아세톤, 메탄올, 에탄올 및 이와 유사한 것으로 냉동-건조 또는 침전과 같은 임의의 관례적 방법으로 상등액으로부터 회수한다. 헤테로폴리사카라이드는 칼슘염으로 그 용액을 처리함으로 생성물을 제공할 수 있다.
원료의 헤테로폴리사카라이드는 물에 재용해시킬 수 있고, 그 다음에 그 수성용액을 투석 및 친액화시켜서 정제된 생성물을 제공한다.
신규한 혜테로폴리사카라이드 폴리 54 생성물은 약 800,000-1,500,000범위의 평균 분자량을 갖는다.
헤테로폴리사카라이드 폴리 54는 25℃에서 부룩필드 RVT 점도측정기 스핀들 4호로 측정하여, 12RPM에서 2100cps의 0.5%점도를 나타낸다. 헤테로폴리사카라이드 폴리 54의 수성용액은 무색 투명하고 의가소성및 요변성 점도특성을 나타낸다. 수성용액 점도특성은 130℃까지의 온도 및 약 12까지의 pH값에서 적당하다.
저전단율 조건하에서, 헤테로폴리사카라이드 폴리 54는 상업적 잔탄검의 약 5-30배의 겉보기 점도를 나타낸다. 전단 조건하에서의 헤테로폴리사카라이드 폴리 54 및 상업적 잔탄검(예를 들면 켈잔)의 점도특성비교는 제 1 도에 나타냈다.
헤테로폴리사카라이드 폴리 54의 수성용액의 의가소성은 1%(W/V) 폴리 54외 유동곡선인 제 2 도에 나타냈다. 제 2 도의 윗 곡선과 밑의 곡선의 차이는 중합체용액이 요변성을 갖는다는 것을 나타내는 것이다.
헤테로폴리사카라이드 폴리 54는 수성용액에 증점제로 적용하기에 뛰어난 성질을 갖는다. 헤테로폴리사카라이드 폴리 54는 친수성검 같은 하나 또는 그 이상의 수용성 폴리사카라이드와 조합하여 또는 단일로 사용할 수 있다. 친수성검에는 잔탄검, 및 타마린드검이 있고 구아검 및 로쿠스트 콩 검과 같은 폴리갈락토 만난 검이 있다.
수성용액내의 점도 증가효과의 상승적 보강은 헤테로폴리사카라이드 폴리 54가 구아검, 로쿠스트 콩 검, 타라검, 전분 또는 카르복시메틸셀룰로오스와 조합되어 사용될때 관찰된다.
헤테로폴리사카라이드 폴리 54의 다른 물리화학적 및 구조적 특징은 다음과 같다.
A. 구성당(몰비)
글루코오스 10
갈락토오스 7-10
만노오스1-3
글리쿠른산 1-3
폴리 54는 약 l-3wt%의 질소를 포함한다. 폴리 54는 피루베이트 또는 단백질을 포함하지 않고, 4개의 단당류 단위당 약 하나의 아세틸기를 포함한다. 글리쿠론산 성분은 글루쿠론산 및/또는 갈락투론산 및/또는 만누론산으로 구성되어 있다.
B. 원소분석(%)
C 39.2
H6.1
O 43.1
N2.17*
*평균치 ; 회분 보정함.
C. 용융점
분명한 용융점이 없고 약 150℃이상의 온도에서 분해된다.
D. 적외선 스펙트럼
지방족 에스테르기를 나타내는 1740cm-1에서 밴드가 나타나고 아미드기를 나타내는 1650cm-1및 1540-1에서 밴드가 나타난다.
E. 자외선 흡수 스펙트럼
자외선 파장 범위에서 피이크가 나타나지 않는다.
F.용해성
물에는 용해되나 모든 보통의 유기용매에는 용해되지 않는다.
G. 특이적 회전
특이적 회전이 측정되지 않는다.
본 발명의 헤테로폴리사카라이드는 미합중국 특허 제 4,514,563 호에 개시된 폴리사카라이드와는 조성 및 성질이 다르다. 미합중국 특허 제 4,514,563 호의 폴리사카라이드는 주로 (a) 글로코오스,(b) 갈락토오스,(c) 만노오스 및 (d) 클루쿠론산으로 구성되어 있다. (a) : (b) : (c) : (d)의 몰비는 10 : 3-6 : 0.5-2 : 0.5-2이다.
미합중국 특허 제 4,514,563 호의 전형적인 폴리사카라이드는 아세토박터 폴리사카토겐스(Acetobacter polysacchargenes) MT-11-2 또는 MF-8과 같은 초산세균에 의해 생산될 수 있다. 폴리사카라이드는아세틸 또는 피루브산 성분을 포함하지 않고 질소를 포함하지 않는다. 1% 수성용액의 점도는 분당 30회전의 스핀들 속도 및 25℃에서 부룩필드형 점도측정기로 결정하여 500-1200센티포이즈이다.
다음의 실시예는 본 발명을 더욱 상제히 설명한다. 조성 및 특정 성분은 전형적인 것이 존재하며 여러가지 개조가 본 발명의 범위내에서 하기 기술내용에서 유도될 수 있다.
메탄올-동화세균의 성장을 위해, 무기염 배지(MS)(표 I)를 사용한다. 배지에 1g/L 질산칼륨을 보충하여 질산무기염 배지(NMS)를 형성하거나 1g/L 염화암모늄을 보충하여 암모늄 무기염 배지(AMS)를 형성한다. 탄소원, 메탄올은 바람직하게는 0.2-0.5%(V/V)외 농도로 존재한다.
고형 배지에서 살균에 앞서 디프코 박토-한천 17g/L을 염기성 무기염 배지(인산염제외)에 첨가한다. 살균한 인산염 용액을 냉각시에 살균한 무기염 배지에 무균적으로 첨가한다.
발효공정은 뉴 브룬스윅 마이크로 폐름(141)에서 수행한다. 작업부피를 101이용하고 메탄올을 발효조 살균후에 무균적으로 첨가한다. 200rpm의 교반속도를 2lm-1의 공기유속과 함께 보통 사용한다. 발효조에는 pH 및 용해산소 조절창치가 되어 있다.
헥술로오스 포스페이트 신타제 활성의 생성물인 헥술로오스 6-포스페이트에 대한 분석이 없기 때문에 헥술로오스 포스페이트 신타제/헥술로오스 포스페이트 아이소머라제를 동시에 분석한다. 헥술로오스 포스메이토 아이소머라제는 헥술로오스 6-포스페이트를 글루코오스-6-포스페이트로 전환시키며 이는 글루코오스6-포스페이트 디히드로게나제를 사용하고 이어서 340nm에서 수반되는 NADP+환원으로 평가할 수 있다.효소분석 용액은 최종 농도로 인산염 완충액 pH 7.2, 50mM; 염화마그네슘 2.5mM : 글루코오스 6-포스페이트 디히드로게나제 0.7단위; 포스포글루코아이소머라제 0.75단위 ; 포스포리보스 아이소머라 제 1.75 단위 ; 리보스 5-포스페이트 5mM; NADP+ 0.25mM : 및 포름알데히드 5mM을 포함한다.
히드록시피루베이트 리덕타제의 존재는 미생물의 포름알데히드 동화의 세린 통로를 나타낸다. 이것은 최종 농도로 인산칼륨 pH 6.3 1M : 히드록시피루베이트 리튬 0.01M : 및 NADH 2mM을 포함하는 효소분석 용액으로 결정한다. NADH 소멸은 340nm에서 측정한다.
글리세롤 및 디히드록시아세톤 판단은 클리세를 디히드로게나제/디히드록시아세톤 리덕타제(글리세롤 : NAD+2-옥시도리덕타제, EC 1.1.1.6)로 성취할 수 있다. 효소는 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacteraerogenes)로부터 유도되고 시그마 바이오 켸미칼사로부터 구입할 수 있다.
글리세롤 판단을 위해서는 반응혼합물(1.0ml)은 TRIS-HCl 완충제 pH 9.7(시그마 바이오케미칼) 5μ몰, 효소 1단위 및 글리세롤(또는 시험용액/발효육즙 20-50μl) 15μ몰을 포함한다. 분석은 기질을 첨가함으로 시작하고 이어서 벡크만 모델 25UV 분광광도 계로 340nm에서의 흡광도 증가를 감시한다.
디히드록시아세톤 판단을 위해서는 반응혼합물(1.0ml)은 인산염 완충제 pH 6.0 50μ몰; NADH 0.5μ몰 ; 효소 1단위 ; 디히드록시아세톤(또는 시험용액/발효육즙,20-50μml) 15μ몰을 포함한다. 분석은 기질을 첨가함으로 시작하고 이어서 340nm에서의 흡광도 감소를 감시한다.
엑소폴리사카라이드(예를 들면 헤테로폴리사카라이드 폴리 54)는 메틸로트로푸스 비스코게네스(Methylotrophus viscogenes) 균주 배양 작업완료 후 회수한다. 육즙을 발효조로부터 제거하고 전세포롤 원심분리(13,000×g에서 10분간)하여 제거한다. 엑소폴리사카라이드는 보통 용액으로부터 이소프로판을 첨전시켜 분리한다.
엑소폴리사카라이드 수성용액상에서의 유동학적 측정은 웰스/부룩필드 콘/플래이트 디지탈 점도측정기 또는 동축실린더 감지계를 갖춘 레오매트 30 점도측정기상에서 행한다.
비교 점도측정에 사용된 잔탄검은 켈코사의 시판 제품인 켈잔이다.
엑소폴리사카라이드의 단당류 함량분석은 가수분해-기체 액체 크로마토그라피법으로 수행한다. 이 방법은 수성의 트리플루오로초산 용액내의 엑소폴리사카라이드를 가수분해하고 붕화수소 나트륨으로 환원시키고 초산 무수물로 아세틸화하는 것을 포함한다. 단당류의 폴리아세테이트 유도체는 표준과 비교하여 기체 크로마토그라피로 분석한다.
[실시예]
이 실시예는메틸로트로푸스 비스코게네스(Methylotrophus viscogenes)균주를배양하여 엑소폴리사카라이드 대사물 축적량을 형성하는 것을 나타낸다.
균주 ATCC 39893 500m1 주입물을 MS배지, 1당 염화암모늄 1g, 및 성장 탄소원으로서 0.5%(V/V) 메탄올을 사용하여 배양한다. 플래스크를 37℃에서 2일간 항온처리한다. MS배지 10l, l당 염화암도늄 1g 및 메탄올 0.5%(V/V)를 포함하는 14l들이 뉴 브룬스윅 마이크로페름 발효조에 상기 배양물을 주입한다.
초기 발효조건은 다음과 같다 : 37℃, 200rpm으로 진탕, 공기유동 2l/분, 및 pH 7.0, pH는 발효시 약7.0으로 조절한다. 메탄올은 발효배지에 탄소가 고갈될 때마다 간헐적으로 첨가하여 0.5%(V/V)의 농도를제공한다. 메탄올의 농도는 기체-액체 크로마토그라피로 결정한다. 24-36시간의 발효 후, 진탕속도를 400rpm까지 증가시킨다.
배양물이 메탄올을 더이상 사용할 수 없을 때(보통 5-7일) 발효가 종결된다. 높은 점성의 발효육즙을 이소프로판올로 희석하여(알코올 : 육즙,2 : 1) 엑소폴리사카라이드의 침전을 용이하게 한다. 결과 형성된 첨전물을 여과하고 l00% 이소프로판을 및 70% 이소프로판올로 씻는다. 침전된 엑소폴리사카라이드를 강화 공기오븐내 55℃에서 건조시킨다. 건조된 엑소폴리사카라이드를 계속적으로 윌리분쇄기에서 분말로 분쇄한다. 엑소폴리사카라이드 생성물의 물리화학적 성질은 헤테로폴리사카라이드 폴리 54에 대해 상기한 것과 같다.
대체적인 공정의 구체예에서, 다음의 공정에 따라 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 발효육즙으로부터 회수하고 정제한다.
발효종결시, 발효육즙을 탈이온수로 1 : 1로 희석하고 10,000rpm에서 20분간 원심분리하여 미생물 세포와 고형물질을 분리한다. 육즙을 물부피를 자주 바꾸면서 72시간동안 탈이온수로 투석한다.
육즙에 2부피의 이소프로판올을 첨가하여 백색의 섬유성 침전물로서 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 연는다. 첨전물을 수집하고 이소프로판올로 씻고 진공오븐에서 건조시킨다. 백색 침전물을 탈이온수에 재용해시키고 용액을 상기와 같이 원심분리한다. 생성물을 이소프로판올로 침전시키고, 여과하고 건건하여 정제된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 생산한다.
[표 1]
MS 배지
MgSO4·7H2O 1g
CaCl20.2g
Na2HPO40.33g
KH2PO40.26g
FeEDTA 5.0mg
Na2MoO4·2H2O 2.0mg
CuCl2·2H2O 1.0mg
FeSO4·7H2O 500㎍
ZnSO4·7H2O 400㎍
MnCl2·4H2O 20㎍
H3BO415㎍
CoCl2·6H2O 50㎍
NiCl2·6H2O 10㎍
EDTA 250㎍
H2O 1l pH 6.8
Claims (21)
- 성장 탄소원을 포함하는 영양배지내 호기적 조건하에서 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilusviscogenes) ATCC 39893(KCTC 8238P)균주를 배양하는 것으로 구성된 엑소폴리사카라이드 생산방법.
- 제 1 항에 있어서, 성장 탄소원이 C1-화합물인 방법.
- 성장 탄소원으로 메탄올을 포함하는 영양배지내에서 메틸로필러스 비스코게네스 ATCC 39893(KCTC8238P)균주를 호기적으로 배양하여 세포외 헤톄로폴리사카라이드 생성물 축적량을 생성하는 것으로 구성된 발효방법.
- 제 3 항의 발효방법에 따라 생산된 헤테로폴리사카라이드.
- 성장 탄소원으로 메탄올을 포함하는 영양배지내에서 메XLF로필러스 비스코게네스 균주 ATCC 39893 KCTC 8239P을 호기적으로 배양하여 세포외 헤테로폴리사카라이드 폴리 54 축적량을 생성하는 것으로 구성된 발효방법.
- 몰비로 약 글루코오스 10, 갈락토오스 7-10, 만노오스 1-3 및 글리쿠론산 l-3이 포함되는 단당류들로 구성되고, 단당류 3-5단위당 약 하나의 아세틸 치환체를 포함하고, 수성용액에 의가소성 및 요변성을 부여하는 헤테로폴리사카라이드 친수성검.
- 제 6 항에 있어서, 질소 약 1-3중량%를 포함하는 헤테로폴리사카라이드.
- 제 6 항에 있어서, 글리쿠론산이 글루쿠론산, 갈락투론산 또는 만누론산으로 되는 헤테로폴리사카라이드.
- 제 5 항의 방법에 따라 생산된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54.
- (1) 제 9 항의 헤테로폴리사카라이드 폴리 54 및 (2) 수용성 폴리사카라이드의 혼합물로 구성된, 수성용액에 증점제로 적용하기 위해 채택된 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 폴리사카라이드가 친수성검인 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 폴리사카라이드가 구아검인 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 폴리사카라이드가 로쿠스트용 검인 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 폴리사카라이드가 잔탄검인 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 폴리사카라이드가 타라검인 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 폴리사카라이드가 타마린드검인 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 폴리사카라이드가 전분인 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 폴리사카라이드가 카르복시메틸셀룰로오스인 조성물.
- 증점제로서 (1) 제 9 항의 헤테로폴리사카라이드 폴리 54 및 (2) 수용성 폴리사카라이드의 조합물을 포함하는 수성용액 .
- 제 19 항에 있어서, 폴리사카라이드가 친수성검인 수성용액.
- 제 19 항에 있어서, 폴리사카라이드가 전분인 수성용액.
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