KR910008646B1 - 새로운 다당류계 생물 고분자 물질 및 그 제법 - Google Patents

새로운 다당류계 생물 고분자 물질 및 그 제법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

새로운 다당류계 생물 고분자 물질 및 그 제법
제1도는 본 발명에 의한 다당류계 생물 고분자 물질의 자외선 분광 스펙트럼.
제2도는 본 발명에 의한 다당류계 생물 물질의 적외선 스펙트럼.
제3도는 본 발명에 의한 다당류계 생물 고분자 물질과 표준시료의 겔 침투 크로마토그라피의 전개 모습을 나타낸 그라프.
제4도는 본 발명에 의한 다당류계 생물 고분자 물질의 결정 그라프.
제5도는 본 발명에 의한 다당류 용액의 전단 (교반) 속도와 전단 응력간의 관계를 나타낸 그라프.
제6도는 본 발명에 의한 다당류 용액의 전단(교반) 속도와 점도간의 관계를 나타낸 그라프.
본 발명은 미생물을 이용하여 탄소원과 에너지원으로 메탄올을 기질로 하여 발효시켜 제조한 새로운 다당류계의 생물 고분자 물질과 그 제법에 관한 것이다.
미생물 발효를 통하여 제조되는 다당류계 생물 고분자의 가장 대표적인 것은 포도당 등의 탄수화물을 기질로 하여 제조한 크산탄(xanthan)이 있다. 크산탄은 화학적으로 포도당, 만노스, 그리고 클루쿠론산으로 조성되어 있는데, 그 분자량은 약 200만 달톤(dalton)에 이른다. 이것은 용액류에 소량만 첨가하여도 그 점도가 매우 증가되므로, 용액류의 점도 증진제, 고체 분말 입자의 현탁성 증진제, 그리고 2차 원유 회수 공정에서의 수율 증가제 등으로 널리 이용되고 있다(ACS Symposium Series No. 45, 144-160, 1977). 상기 크산탄의 제법을 간단히 설명하면 다음과 같다(Adv. Appl. Microbiol. 23, 19-49, 1978). 즉 기질로서 탄소원 및 에너지원인 포도당이나 자당 등의 탄수화물 2-5%, 질소원인 알콜 발효 슬러리로부터 추출하여 건조시킨 불말 0.8%, 인산염 0.5%, 그리고 마그네슘 0.01%를 함유한 배지 내에서 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)를 사용하여 pH 6.8, 온도 25-35℃ 부근에서 2-4일 발효시키면, 소비된 탄소원의 50-70%의 수율로 다당류인 크산탄이 생산된다. 그러나, 비교적 고가의 탄수화물 계통의 당을 기질로 사용하고 있기 때문에, 저렴한 탄소원을 이용할 수 있는 공정의 개발이 필요하다.
본 발명에서는 값이 저렴하며(5-70원/kg) 전세계적으로 매년 백만톤 이상 과잉 생산되고 있는 C1-화합물의 일종인 메탄올을 사용하여 새로운 생물 고분자를 제조하는 것을 주목적으로 하고 있다.
본 발명에서 얻은 새로운 다당류는 자연계에서 생물체에 의하여 자연적으로 용이하게 분해될 수 있기 때문에, 사용시 난분해성의 화학 합성 고분자와는 달리 공해 문제가 전혀 일어나지 않는다는 특징이 잇고, 또 기질로서 현재 세계적으로 가장 값이 싼 메탄올을 사용하기 때문에, 생산비용이 저렴하다는 장점이 있다. 용도는 식품 공업과 석유 화학 공업 등에서 점도 증진제로 사용될 수 있다. 또한, 겔(gel) 형성시 수분의 흡수량이 많기 때문에, 흡수제나 겔 형성제로서의 이용 가능성이 매우 높다.
본 발명에 의한 새로운 다당류계 생물 고분자는 통성(通性) 메틸로트로프(facultative methylotroph) 메틸로박테리움 오르가노필름(Methylobacterium organophilum) 또는 이 균주를 통상적인 돌연변이법으로 변이시켜 얻은 변이주를 사용하여, 배양기내에 탄소원으로서 메탄을 용액을 간헐적으로 첨가하여 배약기 내의 메탄올의 농도를 0.2-1.0%정도로 유지시키고 질소원으로는 암모늄염, 질산염, 요소 등의 무기원이나 효모 엑기스, 펩톤(peptone), 카사미노산(casamino acid)등의 유기원을 0.02-0.5%, 또 인산염 0.05-0.2%, 및 0.01%미만의 마그네슘 및 칼슘 등의 원소가 미량 함유된 배지에서 2-4일간 배양하였다. 이때 다당류의 전구 물질로서 포도당, 만노스, 갈락토스 또는 숙신산염 등을 0.5%정도 첨가할 수도 있다.
본 발명에 사용된 미생물 메틸로박테리움 오르가노필룸은 자유로이 분양 및 입수가능한 상태에 있는 공지된 균주로서 미합중국 미생물 보존 기관인 ATCC로부터 ATCC 27886의 번호로 또는 영국의 미생물 기관인 NCIB로부터 NCIB 11278의 번호로 용이하게 입수할 수 있다.
미생물 발효 조건은 살균된 배지에 상기 균주 메틸로박테리움 오르가노필룸을 접종한 다음, pH 5-8 및 온도 25-37℃로 하고, 배양액내의 용존 산소가 포화 농도의 10-50%정도가 되도록 유지하기 위하여 통기량 0.2-2.0vvm 및 교반 속도 300-1,000rpm의 교반 조건하에서 통상의 회분 발효 공정 또는 이단식 회분 발효 공정, 또는 유가식 발효 공정에 의하여 발효를 수행하였다.
위와 같은 배양 과정을 수행한 뒤 통산적인 방법으로 배양약내의 미생물을 원심 분리기로 제거하고, 아세톤, 에탄올 또는 메탄올과 같은 유기 용매를 이용하여 생산된 다당류를 침전시킨 후 탈염(脫鹽)과정을 수행함으로써 순수하게 분리하였다. 분리 - 정제 과정을 거친 후 건조하여 얻은 다당류계 생물 고분자의 구성성분 및 성질은 아래와 같았다.
1) 원소 분석 결과, 탄소는 25-35%, 질소는 0.2-1.0%, 수소는 3-6%, 산소는 35-50%, 그리고 회분이 5-30% 확인되었다.
2) 자외선 분광계로 조사한 결과, 핵산은 없으나, 단백질이 존재함이 확인되었다.(제1도).
3) 적외선 분광계로 조사한 결과, 원래 당에 포함되어 있는 그룹이외에 아민기(3400-3500cm-1), 아미노기(1610-1655cm-1), 및 케톤기[1710-1740cm-1(C=O), 1050-1090cm-1(C-O)]가 존재함이 확인되었다(제2도).
4) 페놀-황산법으로 분석한 결과, 유기물의 총함량은 건조 중량의 70-95%로서 유기물은 단백질 2-10%[로리(Lowry)법] 및 유기산 5-15%(피루브산 : 유론산 : 초산 = 4 : 8 : 1)와 나머지는 탄수화물로 구성되어 있음이 확인되었다.
5) TLC 와 HPLC방법으로 분석한 결과, 탄수화물은 글루코스 20-40%, 갈락토스 30-50%, 그리고 만노스 20-35%로 구성되어 있음이 확인되었다.
6) 오콘(Ocon)등의 분석법에 의하여 확인한 결과, 폴리히드록시 부티르산은 검출되지 않았다.
7) 다당류의 분자량은 겔 침투 크로마토그라피(gel permeation chromatoraphy)에 의하여 결정한 결과, 약 2-6×106달톤이었다. 지금까지 가장 잘 알려진 크산탄의 분자량이 5-20×106달톤, 풀룰란(pullulan)의 분자량이 1-5×105달톤인 것에 비하면, 본 발명에 의한 신규의 다당류계 생물 고분자의 분자량이 월등히 높다(제3도 및 제4도).
8) 본 발명에 의한 신규의 다당류계 생물 건조 시료를 다시 pH 6-8의 증류수에 용해시켜 얻은 0.1-1% 다당류 용액의 점성 특성은 비뉴톤성으로서 전형적인 가짜 플라스틱(pseudo-plastic) 성질을 나타내며, 겉보기 점도는 용액중의 상기 생물 고분자의 농도의 증가에 따라 현저하게 증가한다(제5도 및 제6도). 실례로서 1% 용액의 경우 겉보기 점도는 전단 속도가 1sec-1일 때 약 18,000cp로서 같은 농도의 크산탄 용액의 점도보다는 약 10배, 그리고 풀룰란 용액의 점도보다도 약 200배 가까이 높은 것으로 나타났다.
9) 용액의 pH 및 온도에 대한 안정성을 조사한 결과, pH 2-13 및 온도 15-60℃까지는 용액의 점성 특성 및 겉보기 점도는 전혀 변함 없이 안정하였으며, 그 이상의 온도에서는 온도가 증가함에 따라 뉴톤성으로 변하며, 점도 역시 현저히 감소하였다.
10) 본 발명에 의한 다당류 용액에 1또는 2가의 금속 이온을 가하면 겔이 형성되는데, 이때 다량의 수분이 흡수된다. 실례로서 약 1M의 소금을 넣으면, 겔이 형성되면서 약 300-500배 가량의 물을 흡수하였다.
이상에서와 같은 본 발명에 의한 다당류계 생물 고분자의 화학조성 성분과 분자량, 그리고 그 용액의 점성 및 겔 형성능으로 보아, 상기 다당류계 생물 고분자는 지금까지 알려지지 않았던 신규의 물질이다. 본 발명에 의한 다당류계 생물 고분자를 공지된 방법에 따라 화학적으로 변형시키면, 다음과 같은 유도체, 즉 발명에 의한 다당류계 생물 고분자를 공지된 방법에 따라 화학적으로 변형시키면 다음과 같은 유도체, 즉 1) 아실화 유도체, 2)카르복시메틸화 유도체, 3) 메틸화 유도체, 4)프로필렌글리콜 에스테르 유도체, 5) 히드록시 프로필 유도체 및 6)캐치온(cation) 유도체 등을 얻을 수 있다.
일반적으로, 비생물에 의하여 발효 생산되는 고분자 물질을 일반 고분자 화합물 또는 유기 화합물처럼 분자의 구조에 따른 명명(命名)을 할 수 없기 때문에, 그 물질을 만들어 내는 미생물 이름의 일부를 따고 그 끝에 접미사(接尾辭)로서 "an"을 붙이는 경우가 많다. 예컨대 크산탄(xanthan)은 미생물명인 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)에 있어서의 "xanth"에 "an"을 붙인 것이고, 풀룰란(pullulan)은 아우레오바시디움 풀룰란스(Aureobasidium pullulans)의 마지막 부분을 이용한 명명이다. 이러한 통례에 따라, 본 발명자들은 본 발명에 의한 다당류계 생물 고분자를 "메틸란"(methylan)이라 부르기로 하였다.
본 발명을 실시예에 따라 상술하면 다음과 같다.
[실시예 1]
다음의 성분,
Figure kpo00001
으로 조성된 배지를 121℃에서 15분간 살균하여 메탄올 0.5%(v/v)를 혼합한 다음, 메틸로박테리움 오르가노필룸의 종자 배양액 10%를 접종하였다. 이 배지를 30℃에서 10% KOH용액을 사용하여 pH 7.0로, 그리고 용존 산소는 30%이상으로 유지하면서 약 600rpm에서 2일간 배양을 수행하였다. 배양이 끝난 뒤 배양액을 원심 분리하여 미생물을 제거하고, 2배량의 에탄올을 첨가하여 침전을 얻고, 이를 건조하여 약 0.6g/ℓ의 다당류를 얻었다. 분리한 다당류의 구성 성분은 다음과 같다.
글루코스 : 18.7%
갈락토스 : 28.2%
만노스 : 18.5%
단백질 : 4.8%
유기산 : 10.0%(피부르산 : 유로산 : 초산=4 : 8 : 1)
화분 : 22.2%
[실시예 2]
실시예1의 방법을 반복 실시하되, 메탄올 0.5% 대신에 1.0%(v/v)를 가하여 1.2g/ℓ의 다당류를 얻었다.
[실시예 3]
실시예 2의 방법을 반복 실시하되, 포도당 5.0g/ℓ를 첨가하여 다당류 2.0g/ℓ를 얻었다.
[실시예 4]
상기 실시예 1의 방법을 반복 실시하되, 질소원으로 효모엑기스 0.5g/ℓ를 사용하여 1.5g/ℓ의 다당류를 얻었다.
[실시예 5]
실시예 1의 조건에서 유가식 배양 방법으로 연속적으로 또는 매 5-10시간마다 메탄올을 첨가하여 실제 배양기내의 메탄올의 농도를 0.5% 미만으로 되게 유지하면서 3-4일간 배양한 결과, 다당류 4.6g/ℓ가 생산되었다.
[실시예 6]
실시예 5의 방법에서 종자 배양액 100%를(원심 분리기로 세포만 농축시켜 사용) 접종한 후, 10% 암모니아 용액을 사용하여 pH 7.0으로 유지시키면서 10-20시간 배양한 결과, 다당류 약 10g/ℓ가 생산되었다.
[실시예 7]
실시예 5에서 세포의 농도가 5-6g/ℓ에 도달했을 때 회석률 0.1hr-1로 연속 발효 공정을 수행하여 약 2일 후에 3.0g/ℓ의 다당류를 얻었다.

Claims (7)

  1. 아래의 성질을 갖는 다당류계 생물 고분자 물질 또는 그의 유도체.
    분자량 : 2-6×106
    자외선 스펙트럼 : 핵산 부재, 2-10% 단백질 존재[로리(Lowry)법]
    구성성분 : 탄수화물(글루코스 20-40%, 갈락토스 30-50%, 만노스 20-35%), 단백질(2-10%, 로리법), 유기산 5-15%(피부르산 : 유론산 : 초산 = 4 : 8 : 1), 회분 : 5-30%
    점조도 계수 : 1중량% 용액의 경우 15,000-20,000cps.
  2. 제 1항에 있어서, 유도체가 아세틸화 유도체, 카를복시메틸화 유도체, 메틸화 유도체, 프로필렌 글리콜 에스테르 유도체, 캐치온 유도체 및 히드록시프로필화 유도체 중에서 선택되는 것인 다당류계 생물 고분자 물질.
  3. 암모늄염, 질산염, 요소, 효모 엑기스, 펩톤 또는 카사미노산 중에서 선택된 질소원 0.02-0.5%, 인산염 0.05-0.2% 및 마그네슘 또는 칼슘 0.01%미만이 함유된 영양 배지에 탄소원으로서 메탄을 용액을 연속 간혈적으로 첨가하여 그 농도가 0.2-1.0%로 되게 유지시키면서 메틸롤박테리움 오르가노필룸(Methylobacterium organophilum) 또는 그의 변이주 존재하에 배양시키는 것이 특징인, 다음 특성을 갖는 다당류계 생물 고분지 물질의 제조 방법.
    분자량 : 2-6×106
    자외선 스펙트럼 : 핵산 부재, 2-10% 단백질 존재[로리(Lowry)법]
    구성 성분 : 탄수화물(글루코스 20-40%, 갈락토스 30-50%, 만노스 20-35%), 단백질(2-10%,로리법), 회분 : 5-30%
    점조도 계수 : 1중량% 용액의 경우 15,000-20,000cps.
  4. 제 3항에 있어서, 배양 온도가 25-37℃, 배양 액성이 pH 5-8, 통기량이 0.2-2.0vvm, 교반 속도가 300-1000rpm, 용존 산소 농도가 포화 농도의 10-50%, 초기 세포 접종 농도가 0.1-10gℓ, 메탄올 주입 속도가 0.05-0.5g/g-세포 및 질소원 주입 속도가 1-50mg(암모니아성 질소 환산량)/g-세포로 유지되는 것인 방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 포도당, 만노스, 갈락토스 및 숙신산염 중에서 선택되는 다당류 전구 물질을 더 첨가하는 것인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 다당류 전구 물질의 농도가 약 0.5%인 것인 방법
  7. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 다당류계 생물 고분자 물질을, 공지의 방법에 따라, 아세틸화, 카르복시메틸화, 메틸화, 프로필렌글리콜 에스테르화, 히드록시프로필화시키거나 캐치온과 더 반응시키는 것인 방법.
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