JPH04504205A - ポリエステルの微生物学的製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリエステルの微生物学的製造 本発明は、微生物を、好ましくは栄養素を制限して、好気的に培養することによ るポリエステルの製造法に関する。さらに詳しくは、本発明は、好ましくは過剰 の炭素源および増殖（ｇｒｏｗｔｈ）に必須の他の栄養素の少なくとも１つを制 限量含み、その炭素源が少なくとも１つの同化可能な非環状脂肪族炭化水素化合 物からなる、栄養培地中で、好気的条件下でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄａｍ ｏｎａｓ　）の細菌を培養すること、および、必要であれば、その細胞から形成 されるバイオポリマー（ｂｉｏｐｏ１７ｍｕ）を回収すること、によるポリエス テルの製造方法に関する。

このような方法は、ヨーロッパ特許出願公開第０２７４１５１号により知られて いる。そこに記載されている方法によると、驚くべきことに一定の栄養素制限を 伴なって炭化水素化合物を重合生成物に変換しうるとわかった、シュードモナス ・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｘｓｏ１！ｏｖｏｒａｎｓ）細菌が用い られる。形成されたポリマーは既知のＰＨＢ、すなわちポリ　（３−ヒドロキシ −ブチレート）とは異なることがわかった。それらは、式％式％ 単位および（または）式 （２）　：　−Ｃｏ−ＣＩｌ　−Ｃｌｌ　［：（ＣＨ２）　ｍ−Ｉ　ＣＨＩ　− ＣＯ２コ　−０−を有する単位（ここにおいて、ｍは２から８の整数である） からつ（られることが明らかとなった。この細菌により形成されたバイオポリマ ー（以下ＰＨＡ、すなわちポリ（３−ヒドロキシ−アルカノエート）と呼ぶ）の 組成は、培養培地中に存在する炭化水素化合物の種類によることがわかった。た とえば、用いられる基質がｎ−デカンのばあい、形成されるポリマーは３−ヒド ロキシーデカンエート、３−ヒドロキシ−オクタノエートおよび３−ヒドロキシ −ヘキサノエート単位からなることがわかった。他方、用いられる基質がｎ−ウ ンデカンのばあいは、形成されるポリマーは３−ヒドロキシ−ウンデカノエート 、３−ヒドロキシーノナノエートおよび３−ヒドロキシ−ヘプタノエート単位か らなることがわかった。用いられる基質が不飽和炭化水素化合物（ｌ−オクテン のような１−オレフィン）のばあい、形成されるポリマーも式■の単位からなる 。

驚くべきことに、さらにシュードモナス・オレオボランス以外の細菌の種すなわ ち、デ　ボスおよびデ　レイ（ｄｅ　Ｖｏｓ　ａｎｄ　ｄｅ　Ｌｔｌ　）　、イ ンターナショナル　ジャーナル　オブ　システマティック　バクテリオロジ−（ ｌｎＬ　Ｊ、　ｏｆＳ７ｓｌ、Ｂｘｃ＋ｅｒｉｏ１．）　ａａ、Ｃｌ９８３）、 ４８７〜５０９による系統発生的分類（ｐｈ７１ｏｇｅｎＮｉｃ　１Ｉｕｏｒｅ ｓｃｅ＋＋＋）によるシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　Ｎｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）　ｒ　ＲＮ　Ａ分枝（ｂｒａｎｃｈ）のシュー ドモナスに属する細菌を用いることができることが、今や見出された。この分類 によると、異なるシェードモナス分枝はりボゾームＲＮＡにおける相同性によっ て分類することができる。すなわち、シュードモナス・ソアナセアルム（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａ＋　ｓｏｌａｎａｃｅｍ＋ｎｍ）のｒ　ＲＮＡ分技分枝ュードモ ナス・アシドボランス（Ｐ＋ｅｖｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏ＋ａｎｉ　） のｒＲＮＡＲＮＡ分枝シュードモナス・フルオレッセンスのｒＲＮＡＲＮＡ分枝 。前記のうち最初の２つの分枝に属する細菌はＰＨＢ形成体であるのに対し、前 記の最後の分枝に属する細菌は、共通して一定の炭素源（糖でもメタノールでも 、短い脂肪酸でもない）に基づいて、とくに栄養素制限（飢餓状態）を伴なって 、ＰＨＢを形成しないがＰＨＡを形成することがわかった。

シュードモナス・ソアナセアルムのｒＲＮＡＲＮＡ分枝Ｂ形成シュードモナスは 、シュードモナス・ソアナセアルム、シュードモナス・セパシア（Ｐ、ｃｅｐａ ｃ目）、シュードモナス拳マルギナータ（Ｐ、ｍａｒ　ｉｎａ＋ａ　）　、シュ ードモナス・カリオヒリ（Ｐ、ｃａニア）およびシェードモナス・レモイネイ（ Ｐ、１ヱｊ」、ＬＬ！」」２）である。

シュードモナス・アシトポランスのｒＲＮＡＲＮＡ分枝Ｂ形成形成−ニードモナ スシュードモナス・アシドるシュードモナス・フルオレッセンスのｒＲＮＡＲＮ Ａ分枝−ドモナスは、シュードモナス・フルオレッセンス、生物型（ｂｉｏ＋ｙ ｐｅ　）　Ｉ　（とくにそのプロトタイプ）、生物型１１のシュードモナス・フ ルオレッセンス、生物型Ｉ１１のシュードモナス・フルオレッセンス、生物型１ ■のシュードモナス・フルオレッセンス（シュードモナス−レモンニエリ（Ｐ、 ｌ！ｍｏｎｎｉｅ＋ｉ）のような）、シュードモナス・オレオボランスを含む） 、シュードモナス・プチダ生物型Ｂ１シュードモナス・アウレオファシニンス（ Ｐ、ａｕｒｅｏｆａｃｉ！ｎ＋）　、シュードモナス・シリンガニ（Ｐ、址二… 旦）、シュードモナス・スッッツェリ（Ｐ。

（Ｐ、　＋ｅｕｄｏｍｌｅｓｌｉ　ｃｎｅｓ　）−、シュードモナス・アルカリ ゲネス（Ｐ、ａｌｃａｌｉ　ｅｎｅ＋工）、およびシュードモナス・アルカナー ル（Ｐ、ｈｅｎ　１ｎｏｓａ）である。デ　ボスおよびデ　レイ、インターナシ ョナル　ジャーナル　オブ　システマティック　パクテリオロジ−３３、（１９ ８３）、４８７〜５０９における系統発生的分類によるシュードモナス・フルオ レッセンスｒＲＮＡ分枝のシュードモナスはベーゲイズマニニアル　オブ　ディ ターミネイティブバクテリオロジ−（Ｂｅ＋ｇｅ７’＋　Ｍｘｎｕｘｌ　ｏｌ　 ＤＮｅ＋ｍ１ｎａ＋１ｙｅＢａｃ＋ｅｒｉｏｌＢ７）における同定によるグルー プＩのシュードモナスに対応する。

基質を選ぶときは、シュードモナス・オレオボランス以外のシュードモナス・フ ルオレッセンスｒＲＮＡ分枝の細菌の種は、大抵パラフィンを代謝することがで きないということを考慮しなければならない。シニードモナスφオレオボランス がパラフィンを代謝することができるのは、パラフィンの酸化の第一ステップに 関与する酵素をコードするプラスミド（ＯＣＴプラスミド）のためである。他方 、アルカノール、アルカナール、パラフィンカルボン酸およびパラフィンジカル ボン酸のようなパラフィン酸化生成物は大抵これらの他の細菌の種によって代謝 されることができる。また、選ばれた細菌の種にとって好ましい物質として供給 する炭化水素化合物の長さは、シュードモナス・オレオボランスにとって好まし い長さと異なっていてもよい。シュードモナス・オレオボランス種の細菌のばあ いは、Ｃ６〜ｃ１２のパラフィンおよびアルカノールまたはＣ６〜Ｃ１８の（不 ）飽和脂肪酸を基質として用いると、最もよい結果かえられるが、シュードモナ ス・アルカナールｔｉｍｅのばあいは、Ｃ１２〜Ｃ１６のパラフィンおよびアル カノールまたはＣ６〜Ｃ１ｏパラフインジカルボン酸を用いるのがよい。

したがって、ます宵−に本発明は、シュードモナス・オレオボランスを除いたイ ンターナショナル　ジャーナル　オブ　システマティック　バクテリオロジ−３ ３、！＋９８３）、４８７〜５０９におけるデ　ボスおよびデ　レイによる系統 発生的分類によるシュードモナス・フルオレッセンスｒＲＮＡ分枝の細菌を、好 気的条件下で少なくとも１つの同化可能な非環状炭化水素化合物を炭素源として 含む栄養培地中で培養すること、および、必要であれば細胞から形成されるバイ オポリマーを回収すること、によるポリエステルを製造する方法を提供する。

本発明はとくに、シュードモナス・オレオボランスを除いた、インターナショナ ル　ジャーナル　オブ　システマティック　バクテリオロジ−３３，（１９８３ ）、４８７〜５０９におけるデ　ボスおよびデ　レイによる系統発生的分類によ るシュードモナス・フルオレッセンスｒ　ＲＮＡ分枝の細菌を、好気的条件下で 過剰の炭素源および増殖に必須の他の栄養素の少なくとも一つを制限量含み、該 炭素源が少なくとも１つの同化可能な非環状炭化水素化合物を含む栄養培地中で 培養すること、および、必要であれば細胞から形成されるバイオポリマーを回収 することによるポリエステルを製造する方法を提供する。

さらには、とくに、本発明は、 シュードモナス・フルオレッセンス、生物型ｌシュードモナス・フルオレッセン ス、生物型１１シユードモナス・フルオレッセンス、生物型ＩＩ＋シニードモナ スーフルオレッセンス、生物型１ｖシニードモナス・プチダ　生物型Ａ（シュー ドモナス・オレオボランスを除く） シュードモナス・プチダ　生物型Ｂ シュードモナス・アラレオファシェンスシュードモナス台シリンガエ シニードモナス拳スツッツェリ シュードモナス・メンドシナ シュードモナス拳クロラフイス シュードモナス・チコリ− シュードモナス・シニードアル力すゲネスシュードモナス・アルカリゲネス シュードモナス・アルカナール からなる群より選ばれる細菌を用いることよりなる方法を提供する。

本発明の方法において、飽和もしくは不飽和パラフィンまたは６もしくはそれ以 上の炭素原子を有するパラフィン酸化生成物が、通常同化可能な非環状脂肪族炭 化水素化合物として用いられる。さらには、とくに、用いられる基質は、飽和も しくは不飽和パラフィンまたは６〜２４の炭素原子、好ましくは６〜１８の炭素 原子を有するパラフィン酸化生成物である。ここで用いた「パラフィン酸化生成 物」という用語はとくに、天然パラフィン分解において中間体として生ずるアル カノール、アルカナール、アルカノン酸（ｉｌｋｘｎｏｉｃ　ｘｃｉｄ　）およ びパラフィンジカルボン酸を意味する。もちろん、必要ならばこれらの基質の毒 性の影響を少しでも避けるための手段を構じなげればならない。この理由のため に、用いられる基質がたとえば、アルカノールまたはアルカナールであるばあい は、通常希釈の目的でジブチルフタレートのような不活性補助相（ｉｎ！ｒｔ　 ａｕｘｉｌｉａｒ７　ｐｈａｓｅ）が培地に加えられるであろう。しかしながら 好ましくは、用いられる基質は６〜１８、好ましくは１２〜１６の炭素原子を有 するパラフィンカルボン酸、または６〜１８、好ましくは６〜１２の炭素原子を 有するパラフィンジカルボン酸である。必要であれば、これらの基質を溶液中に 保持するためにＢｒ１ｉ５８のような反応体も用いられる。

本発明による方法でえられたポリマーの組成は用いる基質による。偶数の炭素原 子を有する基質が用いられるばあいは、ポリマーを構成する単位も偶数の炭素原 子を有する。同様に、奇数の炭素原子を有する基質を用いるばあいは、ポリマー の単位は奇数の炭素原子を有する。

最も小さいポリマー単位はそれぞれ６および７の炭素原子を有する。しかしなが ら、１２以上の炭素原子を有する基質を用いるばあいも、形成されるポリマーは 本質的に１２以上の炭素原子を有する単位を含むことはない。実際には、８およ び９の炭素原子を有する単位が、それぞれ常に優勢であることがわかる。

ＰＨＡを形成するように細菌を刺激するために、栄養素制限が好ましく用いられ る。すなわち実際にはチッ素、リン、硫黄またはマグネシウム制限を伴なって、 好ましくはチッ素制限をしたＥ２−培地（Ｅ２−ｍｅｄｉｕｍ　）のような培地 に基づいて、好気的培養が行なわれる。増殖とポリマー形成の条件は本質的には ヨーロッパ特許出願公開１１１Ｅ　０２７４１５１号に記載されているとおりで ある。これらの一般的に用いられている条件によれば、好気的培養は（バッチ法 または連続的に栄養供給されて）ｐＨ５〜９、好ましくは７で、３７℃以下の温 度、好ましくは３０℃にて、ならびに適度に撹拌して溶存酸素分圧３０％より大 、好ましくは約５０％もしくはそれ以上の空気飽和にて行なわれる。必要であれ ば、２つの液相を伴なう系が用いられる。

そのうちの１つは水溶性栄養素および細菌を含む水相であり、他方は基質として はたらく炭化水素化合物を含む非極性相である。しかしながら、さらにモノおよ びジカルボン酸のような、より極性の基質が用いられるばあいは、好ましい系は 適切な界面活性剤を用いる１相の系であろう。

実際には、栄養素制限した好気的培養に先立って、細胞濃度が少なくとも２　ｇ 　／　ｌとなるまで栄養素制限なしに対数増殖期とするような手順が一般的であ ろう。しかしながら共代謝過程（ｃｏ−ｍｕａｂｏｌｉｃ　ｐｒｏｃｅｓｓ）が 行なわれることも可能である。そこではグルコース、スクロース、糖みつなどの ような費用のかからない好ましい炭素源が増殖（すなわち細胞量が増える）のた めに用いられ、パラフィンまたはパラフィン酸化生成物が、望まれるポリマーの 形成のための基質として用いられる。

ポリマー含量は、最大に達したのちは再び減少していくので、バイオポリマー包 含体（ｂｉｏｐｏｌｙｍｔ＋　１ｎｔｌｓｓｉｏｎｓ）が形成される静止剤はあ まり長く続かないのが好ましい。

したがって好ましくは、栄養素制限を伴なった静止剤に形成されたバイオポリマ ー含有細胞は、細胞のバイオポリマー含量のきわだった減少がおこる前に集めら れる。

しかしながら、ＰＨＡは非制限条件下でも形成されうろことが実験により立証さ れた。したがって細菌株シュードモナス・プチダＫＴ２４４２は、全発酵期間、 すなわち対数増殖期のあいだおよび静止剤のあいだ双方でＰＨＡを形成すること がわかった。したがって、増殖制限条件を用いる必要はない。

バイオポリマー包含体を細胞中に有する細菌細胞は、たとえばアメリカ特許第３ ．１０７．１７２号に示されているように、直接用いられることがあるので、細 胞中に含まれているバイオポリマーは必ずしも単離される必要はない。

しかしながら、ポリマーの単離および精製はたいていの使用には望ましいかまた は必要であろう。この目的のため、それ自体が既知である多くの方法を用いるこ とができる。細菌細胞の破砕は当業者によく知られている多くの方法、たとえば 剪断力を用いることによって（ホモジナイザー、グラインダー、いわゆるフレン チ　プレス（“Ｆ＋ｃｎｃｂ　ｐｒｏｓ’）などによって、浸透圧衝撃処理を行 なうことによって、サノーラス（ｓ＋＋＋＋ｏ＋ｏｕｓ）もしくはウルトラサノ ーラス　バイブレーション（ｕ１ロ１ｓｏｎｏｒｏｏｓマｉｂ＋を目ｏｎ　）を 用いることによって、酵素的細胞壁分解によってまたは細胞懸濁液のスプレー乾 燥によって行ないつる。続いて、ポリマーは溶媒抽出および遠心分離を含むそれ 自体が知られている多くの方法で他の成分から分離されることができる。前記ヨ ーロッパ特許出願公開第０２７４１５１号中に記載されている１つの適当な単離 方法は、等密度遠心分離を用いている。より大きな規模での単離のためには、集 めた細胞をスフェロプラストに変換すること、これらをサノーラスバイブレーシ ョン処理によって破砕すること、分離すること、および必要であれば遠心分離後 に形成された上層を洗浄し乾燥すること、によってバイオポリマーが単離される のが好ましい。好ましくは、スフェロプラストへの変換はスクロース存在下で行 なわれる。遠心分離は、約３０分間、１０．０００ｇで行なわれれば充分に進行 する。その後で、ポリマーは上溝上に白い上層を形成し、容易に分離されつる。

汚濁物は洗浄によって除去することができる。その後洗浄されたポリマーは、好 ましくは凍結乾燥により、適切な乾燥形態とされる。

形成されたポリマーの単離に適した別の手順は、ヨーロッパ特許出願公開第０２ ７４１５１号に記載されている手順である。スクロース濃度勾配遠心分離および 異なる遠心分離の工程を用いる生化学的方法と比べて、たとえばクロロホルムで の、凍結乾燥細胞の抽出は、より簡単で、より速（、かつより純粋な生成品のよ り高い収率に資する。

形成されたポリエステルの用途のために、前記ヨーロッパ特許出願公開東０２７ ４１５１号が参照される。そこには、えられたポリマーの化学的修飾を行なうこ ともしくはそれらを別のポリマー鎖と架橋させることの可能性ならびに縫合材（ ＋ｕ＋ｕ＋ｅｓ　）　、フィルム、皮膚または移植骨などのような製品の製造に 対する用途が含まれている。

本発明はまた、本発明による方法によりえられるポリエステルを加水分解するこ とおよび、必要であれば、その結集生じるモノマーをエステル化することからな る光学的に活性なカルボン酸またはカルボン酸エステルの製造方法を提供する。

そのような光学的に活性な化合物は、たとえば薬剤の製造における中間体として 、または化学的手段による光学的に純粋な形態における研究のための有用性を有 しつるが、えることはたいてい容易ではない。

もし、この方法により用いられる基質の結果として異なるモノマーの混合物が生 成されれば、必要であれば、それ自体知られた方法でこれらを分離することがで きる。

本発明を以下に示す実験セクションにおいて、およびそれにより説明する。

（１）細菌株および増殖条件 表Ａに示された株を用いた。用いた増殖培地はＥ−培地（Ｅ−ｍ！ｄｉｕｍ）　 （ポーゲルおよびボンナー（Ｖｏｇｅｌ　ａｎｄＢｏｎｎｅ＋）　、ジャーナル 　オブ　バイオロジカル　ケミスト　リ　−　（１，Ｂｉｏｌ、Ｃｈ　！ｍ、） 　２１一旦一一、（１９５６）　、　９７〜　＋０６　、Ｅ２−培地（ラゲヴイ ーンら（Ｌａｇｅｙｅｅｎ　ｅ＋　ａｌ、）アプライド　アンド　エンバイロン メンタル　ミクロバイオロジー）　（ＡＨｌ、Ｅｎｖ、Ｍｉｃ＋ｏｂｉｏ１．　 ）　５４．　（１９８ｇ）　、２９２４〜２９３２）または０．５Ｘ　Ｅ２であ った。

Ｅ−培地は以下の組成である： クエン酸・３ナトリウム　２．０ｇ／ｌＭｇＳＯ４・７１１２０　０．２　ｇ／ １ＮｉＮＨ４ＨＰＯ４・４１（２０３５ｇ　／　ＩＫ２１１Ｐ０４１０　ｇ／　 １ １０００　ＭＴ　ｌ　ｍｌ／　Ｉ Ｆ５−培地は以下の組成である： ＮａＮｌｌ４）ＩＰＯ４−４８２０３，５ｇ／　１１０００　ＭＴ　１　ｍｌ／ 　１ １００　ｍＭ　Ｍｇ５ｏ４１０　ｍｌ／　１０．５ＸＥ２−培地は以下の組成で ある：ＮａＮＨＨＰＯ−４１？２０　３．５　ｇ／１１０００　ＭＴ　１　ｍｌ ／　１ １００　ｍＭ　Ｍｇ５０４１０　ｍｌ／　１１０００ＭＴ　（ＩＮ　ＨＣｌ中） は以下の組成である：前記培地により一定の細胞濃度にまで増殖ができ、その後 にチッ素が制限される。０．５ＸＥ２−培地でえられる細胞濃度は約０．７〜０ ．９　ｍｇ／　ｍｌが期待される。この細胞濃度でチッ素が制限され、細胞量の さらなる増加は、ＰＨＡの蓄積の結果である。

脂肪酸は、１０ｍＭ　（ブチレート、バレレート、オクタノエート、ノナノニー ト、デカノニートおよびウンデカノニートのばあい）、５ｍＭ（ラウレート、ト リデカノエート、ミリステート、ベンタデカッエート、オレート、ニライデート およびγ−リル−トのばあい）および２ｍＭ（パルミテート、ヘプタデカノエー ト、ステアレートおよびエルケートのばあい）の最終濃度となるまで１０倍の高 濃度の貯蔵溶液として１０％Ｂ＋ｉｉ　５８中に溶解し、　ＩＮＫＯＨを加えて ｐＨ７，０とし、フィルター（ジエンキンスおよびナン（Ｉｅｎｋｉｎｓ　ａｎ ｄ　Ｎｕｎｎ）ジャーナル　オブ　バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃ＋ｃ＋ｉｏ１ ．）　１６９、（＋９１１７）　、４２〜５２）に通して滅菌した。３−ヒドロ キシ−ブチレートは、０．７％まで加えた。１−オクタノールおよびオクタナー ル（３％　マ／１　）は直接液体培地に、および固体培地上で増殖する細胞には 蒸気の形態で、加えた。細胞の損傷を防ぐために、１７％ジブチルフタレートを １−オクタツールまたはオクタナール含有液体培地に加えた。

口辺下余白］ 表Ａ、用いた菌株 ノニードモナスーオレオボランス ＧＰＯＩ　ＯＣＴ　（ａ） ＧＰｏ１２　ＯＣＴ”’　Ｋｏｋ、論文（ｌｈｅ＋ｉ＋）フクニンヘン　（Ｇ＋ ｏｎｉｎｇｅｎ）シニードモナス骨アエルギノーサ ＰＡＯＩ　プロトタイプ　（ｄ） ノ；−トモナス・フルオレブセンス プロトタイブ　（ｅ）、ＤＳＭ　５００９０／ニートモｔス・レモンニニリ プロトタイプ　ｉ）、ＤＳｌ　５０４１５ノニードモナス・テストステクニ プロトタイプ　（１） 略Ｎ：　ＯＣＴ　：　ＯＣＴプラスミド、　ＴＯＬ　：　ＴＯＬプラスミド；Ｒ １’　：リファンピシン耐性；ＤＳＭ：ドイチェザムルンク　フユール　ミクロ オルガニスメンラント　ツェルクルトユーレン　ゲゼルシャフト　ミツト　ベシ ュレークテル　ハフラング、ブラウンシュバイク、フエデラル　リパブリック　 オブ　ジャーマニ− （Ｄｅｃ口ｃｈ！　Ｓｚｍｍｌｏｎｇ　ｌｖｒ　Ｍｉｋ＋ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ ｎａｎｄ　２ｅｌｌｋｕｌ＋ｕ＋ｅｎ　ＧｍｂＨ，Ｂ＋ｘｎｎｓｃｈｖｅｉｇ、 ＦＲＧ）（り：シニヴアルツおよびマツコイ（Ｓｃｈｗａｒｚ　ａｎｄμｃｃｏ ７　）　、アプライド　ミクロバイオロジー（Ａｐｐｌ。　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ 、）　２６％　（１９７３）　、　２１７〜（ｂ）：グルシドら（Ｇｒｕｎｄ　 ｕ　ｔｌ　）　、ジャーナル　オブ　バクテリオロジ−１２３、（１９７５）　 、５４６〜（Ｃ）：バグダサリアンら（Ｂｘｇｄａ＋ｘ＋ｉａｎ　ｅｔａｔ　） 、ジーン（ＧＣｎｅ）　１６、（１９８１）　、２３７〜２４７（ｄ）：ホロウ ェイ（Ｂｏｌｌｏｖｘ７）　、バクテリオロジカルレビニーズ（Ｂｉｃｏｎ、　 Ｒｅｖ、　）　３３、（１９６９）、４１９〜４４３ （＋）：スタニールら（ＳＨｎｉｅｌ　ｅｔ　ａｔ　）　、ジャーナルオブ　ジ ェネラル　ミクロバイオロジー（Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ　）　４３、（１９６６）　、１５９〜２７１（ｆ ）：マルクスおよびタラレイ（Ｍｇ＋ｃｕｓ　ａｎｄ　Ｔａ１ａｌａ７）、ジャ ーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストア４ ■ＰＨＡの測定 ＰＨＡの存在の定性分析のために細胞を顕微鏡で検査した。定量分析のために細 胞を０．５ＸＥ２寒天プレート上または５０ｍ１　Ｏ，５ｘ　Ｅ２培養液中で培 養し、ラゲヴイーンらによって以前に記載された方法にしたがい、ＰＨＡの存在 と組成をテストした。ポリマーの組成もまた、１リツトル培養液からクロロホル ム抽出後、えられた単離されたポリマーで測定した。

ポリマーのテストのために細胞を集め、凍結乾燥したのち、脂肪酸をメチルエス テルに変換するために、メタノール／クロロホルム中で１００℃にて１４０分間 １５％硫酸で処理した。つぎにメチルエステルをガスー液体クロマトグラフィー （ＧＬＣ）により分析した。メチル−３−ヒドロキシ−ブチレートの測定は６８ ℃にてＧＬＣプログラムを開始することにより行なった。この温度で２分たった のち、カラムを２０分間、５℃／ｗｉｎの割合で熱した。

つぎにすべての高分子組成物を除去するために、１０℃／ｍｉｎの割合で２７８ ℃までカラムの温度を上昇させた。細胞濃度（ウィゾルト（Ｗｉｔｈａｌｔ　） 　、ジャーナル　オブバクテリオロジ−１０９、（１９７２）　、３５０〜３６ ４）およびモノマーと内部標準（メチルベンゾエート）とのピーク面積の割合に もとづき、細胞により蓄積されたポリマー量およびその組成を測定することがで きた。

（３）シュードモナス・オレオボランスによるパラフィン酸化生成物にもとづ＜ ＰＨＡの形成 パラフィンを酸化するシュードモナス、すなわち、１−オクタノール、オクタナ ールもしくはオクタノエートを基質として用いるシュードモナス・オレオボラン スＧＰＯＩのプロトタイプによるＰＨＡの形成を検査した。これらの炭素源を最 終量が３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）またはｌｈＭ（オクタノエート）となるよう加 えた。１−オクタツールおよびオクタナールは細胞に対して毒性を有するので、 １７％ジブチルフタレートを培養液に補充した。結果を表Ｂに示す。

１−オクタツールまたはオクタノエートを基質として用いたばあい、ＰＨＡが実 際に形成された。オクタナールを基質として用いたばあいは、増殖はおこらなか った。

ポリマーの収率は、オクタノニートで増殖した後が最も高かった。形成されたポ リマーは主に３−ヒドロキシ−オクタノエート単位（９０％）からなり、残りは ３−ヒドロキシ−ヘキサノエート単位からなっていた。これはオクタンを用いて えられた結果と一致している。

基質　乾燥細胞量　細胞内ＰＨＡ　ポリマー組成（ｍ／ｍｌ）　含量（％）３０ １１−６　３０１１−１１１−オクタツール　１．３　３．Ｉ　Ｇ、１０　０． ９０オクタナール　増殖なし オクタノエート１．２　８．７　０．１２　Ｇ、８８園株シュードモナス・オレ オボランスＧＰｏｌを、示した基質を用いて５０ｍ１　Ｏ，５ｘ　Ｅ２培地中で 増殖させ、増殖２０時間後ＰＨＡについて分析した。細胞内ＰＨＡ含量は乾燥細 胞量に対するポリマー量の割合である。３０Ｈ−６および３０１１−８はそれぞ れ３−ヒドロキシ−ヘキサノエートおよび３−ヒドロキシ−オクタノエートを意 味する。

４）他のシュードモナスによるＰＨＡの形成菌株シュードモナス・オレオボラン スＧＰｏｌばかりでなく、菌株シュードモナス・オレオボランス　ＧＰｏｌ２　 （ＧＰｏｌの０ＣＴ−派生体、）、シュードモナス・プチダＰｐＧ１（土壌より 単離したプラスミドのない菌株）およびシェードモナス・プチダＫＴ２４４２　 （シュードモナス・プチダＮ−２から派生し、ＴＯＬプラスミドを取除いたりフ ァンピシン耐性菌株）、これらの菌株はパラフィンにもとづいて、は増殖しない のだが、についてもポリマー形成を検討した。すべてのこれらの菌株はシュード モナス・プチダ、生物型Ａのグループに属する。菌株をオクタツール蒸気中の最 少培地の寒天プレート上で増殖させ、ＰＨＡの存在を顕微鏡で分析した。これら のすべての菌株において貯蔵物質の形成は、位相差顕微鏡検査において透明な（ 白い）ドツトとして観察されるポリマー顆粒の細胞内蓄積により証明された。

貯蔵物質の量および組成を測定するために、プレートの細胞を集め、ＰＨＡ分析 を行なった。表Ｃかられかるように、検査された菌株はシュードモナス・プチダ ＰｐＧ１を除き、９０％が３−ヒドロキシ−オクタノニート、および１０％が３ −ヒドロキシ−ヘキサノエートからなるＰＨＡを生産した。菌株シュードモナス ・プチダＰｐＧ１もまたＰＨＡを生産したが、そのうちの９６％もがＣ８からつ くられており、わずか４％がＣ６モノマーからつくられていたので、これはほと んどホモポリマーであることがわかった。シュードモナス・オレオボランス菌株 ＧＰｏｌおよびＧＰｏｌ２　と比較して、シュードモナス・プチダ菌株ｐｐｃｉ およびＫＴ２４４２はより高い細胞内Ｆ’ＨＡ含有量を蓄積することがわかった 。

表Ｃ；他のシュートモナス菌株によるＰＨＡ合成菌株　細胞内ＰＨＡ含量（％） 　３０１１−６部分（％）ＧＰｃｌ　２−５　９．５土１．０ ＧＰｏ１２　２−５　９．４：１．５ ＰｐＧ１　１０−２０　４．０±Ｑ、７ＫＴ２４４２　１０−２［１９，０±１ ．１菌株は０．５ＸＥ２プレート上１−オクタツールに基づいて増殖した。組成 はポリエステル中の３−ヒドロキシ−ヘキサノニートモノマ一部分（ｊｔａｃｔ ｉｏｎ）により示されている。残りは３−ヒドロキシ−オクタノエートにより形 成さシュードモナスの分類には、ｒＲＮＡ相同性による分類（デ　ボスおよびデ 　レイ、インターナショナル　ジャーナル　オブ　システマテイツク　バクテリ オロジ−３３、（Ｎ８３）、４８７〜５Ｑ９　）　、芳香族アミノ酸の生合成に 関する酵素間の類似性による分類（ピング（ｂｙｎｇ）ら、ジャーナル　オブ　 モレキユラー　二ポリューション（１，Ｍｏ１．　Ｅｖｏｌ、　）　１９、（１ ９１１３）　、２７２〜２１１２　）　、ベルゲイズマニュアル　オブ　デイタ ーミネイティブ　バクテリオロジーに記載されている代謝特性による分類のよう な異なる分類がある。これらすべての異なる分類系では、蛍光のシュードモナス 菌株（シュードモナス・プチダ、シュートモナス・アエルギノーサおよびシュー ドモナス・フルオレッセンス種）は同じグループの構成菌株であり、ＰＨＢを形 成することができないということで共通している。

シュードモナス・フルオレッセンスｒＲＮＡ分枝と異なるシュートモナス菌株、 すなわち前記シュードモナス・オレオボランスおよびシュードモナス・プチダ菌 株と同様にプロトタイプシュードモナス・アエルギノーサＰＡＯ，シニードモナ ス・フルオレッセンスおよびシュードモナス・レモンニエリならびにさらに、こ のグループに属さない種シニードモナスφテストステロニに対してＰＨＡの形成 における研究が続けられた。これらのすべての菌株を１１０１１Ｉオクタノエー トまたは　ｆｌ、７％３−ヒドロキシ−ブチレートに基づいて５０ｍ１　Ｏ，５ Ｘ　Ｅ２培地中で増殖させた。細胞を集め、まるごとの細胞（ｗｈｏｌｅ　ｃｅ ｌｌｓ　）でＰＨＡを測定した。（表Ｄ） シュートモナス・プチダ菌株をもまた１リツトルの発酵槽中で３０ｍＭオクタノ エートまたは０．７％３−ヒドロキシ−ブチレートに基づきＥ２−培地で増殖さ せ、そのあとポリエステルの単離を行なった。ポリエステルの組成はまるごとの 細胞での分析において測定した組成に一致することがわかった。オクタノエート に基づいて増殖した細胞のＰＨＡはつねに３−ヒドロキシ−ヘキサノエート、３ −ヒドロキシ−オクタノエートおよび少量の３−ヒドロキシーデカノエートから なっていた。奇数の炭素原子を有する３−ヒドロキシ−脂肪酸は検出されなかっ た。３−ヒドロキシ−ブチレートで増殖させたのち、３−ヒドロキシ−脂肪酸は 培養試料中にも、まるごとの細胞のクロロホルム抽出の沈殿よりえられた物質中 にもみられなかった。

シュートモナス・アエルギノーサ、シュードモナス・フルオレッセンスおよびシ ュードモナス・レモンユニす種はすべて、オクタノニートに基づく増殖後、Ｐ　 ＨＡを形成することがわかったが、３−ヒドロキシ−ブチレートに基づいて増殖 する間はポリマーを形成しなかった。他方、オクタノエートに基づいては増殖で きないシュードモナス・テストステロニは、３−ヒドロキシ−ブチレートまたは デカノエートに基づいて増殖する間はＰＨＢを形成することがわかった。後者の 基質で増殖する間は、モノマーのわずか１３％のみが３−ヒドロキシ−ブチレー トからなっていなかった。異なる種によって形成されたＦ’ＨＡ量は大きく異な っていた。

シュードモナス・プチダおよびシュートモナス・オレオボランス菌株は３０〜５ ０％ＰＨＡを、シュードモナス・アニルギノーサは約１５％を、そして蛍光シュ ートモナスのプロトタイプ、シュードモナス・フルオレッセンスはわずか１〜２ ％ＰＨＡを生じた。他方、シュートモナス・フルオレッセンス生物型１ｖに属す るシュードモナス・レモンユニす種はその乾燥細胞量のほぼ４０％までＰＨＡを 蓄積した。しかしながら、培養条件はＰＨＡ産生に影響を与えるかもしれず、Ｐ ）ＩＡ合成は異なる菌株によってまだ最大限に活用されていないので、これらの 割合はシュードモナス・フルオレッセンスｒＲＮＡ分枝の随意に蛍光性のシュー ドモナスのＰＨＡ形成形成一般的目安として役にたつにすぎない。

［以下余白コ 表り：異なるシュードモナス菌株によるＰＨＡ形成菌株　基質　ポリマー　組　 酸 含量　３０１１−４３０１６３０１１−８３０１（−１０ン二−ドモナスーオレ オボランス ＧＰｏＩ　ＨＢ　Ｏ ｏＮ　２９．７　０．０７　０．９０　０．０３ＧＰ０１２　ＨＢ　０ ｏｃｔ　３４．１　０．ＨＩ）、９１　０．０３ｏｃｔ　２９．４　０．０３　 Ｇ、９３　０．０４ＫＴ２４４２　１１Ｂ　Ｄ ｏｃｔ　４７．１　０．０８　Ｇ、９１　０．０１ン二−トモナス・アエルギノ ーサ １’Ａ０　１１Ｂ　０．１　’−−−１，０ｏｃｔ　１４．４　０．０８　０． ８６　０．０τシュードモナス−フルオレッセンス ＤＢ　０．４　−　−　−　１．０ ｏｃｔ　１．６　０．１４　０．６３　０．２２ン；−トモナス・レモンニエリ ＤＳＭ　５０４１５　）ＩＢ　０．７　−　０．１４　０．８６ｏｃｔ　０．５ 　（１，ＨＱ、９１　Ｑ、θ３ンユードモナス導テストステロニ ８Ｂ　１５．４　０．９９　−　−　０．０１ｏｃｔ　増殖なし ｄｅｃ　６．０　Ｏ，８７０，０３Ｑ、Ｎ　Ｏ，［１２基質に用いられた略語は 。

ＨＢ：３−ヒドロキシ−ブチレート Ｇｅｌ　：オクタノエート ｄ！ｃ　：デカノエート　である。

ｆ６）　Ｐ　ＨＡ形成に対する基質の影響形成されるポリマーの組成に対する増 殖基質の影響を測定するために、シュードモナスーオレオボランスＧＰＯＩを４ 〜２２炭素原子を有する脂肪酸を補充した０、５ＸＥ２−培地を含む５０ｍ１培 養液中で培養し、その後に細胞を集め、ポリ−３−ヒドロキシ−アルカノニート の存在を調べた。

結果を表Ｅに示す。

３−ヒドロキシ−ブチレート、ブチレートおよびバレレートのような低級脂肪酸 を用いたばあい、ＰＨＡ形成はわずかであった。そのわずかな生成（１，５％未 満）にもかかわらず、形成されたＰＨＡはＣ１ＣおよびＣ１２七ツマ−を含んで いた。８未満炭素原子を有するモノマーは見られなかった。

オクタノエート、ノナノエート、デカノエートおよびウンデカノエートのような 中間の長さのカルボン酸を用いたばあい、かなりのポリマー形成がおこった（８ ％より多い）。ポリエステルの組成は対応するｎ−パラフィンに基づいて増殖し た間に形成されたＰＨＡの組成と一致した。

より長い脂肪酸に基づく増殖でもＰＨＡ合成がおこった。炭素源としてラウレー ト、トリデカノエート、ミリステート、ベンタデカッエートおよびパルミテート を用いたばあい、形成されるポリマー量は中間の長さの脂肪酸を用いる間に見ら れたのと同じ範囲（５％より多い）であった。ヘプタデカノエートおよびステア レートのようなより長い飽和脂肪酸を用いるばあい、細菌は充分に増殖せず、ポ リマー形成は検出されなかった。他方、１８炭素原子を有する不飽和カルボン酸 を用いる間は増殖お。

よびポリマー形成がおこった。２２炭素原子を有する不飽和脂肪酸、エルケート を用いたばあいはこうではなかった。

１２より多い炭素原子を有する基質（ラウレートおよびそれより大きいもの）を 用いたばあい、ポリエステルの組成はもはやそのように基質−依存ではないこと がわかった二基質が偶数の炭素原子を有するばあいは、３−ヒドロキシ−ドデカ ノエートが常に最も長い七ツマ−であり、基質が奇数の炭素原子を有するばあい は、３−、ヒドロキシ−ウンデカノエートが常に最も長いモノマーであった。

偶数の炭素原子を有するより長い（１２およびそれより多い炭素原子）脂肪酸に 基づいて形成されるＰＨＡの組成は、ｃ　、ｃ　Ｓｃ、ｏおよびＣ１２モノマー について約１．３　：　８．９　：　４．７　：　１の一定の割合を示した。奇 数の炭素原子を有するより長い（１１およびそれより多い炭素原子）脂肪酸に基 づいて形成されるＰＨＡの組成はＣ７、Ｃ９および　Ｃ１１モノマーについて約 ２．３　：　３．４　：　１の一定の割合を示した。

［以下余白コ 表Ｅ：Ｃ４〜Ｃ２２脂肪酸に基づくシュードモナス・オレオボランス位主玉上旦 瓦五瓜 基質　ポリマー　ポリマー組成 含量（％）　３０Ｈ−６３０Ｈ−７３０Ｈ−８３０Ｈ−９３０）！−１０３０） １−１１３０８−１２二上 ＨＢ　１．２　−　−　０．２２　−　０．５７　−　０．２ＩＣ４０，６−− −−０，３３−０，６７Ｃ５０，７−−−−０，３５−０，６５Ｃ８８，７０， ０８−０，９１−０，０１−−Ｃ９９，１−０，３５−０，６５−−−ＣＩＯ１ ２，５０，０８−０，７５−０，１７−−Ｃ１１９，８−０，２８−０，５９− ０，１３−Ｃ１２６，６０，０６−０，５７−０，３２−０，０５Ｃ１３５，４ −０，３２−０，４８０，０５０，１４−ＣＩ４　１０．６　０．０７　−　０ ．５９　−　０．３０　−　０．０４ＣＩ５　５．３　−　０．３２　−　０． ４７　０．０８　０．１３　−Ｃ１６３，４０，０８−０，５０−０，３０−０ ，１２Ｃ１７およびＣ１Ｂ　増殖なし 玉鳳租胆肪皇 ｏｌｅ　７．４　０．０９　−　０．５７　−　０．２８　−　０．０６ｅｌａ 　１１．２　０．１０　−　０．５６　−　０．２７　−　０．０７１ｉｎ　５ ．９　０．１０　−　０．５７　−　０．３０　−　０．０４ｅｒｕ　増殖なし 基質に用いられた略語は： ＨＢ：３−ヒドロキシ−ブチレート Ｃ８から０１８；オクタノエートからオクタデカノエートｏ１ｅ：　オレエート （シス−９−オクタデケノエート）ｅｌａ：　エライデート（トランス−９−オ クタデヶノエート）１ｉｎ：　γ−リルネート（シス−６，９，１２−オクタデ カトリエノエート）ｅｒｕニ　エルケート（シス−１３−ドコセノエート）“− ”は＜　ｏ、　ｏｏｓを示す。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成３年１０月３日圃

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．炭素源として少なくとも１つの同化可能な非環状脂肪族炭化水素化合物を含 む栄養培地中で、好気的条件下、シュードモナス・オレオボランスを除いたイン ターナショナルジャーナルオブシステマティックバクテリオロジー３３、（１９ ８３）、４８７〜５０９におけるデボスおよびデレイによる系統発生的分類によ るシュードモナス・フルオレッセンスｒＲＮＡ分枝の細菌を培養すること、およ び、必要ならば、細胞から形成されたバイオポリマーを回収すること、によるポ リエステルの製造法。
2. ２．過剰の炭素源および増殖に必須の他の栄養素の少なくとも１つを制限量含み 、該炭素源が少なくとも１つの同化可能な非環状脂肪族炭化水素化合物を含む栄 養培地中で、好気的条件下、シュードモナス・オレオボランスを除いたインター ナショナルジャーナルオブシステマティックバクテリオロジー３３、（１９８３ ）、４８７〜５０９におけるデボスおよびデレイによる系統発生的分類によるシ ュードモナス・フルオレッセンスｒＲＮＡ分枝の細菌を培養すること、および、 必要ならば、細胞から形成されたバイオポリマーを回収することによるポリエス テルの製造法。
3. ３．シュードモナス・フルオレッセンス，生物型Ｉシュードモナス・フルオレッ センス，生物型ＩＩシュードモナス・フルオレッセンス，生物型ＩＩＩシュード モナス・フルオレッセンス，生物型ＩＶシュードモナス・プチダ生物型Ａ（シュ ードモナス・オレオボランスを除く） シュードモナス・プチダ生物型Ｂ シュードモナス・アウレオファシエンスシュードモナス・シリンガエ シュードモナス・スツッツェリ シュードモナス・メンドシナ シュードモナス・クロラフィス シュードモナス・チコリー シュードモナス・シュードアルカリゲネスシュードモナス・アルカリゲネス シュードモナス・アエルギノーサ からなる群より選ばれた細菌を用いる請求項１または２記載の製造法。
4. ４．用いられる同化可能な非環状脂肪族炭化水素化合物が６またはそれより多い 炭素原子を有する飽和もしくは不飽和パラフィンまたはパラフィン酸化生成物で ある請求項１〜３記載のいずれかの製造法。
5. ５．６〜２４の炭素原子、好ましくは６〜１８の炭素原子を有する飽和もしくは 不飽和パラフィンまたはパラフィン酸化生成物である請求項４記載の製造法。
6. ６．６〜１８、好ましくは１２〜１６の炭素原子を有するパラフィンカルボン酸 または６〜１８、好ましくは６〜１２の炭素原子を有するパラフィンジカルボン 酸を用いる請求項５記載の製造法。
7. ７．好気的培養がチッ素、リン、硫黄またはマグネシウム制限を伴なって、好ま しくはチッ素制限を伴なって行なわれる請求項１〜６記載のいずれかの製造法。
8. ８．好気的培養がｐＨ５〜９で、好ましくは７で、３７℃以下の温度にて、好ま しくは約３０℃にて、適切な撹拌を伴なって溶存酸素分圧３０％より大、好まし くは約５０％またはそれより大の空気での飽和で行なわれる請求項１〜７記載の いずれかの製造法。
9. ９．栄養素制限を伴なう好気的培養が、少なくとも２ｇ／ｌの細胞濃度に達する まで栄養素制限をなしとした対数増殖期によって進められる請求項１〜８記載の いずれかの製造法。
10. １０．細胞のバイオポリマー含量のきわだった減少がおこる前に栄養素制限を伴 なって静止期において形成されたバイオポリマー含有細胞を集める請求項１〜９ 記載のいずれかの製造法。
11. １１．集めた細胞をスフェロプラストに変換すること、これらをサノーラスバイ ブレーションでの処理によって破砕すること、分離することならびに、必要であ れば、還心分離ののちに形成される上層を洗浄することおよび乾燥すること、も しくは溶媒抽出によるバイオポリマーを単離すること、によってバイオポリマー を単離する請求項１〜１０記載のいずれかの製造法。
12. １２．えられるバイオポリマーを化学的に修節する請求項１〜１１記載のいずれ かの製造法。
13. １３．請求項１〜１２に記載のいずれかの製造法によりえられたポリエステルを 加水分解することおよび、必要であればその結果えられたモノマーをエステル化 することからなる光学的に活性なカルボン酸またはカルボン酸エステルの製造法 。
14. １４．請求項１〜１２に記載のいずれかの製造法を用いてえられたポリエステル 。
15. １５．全体的にまたは部分的に請求項１４記載のポリエステルからなる縫合材、 フィルム、皮膚または移植骨などのような製品。