CN1850982A - 葛根素羟基化的微生物转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种葛根素羟基化的微生物转化方法。本发明采用分离及保藏的具有葛根素羟基化酶活力的微生物菌种接种到培养液中，进行发酵培养；发酵结束后，将发酵液与菌丝体分离；所获菌丝体作为静息细胞，加入到含有葛根素的转化液中，使葛根素转化为羟基葛根素；转化结束后，去除菌丝体，上清液经浓缩、低温干燥处理后，可得3′－羟基葛根素固体；或将转化液的上清液用有机溶剂萃取，再用水从有机相中反萃取，获得的水相萃取液经浓缩、硅胶层析分离，可得到含3′－羟基葛根素的溶液，再将含3′－羟基葛根素的溶液经浓缩、或低温处理后，可得到3′－羟基葛根素粉末或晶体。
Description
技术领域
本发明涉及一种葛根素羟基化的微生物转化方法。
技术背景
葛根素(Puerarin)化学名为：4’，7-二羟基-8-β-D-葡萄糖异黄酮。其毒副作用小，有较广泛的生理功能：如具有抗心律失常及降血压；扩张冠状动脉，保护心肌超微结构，减少心肌梗死范围；扩张脑血管，增加脑血流量，改善大脑供氧；改善耳、视网膜等器官微循环；抑制血小板聚集，改善血液流变，降低血液黏滞度的作用和低密度脂蛋白被氧化损伤的程度；能清除自由基和抗氧化作用；保护动脉血管内皮细胞，阻止动脉粥样硬化，防止血栓形成；有较缓和的降低血糖的作用；对糖尿病大鼠肾功能具有保护作用。Sato(1992年)报道3′-羟基葛根素有良好的抗氧化活性；而Cao(1999年)报道3′-羟基葛根素在植物体内的含量仅为葛根素的几十分之一。
发明内容
本发明目的在于提供一种葛根素羟基化的微生物转化方法：筛选获得可催化Puerarin为3′羟基-葛根素(3′-hydroxypuerarin)微生物菌株，以便采用微生物转化的方法，获得3′-hydroxypuerarin产品。Puerarin和3′-hydroxypuerarin的分子结构式见式1。
| R1 | R2 | R3 | R4 | |
| Puerarin3’-hydroxylpuerarin | glcglc | HH | HH | HOH |
式1.Puerarin和3′-hydroxypuerarin的分子结构式
本发明采用分离及保藏的具有葛根素羟基化酶活力的微生物菌种接种到培养液中，进行发酵培养；发酵结束后，将发酵液与菌丝体分离；所获菌丝体作为静息细胞，加入到含有葛根素的转化液中，使葛根素转化为羟基葛根素；转化结束后，去除菌丝体，上清液经浓缩、低温干燥处理后，可得3′-羟基葛根素固体；或将转化液的上清液用有机溶剂萃取，再用水从有机相中反萃取，获得的水相萃取液经浓缩、硅胶层析分离，可得到含3′-羟基葛根素的溶液，再将含3′-羟基葛根素的溶液经浓缩、或低温处理后，可得到3′-羟基葛根素粉末或晶体。
上述具有葛根素羟基化酶活力的微生物菌种，可以是哈茨木霉，也可以是任何可羟基化葛根素的微生物或混合微生物。所说的哈茨木霉可以是Trichoderma harzianum ATCC20671，Trichoderma harzianum ATCC64060，Trichoderma harzianum ATCC60850，Trichoderma harzianum ATCC52443，Trichoderma harzianum ATCC52444，Hypocrea lixii ATCC MYA-2453等中的一种或几种。发明人筛选的拟命名Trichoderma harzianum NJ01的菌株，用于本发明有更好的效果，该菌株已于2005年11月1日保存于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存号CGMCC NO.1523，分类命名为哈茨木霉Trichoderma harzianum。
上述用于发酵培养的培养液的营养物质没有特别的限制，可以是任何一种适合于微生物生长的营养介质，如PDA培养液，察氏培养基，或任何以淀粉、玉米粉、糖蜜、葡萄糖、蔗糖等为碳源，以玉米浆、黄豆饼粉、花生饼粉，棉籽粉等为氮源的培养基。
上述葛根素羟基化微生物发酵培养条件是：20～40℃，10～400rrpm摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间12～96小时。
上述的发酵液与菌丝体分离，可采用过滤或离心分离方法获得菌丝体。
上述的葛根素羟基化静息细胞转化反应可在水相、有机相或水相-有机双相中进行。水相转化条件为：底物质量比浓度为大于0.01％至饱和，在任意一种pH3～7的偏酸性的缓冲溶液中；有机相为乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺，或其他对细胞毒性较小的有机溶剂；水相-有机相为上述水相与有机相的任意比例混合物。转化温度范围在20～40℃，10～400rpm摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间12～96小时，转化结束后，将转化液与菌体通过离心或过滤分开，可获得含有3′-hydroxypuerarin的转化液。
上述含有3′-hydroxypuerarin溶液经浓缩、低温干燥处理后，可得3′-羟基葛根素固体(纯度≥50％)；或向上述含有3′-hydroxypuerarin溶液中加入正丁醇或任何其他可萃取产物的有机溶剂，振荡、萃取，静置或离心分层后，有机相部分再用水萃取，萃取液经浓缩、硅胶层析分离，可得到含3′-hydroxypuerarin的溶液，再经浓缩、或低温处理后，可得到3′-hydroxypuerarin粉末(纯度≥90％)。制得的3′-hydroxypuerarin在DMSO中的1H-NMR和13C-NMR的化学位移的解析结果如下：
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6+D2O)：
δ(ppm)＝4.81(1H，d，J＝9.6Hz，glcH-1)，6.76(1H，d，J＝8.2Hz，H-5′)，6.80(1H，dd，J＝8.1，1.9Hz，H-6′)，7.03(1H，d，J＝1.8Hz，H-2′)，6.99(1H，d，J＝8.8Hz，H-6)，7.93(1H，d，J＝8.8Hz，H-5)，8.30(1H，s，H-2)。
13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：
δ(ppm)＝153.0(C-2)，123.7(C-3)，175.3(C-4)，126.7(C-5)，115.8(C-6)，161.5(C-7)，113.1(C-8)，153.0(C-9)，117.4(C-10)；123.4(C-1′)，115.8(C-2′)，145.2(C-3′)，145.7(C-4′)，117.1(C-5′)，120.2(C-6′)；73.9(C-1″)，71.3(C-2″)，79.2(C-3″)，70.9(C-4″)，82.3(C-5″)，61.9(C-6″)。
MS分析制得的3′-hydroxypuerarin的分子量为432。
本发明用微生物转化方法获得的3′-羟基化葛根素其抗氧化活性比葛根素高20倍，且水溶性是底物的1.3以上，其他的药理活性都有不同程度的改善，工艺简单，产品纯度高，具有很好的应用前景。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1.将100ml PDA培养基放入500ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Trichoderma harzianum NJ01(CGMCC1523)菌种，30℃，200rpm振荡发酵培养36小时后，停止发酵，纱布过滤分离菌丝体和发酵液，取62.5ml菌液的菌丝体加入到含有0.5％葛根素，25ml磷酸盐缓冲液(pH5.3)的250ml三角瓶中，30℃，200rpm振荡通气进行葛根素羟基化静息细胞转化反应，48小时后，停止转化反应，过滤去除菌丝体，上清液中含有38％的3′-hydroxypuerarin。上清液用5ml正丁醇萃取两次后，3′-hydroxypuerarin含量可达到80％。浓缩液经硅胶柱层析分离浓缩后，得到纯度达95％的3′-hydroxypuerarin粉末。
实施例2.将50ml PDA培养基放入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Trichoderma harzianum ATCC20671菌种，20℃，150rpm振荡发酵培养，96小时后，停止发酵，过滤使菌丝体和发酵液分离，取62.5ml菌液的菌丝体加入到含有0.5％葛根素，25ml磷酸盐缓冲液(pH5.3)的250ml三角瓶中，20℃，150rpm振荡通气进行葛根素羟基化静息细胞转化反应，12小时后，停止转化反应，过滤去除菌丝体，上清液中含有(纯度32％)3′-hydroxypuerarin。上清液用10ml正丁醇萃取两次后，3′-hydroxypuerarin纯度可达到80％。浓缩色谱分离后，可得到(纯度90％)3′-hydroxypuerarin粉末。
实施例3.将3.5L PDA培养基放入5L全自动发酵罐，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Trichoderma harzianum ATCC64060菌种，28℃，400rpm通气发酵，36小时后，停止发酵，过滤使菌丝体和发酵液分离，取62.5ml菌液的菌丝体加入到含有0.5％葛根素，25ml磷酸盐缓冲液(pH5.3)的250ml三角瓶中，30℃，200rpm振荡通气进行葛根素羟基化静息细胞转化反应，48小时后，停止转化反应，过滤去除菌丝体，上清液中含有45％的3′hydroxypuerarin。上清液用15ml正丁醇萃取两次后，3′-hydroxypuerarin含量可达到80％。浓缩色谱分离后，可得到(纯度90％)3′-hydroxypuerarin粉末。
实施例4.将100ml含(2％)淀粉，(2％)玉米浆培养基放入500ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Trichoderma harzianum NJ01(CGMCC 1523)菌种，28℃，250rpm振荡发酵培养，36小时后，停止发酵，过滤使菌丝体和发酵液分离，取62.5ml菌液的菌丝体加入到含有0.5％葛根素，25m1磷酸盐缓冲液(pH5.5)的250ml三角瓶中，28℃，250rpm振荡通气进行葛根素羟基化静息细胞转化反应。48小时后，停止转化反应，过滤去除菌丝体，上清液直接浓缩、干燥后，可得到3′-hydroxypuerarin粉末(纯度为50％)。
实施例5.将100ml含(1％)淀粉，(3％)玉米浆培养基放入500ml三角瓶共15瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Trichoderma harzianum NJ01(CGMCC1523)菌株的孢子，25℃，220rpm通气发酵，36小时后，停止发酵，过滤使菌丝体和发酵液分离，取1500ml菌液的菌丝体加入到475ml磷酸盐缓冲液(pH5.3)，再加入25ml含40g/L葛根素的二甲基亚砜溶液(混合相中含葛根素2g/L)分装入5个500ml三角瓶中。上述混合相于25℃，200rpm振荡通气进行葛根素羟基化静息细胞转化反应，72小时后，停止转化反应，过滤去除菌丝体，上清液用250ml正丁醇萃取两次后，经HPLC制备色谱分离，浓缩结晶后，可得到0.6g纯度为98％的3′-hydroxypuerarin粉末。
实施例6：与实施例1基本相同，但菌种采用Trichoderma harzianumATCC60850。
实施例7：与实施例1基本相同，但菌种采用Trichoderma harzianumATCC52443。
实施例8：与实施例1基本相同，但菌种采用Hypocrea lixii ATCCMYA-2453。
本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。
Claims (8)
1、一种葛根素羟基化的微生物转化方法，所述的方法是：
将具有葛根素羟基化酶活力的微生物菌种接种到培养液中，进行发酵培养；发酵结束后，将发酵液与菌丝体分离；所获菌丝体作为静息细胞，加入到含有葛根素的转化液中，使葛根素转化为羟基葛根素；
转化结束后，去除菌丝体，上清液经浓缩、低温干燥处理后，可得3′-羟基葛根素固体；或者将转化液的上清液用有机溶剂萃取处理，有机溶剂萃取液再用水反萃取后，经浓缩、硅胶层析分离，得到含3′-羟基葛根素的溶液，再将含3′-羟基葛根素的溶液经浓缩、或低温处理后，得到3′-羟基葛根素粉末或晶体。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的具有葛根素羟基化活力的微生物菌种是哈茨木霉，或者是任何可羟基化葛根素的微生物或混合微生物。
3、根据权利要求2所述的葛根素羟基化的微生物转化方法，其特征在于，所述的哈茨木霉是Trichoderma harzianum NJ01(CGMCC1523)，Trichoderma harzianum ATCC20671，Trichoderma harzianum ATCC64060，Trichoderma harzianum ATCC60850，Trichoderma harzianumATCC52443，Hypocrea lixii ATCC MYA-2453中的一种或几种。
4、根据权利要求1或2所述的葛根素羟基化的微生物转化方法，其特征在于所述的用于发酵培养的培养液，是PDA培养液或其它任何适合于哈茨木霉或其它能羟基化葛根素的微生物生长的营养介质。
5、根据权利要求4所述的葛根素羟基化的微生物转化方法，其特征在于微生物发酵培养条件是：20～40℃，10～400rpm摇瓶振荡或通气、或搅拌通气或管道通气供氧，发酵12～96小时。
6、根据权利要求5所述的葛根素羟基化的微生物转化方法，其特征在于发酵培养液与菌丝体分离，采用过滤分离方法或离心分离方法。
7、根据权利要求6所述的葛根素羟基化的微生物转化方法，其特征在于所述发酵培养后获得的菌丝体，可作为静息细胞用于葛根素羟基化，转化反应可在水相、有机相或水相-有机双相中进行：
水相转化条件为：底物质量比浓度为大于0.01％至饱和，在任意一种pH3～7的偏酸性的缓冲溶液中；
有机相为乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺，或其他对细胞毒性较小的有机溶剂；
水相-有机相为上述水相与有机相的混合物；
转化温度范围在20～40℃，10～400rpm摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间12～96小时，转化结束后，将转化液与菌丝体过滤或离心分开，可获得含有羟基葛根素的转化液。
8、根据权利要求7所述的葛根素羟基化的微生物转化方法，其特征在于所说的萃取转化液的有机溶剂为正丁醇，或任何其他可萃取产物的有机溶剂。
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