CN1313599C - 一种筛选转糖基β－半乳糖苷酶产生菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，步骤是：先以乳糖为唯一碳源将样品微生物进行富集后选择平板分离，然后再通过筛选β-半乳糖苷酶水解活性和转半乳糖基活性而得到转糖基β-半乳糖苷酶产生菌。利用本发明的方法可简便有效地从自然界筛选出转糖基β-半乳糖苷酶产生菌，并可获得转糖基活性高的β-半乳糖苷酶产生菌，为工业微生物的开发，特别是为工业化生产低聚半乳糖提供了新的菌种来源。

Description

一种筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法

技术领域

本发明涉及一种筛选微生物的方法，尤其涉及一种筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法。

技术背景

低聚半乳糖是母乳中的天然组分之一，其最重要最根本的生理功能源于它对双歧杆菌的增殖作用。由于低聚半乳糖具有很好的热稳定性和耐酸性，其保健作用引起了人们的极大关注。目前，低聚半乳糖的生产主要通过微生物酶法合成，即通过β-半乳糖苷酶或乳糖酶以乳糖为底物转糖基合成。由于糖苷酶催化的合成反应是可逆反应，即转糖基产物可作为底物被酶水解，所以合成效率不是很高。因此，寻求可以产生较强转糖基活性β-半乳糖苷酶的微生物成为目前研究的热点，但是，在检索的相关文献中，目前国际上还没有筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌方法的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法。

本发明筛选方法的要点是，样品微生物经乳糖富集选择培养后通过两次活性筛选得到，即先以乳糖为唯一碳源将样品微生物富集培养后进行平板选择分离，然后再筛选β-半乳糖苷酶水解活性和转半乳糖基活性而得到。

本发明的筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，具体由下述步骤组成：

(1)取菌样加入以乳糖为唯一碳源的培养液中富集培养，用无菌水将所述培养液稀释成10^-1、10^-3、10^-5、10^-7梯度，各取200μL均匀涂布于乳糖筛选平板上，细菌筛选平板选择35～40℃培养20～28小时，真菌筛选平板选择26～30℃培养48～72小时；

上述细菌筛选用细菌富集选择培养基或斜面培养基，其配方是：乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化钠3±2g/L，pH7.0～7.5，固体培养基加琼脂20±2g/L；

上述真菌筛选用真菌富集选择培养基或斜面培养基，其配方是：土豆汁(土豆200±2g/L)，乳糖10±2g/L，固体培养基加琼脂20±2g/L，自然pH；

(2)培养后，分别挑取形态不同的菌落，通过平板划线进行分离纯化，重复3次；

(3)对分离菌株进行镜检，确定纯度：细菌以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)作对照，进行革兰氏染色，镜检可区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；真菌制成水浸片，镜检可观察菌丝特征及孢子产生方式，初步鉴定到属；

(4)将上述镜检得到的纯化菌株分别接种于产酶发酵培养液中，细菌于35～40℃摇床培养16～20小时；真菌于26～30℃摇床培养40～50小时，摇床转速为180转/分；

所述产酶发酵培养基配方是：乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，CaCl₂0.11g/L，MnSO₄0.001g/L，MgSO₄·7H₂O0.3g/L，KH₂PO₄0.05gm，FeSO₄·7H₂O0.03g/L，细菌pH为7.0～7.5，真菌pH为6.0～6.5；

(5)待上述培养达到所需菌量后，以12,000转/分离心2～5分钟，收集产酶发酵培养液中的细菌或酵母；对于霉菌用滤纸抽滤获得菌细胞；

(6)将上述菌细胞与β-半乳糖苷酶水解底物——邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶ONPG溶液＝1∶9的比例混合，40℃反应10～15分钟；

(7)加Na₂CO₃溶液终止反应，以12,000转/分离心2～5分钟，收集上清液；

(8)如果上清液呈黄色，说明原无色的ONPG被β-半乳糖苷酶水解成了黄色的邻硝基苯酚，即证明该菌细胞含有β-半乳糖苷酶，即为产β-半乳糖苷酶菌株；

(9)将上述产β-半乳糖苷酶菌株的菌细胞，以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶缓冲液＝1∶1的比例，将菌细胞悬于缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融2～3次，如此菌细胞悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液；

(10)将上述粗酶液以体积比计，按粗酶液∶乳糖溶液＝1∶3的比例混合，于40～60℃进行转糖基反应4～10小时，其中：乳糖溶液浓度为30％(w/v)，溶剂是上述缓冲液，待反应完毕后，12,000转/分离心2～5分钟，上清液即含有转糖基反应产物低聚半乳糖；

(11)将上述反应产物进行薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，判定酶转糖基活性，其中，展层剂为正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，显色剂为20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯，于120℃烘烤10分钟，糖斑点的显色根据其种类从棕黄色至深紫色；如果乳糖斑点附近生成了新的寡糖斑点，则产生的β-半乳糖苷酶有转糖基活性；反之则不存在转糖基活性；

(12)以寡糖斑点越大、越多，即说明酶的转糖基活性越强为依据，筛选出产转糖基β-半乳糖苷酶活性较高的菌株。

其中，上述细菌筛选平板优先选择37℃培养24～26小时，真菌筛选平板优先选择28℃培养48～60小时。

其中，上述细菌筛选用富集选择培养基或斜面培养基配方优选是：乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH7.2～7.5，固体培养基加琼脂20g/L。

其中，上述真菌选用富集选择培养基或斜面培养基配方优选是：土豆汁(土豆200g/L)，乳糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH，固体培养基加琼脂20g/L。

其中，上述步骤(4)所述在产酶发酵培养液中的培养条件优选是：细菌于37℃摇床培养16～18小时；真菌于28℃摇床培养40～48小时。

其中，上述步骤(6)所述ONPG溶液的浓度优选是2mmol/L。

其中，上述步骤(7)所述Na₂CO₃溶液浓度优选是0.5mol/L。

其中，上述缓冲液优选是pH6.5～7.5的50mmol/L磷酸钾缓冲液。

其中，上述缓冲液最优选是pH7.0～7.5的50mmol/L磷酸钾缓冲液。

其中，上述步骤(10)所述转糖基反应的条件优选是：温度40～50℃，进行转糖基反应6～8小时。

其中，上述步骤(10)还可选择转糖基活性较高菌株的低聚糖产物，进行高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析和薄层扫描分析，确定低聚糖得率最高的菌株。

对于筛选出的转糖基β-半乳糖苷酶活性高的菌株，还可以作进一步的菌种鉴定，判断是否为新发现的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌株。

本发明提供了一种筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，可以简便有效地从自然界筛选出转糖基β-半乳糖苷酶产生菌，并可获得转糖基活性高的β-半乳糖苷酶产生菌，为工业微生物的开发，特别是为工业化生产低聚半乳糖提供了新的菌种来源。

具体实施方式

实施例1：从土壤中筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌

1.能利用乳糖为唯一碳源生长菌株的分离纯化

将10g土样加入100mL以乳糖为唯一碳源的培养液中富集培养，将培养液用无菌水稀释成10^-1、10^-3、10^-5、10^-7梯度，各取200μL均匀涂布于乳糖选择平板上。细菌筛选平板于37℃培养24小时，真菌筛选平板于28℃培养48～60小时。10^-5梯度平板长出的菌落种类多，并且便于纯化。分别挑取形态不同的菌落，通过平板划线进行分离纯化，重复3次。对分离菌株进行镜检，确定纯度：细菌以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)作对照，进行革兰氏染色，镜检可区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；真菌制成水浸片，镜检可观察菌丝特征及孢子产生方式，初步鉴定到属。最后将镜检得到的纯化株菌分别保存到试管斜面上，4℃储藏。

利用上述分离纯化过程共获得15株菌能以乳糖为唯一碳源生长，其中细菌9株、真菌6株。将15株菌分别进行编号，细菌为B1、……、B9；真菌为F1、……、F6。

上述细菌筛选用细菌富集选择培养基(也作为斜面培养基)配方是：乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH7.2～7.5，固体培养基加琼脂20g/L。

上述真菌筛选用富集选择培养基(也作为斜面培养基)配方是：上豆汁(土豆200g/L)，乳糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH，固体培养基加琼脂20g/L。

2.产β-半乳糖苷酶菌株的筛选

将上述分离得到的15株菌分别接种至30ml产酶发酵培养液中，细菌于37℃摇床培养18小时，真菌于28℃摇床培养40小时，摇床转速均为180转/分。细菌酵母培养液于12,000转/分离心5分钟获得菌细胞；霉菌用滤纸(双圈牌101快速定性滤纸)抽滤获得菌细胞。然后测定菌细胞β-半乳糖苷酶水解活性：将菌细胞与β-半乳糖苷酶水解底物——邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)混合进行反应，如果ONPG被水解，即认为该菌产β-半乳糖苷酶。

取菌细胞50mg，加2mmol/L的ONPG(无色)溶液450μL，40℃反应10分钟，加1mL0.5mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，12,000转/分离心2分钟。如果上清液呈黄色，说明原无色的ONPG被β-半乳糖苷酶水解成了黄色的邻硝基苯酚，菌细胞有β-半乳糖苷酶的存在。如果对上清液测OD₄₀₀，可以进行水解酶活定量。酶的活力单位规定：以1分钟水解ONPG释放1μmol邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位。

上述筛选过程共获得9株菌产β-半乳糖苷酶，其中5株细菌、4株真菌，分别为B1、B2、B4、B5、B9、F1、F2、F3、F4。

上述产酶发酵培养基配方是：乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，CaCl₂0.11g/L，MnSO₄0.001g/L，MgSO₄·7H₂O0.3g/L，KH₂PO₄0.05g/L，FeSO₄·7H₂O0.03g/L，pH7.0～7.5(细菌)或pH6.0～6.5(真菌)。

经过系列实验摸索，上述产酶发酵培养基也可简化为如下产酶发酵培养基配方：乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH7.0～7.5(细菌)或pH6.0～6.5(真菌)；其中，所述pH还可以进一步优选为pH7.2～7.5(细菌)或pH6.2～6.5(真菌)。

3.产转糖基β-半乳糖苷酶菌株的筛选

将上述9种β-半乳糖苷酶产生菌的菌细胞制成粗酶液，进行转半乳糖基活性的筛选。

取50mg菌细胞，悬浮于50μL pH7.0、50mmol/L的磷酸钾缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融2次，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。取100μL粗酶液，加入300μL pH7.0磷酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，分成2等份分别于40℃、50℃进行反应，细菌反应4小时，真菌反应8小时，12,000转/分离心5分钟，上清液即含反应产物——低聚半乳糖。

将反应产物进行薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，确定转糖基活性。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2)中展层，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点的显色根据其种类从棕黄色至深紫色。如果乳糖斑点附近生成了新的寡糖斑点，则产生的β-半乳糖苷酶有转糖基活性；反之则不存在转糖基活性。寡糖斑点越大、越多，说明酶的转糖基活性越强。

结果确定2株细菌(B1、B5)和1株真菌(F3)具有较好的转糖基活性。

将菌株B1、B5和F3的转糖基产物进行高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)分析和薄层扫描分析，B1、B5、F3菌的低聚糖得率分别为45.1％、54.5％、38.6％，其中B5菌的低聚糖得率最高。

B1、B5菌由16S rDNA同源序列比较和生理生化特性分别鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)；F3由形态学特征鉴定为青霉(Penicillum sp.)。目前国际上没有成团肠杆菌和阴沟肠杆菌β-半乳糖苷酶以乳糖为底物催化生产低聚半乳糖的报道。

上述HPLC分析所用设备及条件：岛津(SHIMADZU)高效液相色谱仪；岛津RID-10A示差检测器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱(300mm×7.8mm)；流动相为三蒸水，流速为0.2mL/min，柱温80℃；结果分析软件为Class-VP6.0。转糖基产物用0.2μm滤膜过滤后，稀释成5％(w/v)的糖溶液，进样分析。

上述薄层扫描分析所用设备及条件：岛津(SHIMADZU)CS-9301双波长飞点薄层扫描仪，检测波长为550nm。对上述薄层层析板进行扫描分析。

实施例2：从牛奶渣中筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌

1.能利用乳糖为唯一碳源生长菌株的分离纯化

将10g牛奶渣加入100mL以乳糖为唯一碳源的培养液中富集培养，将培养液用无菌水稀释成10^-2、10^-4、10^-6、10^-8梯度，各取200μL均匀涂布于乳糖选择平板上。细菌筛选平板于37℃培养24小时，真菌筛选平板于28℃培养60小时。10^-6梯度平板长出的菌落种类多，并且便于纯化。分别挑取形态不同的菌落，通过平板划线进行分离纯化，重复3次。对分离菌株进行镜检，确定纯度：细菌以金黄色葡萄球菌(Staphylococcuscmreus)和大肠杆菌(Escherichia coli)作对照，进行革兰氏染色，镜检可区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；真菌制成水浸片，镜检可观察菌丝特征及孢子产生方式，初步鉴定到属。最后将镜检得到的纯化株菌分别保存到试管斜面上，4℃储藏。

利用上述分离纯化过程共获得154株菌能以乳糖为唯一碳源生长，其中99株细菌和55株真菌。分别进行编号，细菌为MB1、……、MB99；真菌为MFl、……、MF55。

上述细菌筛选用富集选择培养基(也作为斜面培养基)配方是：乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，NaCl 3g/L，pH7.2～7.5，固体培养基加琼脂20g/L。

上述真菌筛选用富集选择培养基(也作为斜面培养基)配方是：土豆汁(土豆200g/L)，乳糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH，固体培养基加琼脂20g/L。

2.产β-半乳糖苷酶菌株的筛选

将上述分离得到的154株菌分别接种至30mL产酶发酵培养液中，细菌于37℃摇床培养18小时，真菌于28℃摇床培养40小时，摇床转速为180转/分。细菌和酵母培养液于12,000转/分离心5分钟获得菌细胞；霉菌用滤纸抽滤获得菌细胞。然后测定菌细胞β-半乳糖苷酶水解活性：将菌细胞与β-半乳糖苷酶水解底物——ONPG混合进行反应，如果ONPG被水解，即认为该菌产β-半乳糖苷酶。

取菌细胞50mg，加2mmol/L的ONPG溶液450μL，40℃反应10min，加1mL0.5mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，12,000转/分离心2分钟。如果上清液呈黄色，说明ONPG(无色)被β-半乳糖苷酶水解成了黄色的邻硝基苯酚，菌细胞有β-半乳糖苷酶的存在。上清测OD₄₀₀，可以对水解酶活进行定量。酶的活力单位规定：以1分钟水解ONPG释放1μmol邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位。

上述筛选过程获得37株菌产β-半乳糖苷酶，其中27株细菌和1O株真菌。

上述产酶发酵培养基：乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，CaCl₂0.11g/L，MnSO₄0.001g/L，MgSO₄·7H₂O0.3g/L，KH₂PO₄0.05g/L，FeSO₄·7H₂O0.03g/L，pH7.2～75(细菌)或pH6.2～6.5(真菌)。

3.产转糖基β-半乳糖苷酶菌株的筛选

将上述37种β-半乳糖苷酶产生菌的菌细胞制成粗酶液，进行转半乳糖基活性的筛选。取50mg菌细胞，悬浮于50μL pH7.0、50mmol/L的磷酸钾缓冲液中，于-20℃以下完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融2次，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。取100μL粗酶液，加入300μLpH7.0磷酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，分成2等份分别于40℃、50℃进行反应，细菌反应4小时，真菌反应8小时，12,000转/分离心5分钟，上清液即含反应产物——低聚半乳糖。

将反应产物进行TLC分析，确定转糖基活性。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2)中展层，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点的显色根据其种类从棕黄色至深紫色。如果乳糖斑点附近生成了新的寡糖斑点，则产生的β-半乳糖苷酶有转糖基活性；反之则不存在转糖基活性。寡糖斑点越大、越多，说明酶的转糖基活性越强。

结果确定12株菌有较好的转糖基活性，其中5株细菌和7株真菌。

将上述12株菌的转糖基产物进行HPLC分析，结果有9株菌的低聚糖得率在30～35％：3株菌(1株细菌和2株真菌)的低聚糖得率在40％以上，编号为MB6、MF8、MF10，低聚糖得率分别为42.3％、41.2％、40.6％。

MB6、MF8、MF10菌由形态学特征分别鉴定为：产芽孢菌、假丝酵母(Candida sp.)、青霉(Penicillum sp.)。

上述HPLC分析和薄层扫描分析所用设备及条件同实施例1。

Claims (9)

1.一种筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，由下述步骤组成：

(1)取菌样加入以乳糖为唯一碳源的培养液中富集培养，用无菌水将所述培养液稀释成10^-1、10^-3、10^-5、10^-7梯度，各取200μL均匀涂布于乳糖筛选平板上，细菌筛选平板选择35～40℃培养20～28小时，真菌筛选平板选择26～30℃培养48～72小时；

上述细菌筛选用富集选择培养基或斜面培养基，其配方是：乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化钠3±2g/L，pH 7.0～7.5，固体培养基加琼脂20±2g/L；

上述真菌筛选用富集选择培养基或斜面培养基，其配方是：土豆汁其中土豆200±2g/L，乳糖10±2g/L，琼脂20±2g/L，自然pH；

(2)培养后，分别挑取形态不同的菌落，通过平板划线进行分离纯化，重复三次；

(3)对分离菌株进行镜检，确定纯度：细菌以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)作对照，进行革兰氏染色，镜检可区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；真菌制成水浸片，镜检可观察菌丝特征及孢子产生方式，初步鉴定到属；

(4)将上述镜检得到的纯化菌株分别接种于产酶发酵培养液中，细菌于35～40℃摇床培养16～20小时；真菌于26～30℃摇床培养40～50小时，摇床转速为180转/分；

所述产酶发酵培养基配方是：乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，CaCl₂ 0.11g/L，MnSO₄ 0.001g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，KH₂PO₄ 0.05g/L，FeSO₄·7H₂O 0.03g/L，细菌pH为7.0～7.5，真菌pH为6.0～6.5；

(5)待上述培养达到所需菌量后，以12,000转/分离心2～5分钟，收集产酶发酵培养液中的细菌或酵母；对于霉菌用滤纸抽滤获得菌细胞；

(6)将上述菌细胞与β-半乳糖苷酶水解底物——邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶ONPG溶液＝1∶9的比例混合，40℃反应10～15分钟；

(7)加Na₂CO₃溶液终止反应，以12,000转/分离心2～5分钟，收集上清液；

(8)如果上清液呈黄色，说明原无色的ONPG被β-半乳糖苷酶水解成了黄色的邻硝基苯酚，即证明该菌细胞含有β-半乳糖苷酶，即为产β-半乳糖苷酶菌株；

(9)将上述产β-半乳糖苷酶菌株的菌细胞，以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶缓冲液＝1∶1的比例，将菌细胞悬于缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融2～3次，如此菌细胞悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液；

(10)将上述粗酶液以体积比计，按粗酶液∶乳糖溶液＝1∶3的比例混合，于40～60℃进行转糖基反应4～10小时，其中：乳糖溶液浓度为30％重量体积百分比，溶剂是上述缓冲液，待反应完毕后，12,000转/分离心2～5分钟，上清液即含有转糖基反应产物低聚半乳糖；

(11)将上述反应产物进行薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，判定酶转糖基活性，其中，展层剂为正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，显色剂为20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯，于120℃烘烤10分钟，糖斑点的显色根据其种类从棕黄色至深紫色；如果乳糖斑点附近生成了新的寡糖斑点，则产生的β-半乳糖苷酶有转糖基活性；反之则不存在转糖基活性；

(12)以寡糖斑点越大、越多，即说明酶的转糖基活性越强为依据，筛选出产转糖基β-半乳糖苷酶活性较高的菌株。

2.如权利要求1所述的筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，其特征是，细菌筛选平板选择37℃培养24～26小时，真菌筛选平板选择28℃培养48～60小时。

3.如权利要求1所述的筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，其特征是，所述细菌筛选用富集选择培养基或斜面培养基配方是：乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH 7.2～7.5，固体培养基加琼脂20g/L；真菌选用富集选择培养基或斜面培养基配方优选是：土豆汁其中土豆200g/L，乳糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH，固体培养基加琼脂20g/L。

4.如权利要求1所述的筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，其特征是，步骤(4)所述在产酶发酵培养液中的培养条件是：细菌于37℃摇床培养16～18小时；真菌于28℃摇床培养40～48小时。

5.如权利要求1所述的筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，其特征是，步骤(6)所述ONPG溶液的浓度是2mmol/L。

6.如权利要求1所述的筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，其特征是，步骤(7)所述Na₂CO₃溶液浓度是0.5mol/L。

7.如权利要求1所述的筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，其特征是，所述缓冲液是pH 6.5～7.5的50mmol/L磷酸钾缓冲液。

8.如权利要求7所述的筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，其特征是，所述缓冲液是pH 7.0～7.5的50mmol/L磷酸钾缓冲液。

9.如权利要求1所述的筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，其特征是，步骤(10)所述转糖基反应的条件是：温度40～50℃，进行转糖基反应4～8小时。