CN104764739B - 一种基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于拥有β‑半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法；通过将细菌菌液和待测物质混合，得到混合液；向混合液中加入ONPG（2‑硝基苯‑β‑D‑半乳糖苷），得到混合反应液；向混合反应液中加入碳酸钠，得到最终液；测试最终液的吸光度，根据吸光度来评价生物毒性；其中，所述细菌可分解ONPG产生β‑半乳糖苷酶；本方法无需诱导，在1h左右快速检测生物毒性，操作简单，无需特殊的大型仪器，对操作人员要求低。
Description
技术领域
本发明涉及生物毒性检测领域，尤其是涉及利用拥有β-半乳糖苷酶的细菌来检测生物毒性的方法。
背景技术
随着环境污染问题的日渐突出，生物毒性的检测，尤其是生物毒性的快速检测，其重要性愈发凸显。传统上是使用鱼和水蚤来检测生物毒性，但它往往存在响应慢、耗时长、费用高等问题。而微生物繁殖速度快、价格低廉，是检测生物毒性的理想材料。
是目前生物毒性检测领域最成熟的产品，它是利用费希尔弧菌（Vibrio fischeri）。该菌是一种来自海洋中的发光细菌，稀有少见，价格昂贵，在正常代谢时会发出可见荧光；当有毒物质存在时，该菌的正常新陈代谢会受到抑制，它的可见荧光强度会有所降低，从而根据它的可见荧光强度可以判断出有毒物质对该菌的毒害程度，达到生物毒性检测的目的。虽然已经发展得很成熟，其对淡水样品的检测存在一定的限制。这是由于费希尔弧菌生存于海洋中，在淡水中几乎不存在，且不能在淡水中生存。因此Microtox在检测淡水样品时都不是在真实的淡水环境下进行的，而是在3%盐分的溶液中，这样就和真实的淡水环境存在偏差。一般而言，发光细菌都是生存在海洋中，在淡水中的极为少见，这就限制了发光细菌在检测生物毒性方面的应用。且在实际检测中遇到的污水样品往往存在一定的浊度，浊度的存在会对荧光的观察存在干扰，从而影响到检测的精度和使用范围。
Toxi-Chromo是加拿大ebpi公司开发的一款生物毒性检测装置；其原理是利用经诱导的大肠杆菌（E.Coli）能产生β-半乳糖苷酶，该酶能将ONPG、X-gal等乳糖类似物水解，生成有颜色的物质；当有毒物质存在时，β-半乳糖苷酶的活性就会受到抑制，从而被水解的乳糖类似物的量就会减少，颜色变浅；根据颜色的深浅即可判断出有毒物质对大肠杆菌的毒害程度。Toxi-Chromo利用的是经过诱导的能产生β-半乳糖苷酶的大肠杆菌，诱导过程较为繁琐。
因此，需要一种快速、简便、使用范围广泛的检测生物毒性的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法；通过将细菌菌液和待测物质混合，得到混合液；向混合液中加入ONPG（2-硝基苯-β-D-半乳糖苷），得到混合反应液；向混合反应液中加入碳酸钠，得到最终液；测试最终液的吸光度，根据吸光度来评价生物毒性；本方法无需诱导，在1h左右快速检测生物毒性，操作简单，无需特殊的大型仪器，对操作人员要求低。
一种基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，包括以下步骤：
1）将细菌菌液和待测物质混合，得到混合液；
2）向混合液中加入ONPG（2-硝基苯-β-D-半乳糖苷），得到混合反应液；
3）向混合反应液中加入碳酸钠，得到最终液；
4）测试最终液的吸光度，根据吸光度来评价生物毒性；
其中，所述细菌是无需诱导即可分解ONPG产生β-半乳糖苷酶的细菌。
进一步地，所述细菌为大肠杆菌ATCC 25922或枯草芽孢杆菌1.1086。
优选地，所述大肠杆菌ATCC 25922或枯草芽孢杆菌1.1086选用处于对数生长期的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
大肠杆菌ATCC 25922和枯草芽孢杆菌1.1086均是于2013年6月购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，该中心联系方式为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，电话为010-64807355。
大肠杆菌培养基为传统的LB培养基：取0.5g牛肉膏、1g蛋白胨和0.5g氯化钠溶于100mL去离子水中，调节pH至7.0～7.4，于高压蒸汽灭菌中120℃灭菌20min，自然冷却，即可使用。
枯草芽孢杆菌的培养基由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，也是生物学上常见的培养基：取1g蛋白胨、0.3g牛肉提取物和0.5g氯化钠溶于100mL去离子水中，调节pH至7.0，于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，自然冷却。
优选地，步骤1）中，细菌菌液是将大肠杆菌或枯草芽孢杆菌分散在0.8%的氯化钠溶液中得到，OD600为1.2～3.5。
更优选地，步骤1）中，细菌菌液是将培养得到的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌离心分离，用氯化钠溶液清洗两次，之后再用氯化钠溶液分散后得到；其中，离心分离的转速是5000～8000转/分，时间为5～10min；清洗的转速是5000～6000转/分，时间为5～10min。使用0.8%氯化钠溶液。
细菌菌液和待测物质的用量比例无须限定，在应用时根据具体情况来确定。
优选地，步骤1）中，细菌菌液和待测物质混合后，在37℃放置30～60min，得到混合液。放置的目的是使待测物质与细菌充分作用。更优选地，放置30min。
优选地，步骤2）中，向混合液加入ONPG后，在37℃放置30～40min，得到混合反应液。放置的目的是使大肠杆菌水解ONPG。更优选地，放置30min。
更优选地，步骤2）中，ONPG溶液的浓度是4～10mg/mL。ONPG溶液的用量无须限定，在应用时根据具体情况来确定。
优选地，步骤3）中，向混合反应液加入碳酸钠后，高速离心，取上清液，得到最终液。碳酸钠溶液的浓度、用量、与混合反应液的用量比例等均无须限定，在应用时根据具体情况来确定。
优选地，步骤4）中，在420nm波长处测吸光度。
在实际检测时，可取等量的菌液到多个试管，往各试管中加入不同浓度的待测物质，使数个试管中待测物质的浓度形成梯度差。之后按照上面步骤分别测定吸光度，通过比较吸光度的大小来评价待测物质的生物毒性。吸光度越大，表明待测物质对细菌的生物毒性越小；吸光度越小，表明待测物质对细菌的生物毒性越大。可设置对照组来作为评价基底，对照组试管中加入0.8%氯化钠溶液来替代待测物质。
实际检测待测物质时，通过观察吸光度有无变化、变化大小来判断有无毒性、毒性大小。本方法可适用检测任意待测物质。在检测时，可通过提高待测物质的浓度等来使得检测效果更易于观察。
本发明的有益效果如下：
1、在使用大肠杆菌ATCC 25922菌液作为细菌菌液时，无需向大肠杆菌培养基中加入乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）等β-半乳糖苷酶诱导物。
2、首次利用枯草芽孢杆菌1.1086来检测生物毒性。
3、用0.8%氯化钠溶液分散细菌，有效避免了PBS溶液中磷酸一氢根会和金属离子生成沉淀的影响。
4、本方法可在1h左右快速检测生物毒性，操作简单，无需特殊的大型仪器，对操作人员要求低，有很广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明；
图1为本发明方法的基本原理图；
图2是实施例1中检测不同浓度Cd2+对大肠杆菌生物毒性的紫外-可见吸收光谱；
图3是对比例中检测不同浓度Cd2+对大肠杆菌生物毒性的紫外-可见吸收光谱；
图4是实施例2中检测不同浓度Cu2+对大肠杆菌生物毒性的紫外-可见吸收光谱；
图5是实施例3中检测不同浓度Cd2+对枯草芽孢杆菌生物毒性的紫外-可见吸收光谱；
图6是实施例4中检测不同浓度Pb2+对大肠杆菌生物毒性的紫外-可见吸收光谱。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面将通过具体的实施例进一步说明本发明的方案，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，但不限于此。
图1为本发明方法的基本原理图。
实施例1
一种基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，包括以下步骤：
1、配制LB培养基：取0.5g牛肉膏、1g蛋白胨和0.5g氯化钠溶于100mL去离子水中，调节pH至7.0～7.4，于高压蒸汽灭菌中灭菌。待LB培养基冷却后，向培养基中接种大肠杆菌（ATCC 25922）。然后将接种好的培养基置于37℃恒温水浴摇床中培养16h，此时大肠杆菌正好处于对数生长期。将大肠杆菌离心分离，用0.8%的NaCl溶液清洗两次，之后将大肠杆菌分散于0.8%的NaCl溶液中，得到一定浓度的大肠杆菌菌液。
2、取5个1.5mL的试管，编号为a，b，c，d，e。分别向各个试管中加入400μL大肠杆菌菌液，a试管作为对照组，向其中加入50μL0.8%的氯化钠溶液。b-e作为实验组，向其中分别加入50μL不同浓度的Cd（NO3）2溶液，使a-e 5个试管中Cd2+的浓度依次为0，10，30，50，100mg/L。
3、将试管置于37℃恒温培养箱中保温30min，随后往各个试管中均加入50μL浓度为4mg/mL的ONPG（2-硝基苯-β-D-半乳糖苷）溶液。
4、摇匀之后，再将试管置于37℃恒温培养箱中保温30min。再往各个试管中加入400μL浓度为1mol/L的Na2CO3溶液，摇匀，使β-半乳糖苷酶水解ONPG的反应得到终止。
5、10000转/分高速离心5min，取上清液在420nm波长处测吸光度。
图2是实施例1中检测不同浓度Cd2+对大肠杆菌生物毒性的紫外-可见吸收光谱（a1-e1中Cd2+的浓度依次为0，10，30，50，100mg/L）。从图中可以看出，Cd2+的浓度越大，吸光度越小；吸光度数值越大，表明ONP（邻硝基酚）的量越多，该浓度下Cd2+对大肠杆菌的毒害作用较低；吸光度数值越小，表明ONP的量越少，该浓度下Cd2+对大肠杆菌的毒害作用较大。
对比例
同实施例2，区别在于：①将大肠杆菌离心分离，用pH=7的PBS溶液清洗两次，最后将大肠杆菌分散于PBS溶液中，得到一定浓度的大肠杆菌菌液。②控制组的试管中加入50μLPBS溶液。
图3是对比例中检测不同浓度Cd2+对大肠杆菌生物毒性的紫外-可见吸收光谱。
用PBS溶液分散生物分子是生物学惯用做法，但具体到生物毒性检测时会存在一些问题。在检测金属离子对细菌的生物毒性时，由于PBS溶液是由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠配比而成的，磷酸一氢根会和金属离子发生反应生成沉淀（出了钾、钠、铵，其余的磷酸一氢盐都会形成沉淀），从而使金属离子的含量低于预想值，从而造成实验上的误差。而用氯化钠溶液分散时则不会存在沉淀的问题。从结果上来看，当用氯化钠溶液分散时，如图2，吸光度上的区分非常明显；而用PBS溶液分散时，如原图3，区分度非常的小。这也表明用氯化钠溶液分散的效果要好于用PBS溶液分散。
实施例2
同实施例1，区别在于：加入不同浓度的Cu(NO3)2溶液代替Cd(NO3)2溶液。
图4是实施例2中检测不同浓度Cu2+对大肠杆菌生物毒性的紫外-可见吸收光谱（a2-f2中Cu2+的浓度依次为0，10，30，40，50，70mg/L）。吸光度数值越大，表明ONP的量越多，该浓度下Cu2+对大肠杆菌的毒害作用较低；吸光度数值越小，表明ONP的量越少，该浓度下Cu2+对大肠杆菌的毒害作用较大。不难看出，Cu2+对大肠杆菌的生物毒性远大于Cd2+对大肠杆菌的生物毒性。
实施例3
1、配制枯草芽孢杆菌（菌号：1.1086）生长所需的培养基。取1g蛋白胨，0.3g牛肉提取物，0.5g氯化钠溶于100mL去离子水中，调节pH至7.0，于高压蒸汽灭菌锅中灭菌。待培养基冷却后，向培养基中接种枯草芽孢杆菌。随后将接种好的培养基置于37℃恒温水浴摇床中培养24h，此时枯草芽孢杆菌正好处于对数生长期。将枯草芽孢杆菌离心分离，用0.8%的NaCl溶液清洗两次，随后将细菌分散在0.8%的NaCl溶液中,得到一定浓度的枯草芽孢杆菌菌液。
2、3、4、5基本同实施例1。
图5是实施例3中检测不同浓度Cd2+对枯草芽孢杆菌生物毒性的紫外-可见吸收光谱（a3-d3中Cd2+的浓度依次为0，30，50，100mg/L）。吸光度数值越大，表明ONP的量越多，该浓度下Cd2+对枯草芽孢杆菌的毒害作用较低；吸光度数值越小，表明ONP的量越少，该浓度下Cd2+对枯草芽孢杆菌的毒害作用较大。
实施例4
同实施例3，区别在于：加入不同浓度的Pb(NO3)2溶液代替Cd(NO3)2溶液。
图6是实施例4中检测不同浓度Pb2+对枯草芽孢杆菌生物毒性的紫外-可见吸收光谱（a4-e4中Pb2+的浓度依次为0，10，30，50，100mg/L）。吸光度数值越大，表明ONP的量越多，该浓度下Pb2+对枯草芽孢杆菌的毒害作用较低；吸光度数值越小，表明ONP的量越少，该浓度下Pb2+对枯草芽孢杆菌的毒害作用较大。
从图中可以看出a4、b4和c4的吸光度值几乎没有变化，这表明即使Pb2+的浓度达到30mg/mL，Pb2+对枯草芽孢杆菌的生物毒性依旧不明显。同Cd2+对枯草芽孢杆菌的毒性及Cd2 +、Pb2+对大肠杆菌的生物相比，不难看出，对于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，Cd2+的生物毒性都要明显大于Pb2+的生物毒性。Pb2+对这两种细菌的生物毒性较弱，只有在较高浓度时才能体现出来。因此，可认为枯草芽孢杆菌检测Pb2+的最低限度是30mg/mL。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (11)
1.一种基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将细菌菌液和待测物质混合，得到混合液；
2）向混合液中加入ONPG，得到混合反应液；
3）向混合反应液中加入碳酸钠，得到最终液；
4）测试最终液的吸光度，根据吸光度来评价生物毒性；
其中，所述细菌是无需诱导即可分解ONPG产生β-半乳糖苷酶的细菌，所述细菌为枯草芽孢杆菌1.1086。
2.根据权利要求1所述的基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌1.1086选用处于对数生长期的枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，步骤1）中，细菌菌液是将枯草芽孢杆菌分散在0.8%的氯化钠溶液中得到，OD600为1.2～3.5。
4.根据权利要求1或3所述的基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，步骤1）中，细菌菌液是将培养得到的枯草芽孢杆菌离心分离，用氯化钠溶液清洗两次，之后再用氯化钠溶液分散后得到；其中，离心分离的转速是5000～8000转/分，时间为5～10min；清洗的转速是5000～6000转/分，时间为5～10min。
5.根据权利要求1所述的基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，步骤1）中，细菌菌液和待测物质混合后，在37℃放置30～60min，得到混合液。
6.根据权利要求1所述的基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，步骤1）中，细菌菌液和待测物质混合后，在37℃放置30min，得到混合液。
7.根据权利要求1所述的基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，步骤2）中，向混合液加入ONPG后，在37℃放置30～40min，得到混合反应液。
8.根据权利要求1所述的基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，步骤2）中，向混合液加入ONPG后，在37℃放置30min，得到混合反应液。
9.根据权利要求1所述的基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，步骤2）中，ONPG溶液的浓度是4～10mg/mL。
10.根据权利要求1所述的基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，步骤3）中，向混合反应液加入碳酸钠后，高速离心，取上清液，得到最终液。
11.根据权利要求1所述的基于拥有β-半乳糖苷酶的细菌检测生物毒性的方法，其特征在于，步骤4）中，在420nm波长处测吸光度。
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