CN101054561A - 一种可将糖基水解为羟基的微生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及糖基酶水解为羟基的方法，具体地说是一种可将糖基水解为羟基的微生物及其应用，所述微生物为Leifsonia shinshuensis DICP 16，CCTCC No.M 206026。菌株DICP 16或其发酵产生的水解酶，接触含C－7糖基的紫杉烷并水解C－7糖基，使该位置变为羟基。一个或多个C－7糖基，尤其是紫杉烷的C－7木糖基，在菌株DICP 16或其发酵产生的水解酶作用下被水解，糖基变为羟基；所得化合物可以是具有药理学活性的紫杉烷如紫杉醇和紫杉醇类似物，也可以是用于制备此类具药理活性紫杉烷的有用的中间体。
Description
技术领域
本发明涉及糖基酶水解为羟基的方法，具体地说是一种将C-7糖基紫杉烷转变为C-7羟基紫杉烷的微生物及其产生的水解酶，一个或多个糖基，尤其是紫杉烷的C-7木糖基，在酶或产酶的微生物作用下被水解，糖基转变为羟基。所得化合物可以是具有药理学活性的紫杉烷如紫杉醇和紫杉醇类似物，也可以是用于制备此类具药理活性紫杉烷的有用的中间体。
背景技术
紫杉烷是一类二萜化合物，是过去10多年内最有效的抗癌药之一，在制药领域有重要应用价值。例如，紫杉醇(Taxol)是一种具有如下结构的紫杉烷，
其中Ph是苯基，Ac是乙酰基，Bz是苯甲酰基。
紫杉醇等紫杉烷化合物广泛存在于红豆杉属植物的茎、叶和树皮中，目前已从紫杉植物中已分离得到300余种紫杉烷二萜类化合物(J.Nat.Prod.1999，62，1448-1472)。但紫杉属植物提取物中紫杉醇的含量很低，仅为0.0001～0.069％，平均0.015％；且共存杂质种类繁多，直接提取难度大，收率低。每提取生产1公斤紫杉醇需得砍伐3000棵成树。而1公斤紫杉醇仅能满足500个病人的用药。因此在世界范围内围绕紫杉醇资源可持续利用问题正展开前所未有的多学科、多层次广泛研究。
红豆杉枝叶被认为是目前最具利用价值的可再生资源。其枝叶提取物中含有多种紫杉烷类化合物具有与紫杉醇相同的母核结构，这些化合物可以通过生物及化学方法转化为紫杉醇的半合成中间体如巴卡亭III和10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)。在众多红豆杉属植物中，广泛存在C-7木糖基的紫杉烷，将这类化合物通过生物或化学手段转化为可被利用的C-7羟基化合物是对有限紫杉烷资源的有效利用。
Hanson RL等发现Moraxella sp.(莫氏杆菌)，Bacillus macerans(浸麻芽孢杆菌)，Bacillus circulans(环状芽孢杆菌)和Micrococcus sp.(微球菌)能产生转化7-木糖紫杉烷的β-木糖苷酶(Biotechnol.Appl.Biochem.1997，26，153-158；European patent 95300135.1)，其中莫氏杆菌的转化能力较强，62.5mg莫氏杆菌可在7小时内将0.5mg7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇完全转化为10-去乙酰基紫杉醇。未见其它相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可将糖基水解为羟基的微生物及其应用，可从带C-7糖基(尤其是木糖基)的紫杉烷类制备带C-7羟基的紫杉烷。本发明使用一种微生物或该微生物产生的酶接触至少一种含C-7糖基(尤其是木糖基)的紫杉烷并水解C-7糖基，使该位置变为羟基。该方法可制备至少一种含C-7羟基的紫杉烷。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种可将糖基水解为羟基的微生物，所述微生物为Leifsoniashinshuensis DICP 16，CCTCC No.M 206026。
所述生物学纯的微生物Leifsonia shinshuensis sp.菌株DICP 16或其发酵产生的水解酶，接触至少一种含C-7糖基(尤其是木糖基)的紫杉烷并水解C-7糖基，使该位置变为羟基。
用本发明提供的方法制备的一种紫杉烷的分子结构如下：
R1是羟基或酰氧基，尤其当R1具有分子III的结构时；
R2是酰氧基或羟基；
R3和R4是独立的氢，烷基，链烯基，炔基，环烷基，环链烯基，芳香基或杂环基。
本发明提供的方法中酶接触的一种底物的分子结构是：
R1，R2，R3和R4的含义同上述，“sugar”是指直接键合在C-7位的糖基，用菌株DICP 16或其发酵产生的水解酶能水解C-7糖基，使该位置变为羟基。
本发明提供的水解方法已考虑到具有分子结构I和II的化合物的手性中心的所有立体构型，这些立体异构体或者单独被水解，或者与其它立体异构体混合在一起而被水解。
本发明提供的方法的实用价值在于：紫杉烷是一类二萜化合物，在制药领域有重要应用价值。从植物中提取出的紫杉烷通常是各种紫杉烷的混合物，其中一种或几种紫杉烷带有C-7糖基，而只有带C-7羟基的紫杉烷(如紫杉醇)才是最终想要的产品。一个或多个C-7糖基，尤其是紫杉烷的C-7木糖基，在菌株DICP 16或其发酵产生的水解酶作用下被水解，糖基变为羟基；所得化合物可以是具有药理学活性的紫杉烷如紫杉醇和紫杉醇类似物，也可以是用于制备此类具药理活性紫杉烷的有用的中间体。
本发明提供的方法使得被水解紫杉烷的C-7基团的立体构型优先保留于产品中。C-7取代基的绝对立体构型与紫杉醇C-7羟基的绝对立体构型相同。
本发明提供的方法用于从带C-7糖基(尤其是木糖基)的紫杉烷类制备带C-7羟基紫杉烷时十分有效。用本发明提供的方法可以水解一种紫杉烷化合物，也可以序贯性的或同时水解不同紫杉烷化合物的混合品。由植物材料提取的紫杉烷混合物用本发明提供的方法水解，效果很好。该混合物用于工业制备的起始材料，其中不仅含一种或多种带C-7糖基(尤其是木糖基)的紫杉烷，还含有带其它C-7基团如羟基的紫杉烷。
具体实施方式
1、起始材料
本发明提供的方法所用的起始材料可以是任何能进行上述水解反应的带C-7糖基的紫杉烷。带C-7木糖基的紫杉烷可以是自然形成的，也可是化学转化所得，如7-木糖紫杉醇，7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇，7-木糖巴卡亭III，7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭III，7-木糖三尖杉宁碱，7-木糖-10-去乙酰基三尖杉宁碱，7-木糖紫杉醇C或7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇C以及化学转化所得的7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭III。上述自然形成的紫杉烷可以来自产紫杉烷植物的细胞培养或/和提取自产紫杉烷植物，尤其是红豆杉属植物如南方红豆杉，云南红豆杉，中华红豆杉，欧洲红豆杉(浆果红豆杉)，加拿大紫杉，西藏红豆杉，日本红豆杉(东北红豆杉)，太平洋短叶红豆杉，曼地亚红豆杉和喜马拉雅红豆杉等。可用的植物组织包括树根，针叶，树皮和树苗等。
2.酶与微生物
本发明水解方法中使用的酶或微生物可以是下面描述的任何能催化酶水解反应的酶或微生物。这些酶或微生物材料，不管其来源或纯度，都可在游离状态下使用，或者将其用物理吸附或诱捕方法固定在支持物上使用。生物学纯的微生物Leifsonia shinshuensis是新发现的产β-木糖苷酶的微生物。这种微生物的突变体，例如经化学的，物理的(如紫外辐射)或生物学方法(如分子生物学技术)改造以用于水解反应的突变菌株，也在本发明的考虑范围内。
本发明中所涉及的Leifsonia shinshuensis DICP 16，已经于2006年3月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M 206026。
Leifsonia shinshuensis的特征：革兰阳性杆菌，不形成孢子，在多种培养基上需氧生长，经两天培养长至0.3-0.4×2.5-3.0mm，菌落表面光滑，白色菌落在30℃长期放置转为淡棕色。菌在42℃时可生长，在45℃时不长。菌胞膜中主要的menaquinone为MK-11和MK-12。菌基因组DNA的G+C含量为71mol％。蛋白胨基质-，杆菌肽-，奥普托琴-，半纤维素酶+，尿素+，红四氮唑+，木糖-。分离自从大连化学物理研究所获得的红豆杉土壤样品。
本发明应用的酶是水解酶，尤其是聚糖酶或糖苷酶。本发明提供的微生物产这些酶，可用提取和纯化的方法分离它们。本发明提供的微生物可以以完整湿细胞的形式，或者以冻干，喷雾干燥或加热干燥的形式，或者以经破碎抽提处理后的形式被应用于水解反应。这些微生物经遗传工程改良后的形式也在本发明考虑范围内。宿主细胞可以是任何细胞，如大肠杆菌，将本发明提供的微生物的一个基因或一组基因转入宿主，使其表达催化水解反应所需的一个酶或多个酶。
本发明提供的水解方法可以在微生物发酵后进行(两阶段发酵和水解)，也可以与发酵同时进行(单阶段原位发酵和水解)。
培养基pH在4-7之间，培养温度在28-37℃之间。水解反应进行1-72小时，直至目的产品产量达最大。水解反应时，pH保持在≤7。PH 4-7效果好。
本发明应用一种水相液体作为水解反应介质，有机液体或有机/水双相液体亦可应用。本发明应用0.0025-2.5％(w/v)的带C-7位糖基的紫杉烷作为起始材料。
用本发明提供的方法产率超过90％(与起始的带C-7位糖基的紫杉烷相比，C-7位水解产物的百分比)。可选择性地达到C-7位水解，即所获产物只有C-7位水解，没有其它位置的水解。
3.分离
本发明提供的带C-7位羟基的产物可被分离纯化，例如用提取，蒸馏，结晶，和柱层析的方法。
4.应用
紫杉烷是一类二萜化合物，其结构已如上述。13位含一个侧链的紫杉烷如紫杉醇具有药理活性，是很好的抗癌药，可治疗乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，肺癌，黑色素瘤和白血病等。
本发明提供的水解方法所获化合物如紫杉醇是极有用的药物，并且可作为中间体来制备具有药理活性的13位含一个侧链的紫杉烷类。用本法制备的化合物如巴卡亭III或10-去乙酰基巴卡亭III的C-13位带一个羟基，可与中间体化合物如β-内酰胺偶联，以获得带C-13位酰氧基侧链的紫杉烷类如紫杉醇或类似物。用本法制备的带C-7位羟基的化合物可经修饰以便用于上述C-13位酰氧基侧链的偶联。例如，C-13位以外的其它位置上的一个或多个羟基在偶联前被保护起来，之后去掉保护。
5.目的化合物
本发明的水解方法非常适合水解具有分子结构II的紫杉烷，经酶水解可提供具有分子结构I的相应化合物。在分子结构I和II中，R2最好为羟基或R5-C(O)-O-，尤其当R5为烷基如甲基时；R3最好为烷基如甲基；R4最好为芳香基如苯基；R1最好为羟基或分子结构III的一个基团：
其中R6和R7是独立的烷基，链烯基，炔基，环烷基，环链烯基，芳香基，杂环或杂环氧基；R8是氢，烷氧羰基或羟基保护基团。
具有分子结构II的紫杉烷是：7-木糖紫杉醇，7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇，7-木塘巴卡亭III，7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭III，7-木糖三尖杉宁碱，7-木糖-10-去乙酰基三尖杉宁碱，7-木糖紫杉醇C和7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇C等。具有分子结构I的紫杉烷是：紫杉醇，10-去乙酰基紫杉醇，巴卡亭III，10-去乙酰基巴卡亭III，三尖杉宁碱，10-去乙酰基三尖杉宁碱，紫杉醇C和10-去乙酰基紫杉醇C等。
本发明结合具体实施例做进一步说明：
实施例1：木糖苷酶的筛选
准备琼脂板：1％木聚糖，0.05％酵母浸膏，0.05％胰蛋白胨，1.5％琼脂。用40毫升水悬浮0.2克土壤样品或腐木样品，每个平板涂布50微升1∶200的稀释悬液，50微升0.25毫克/毫升7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇。于室温(22℃)孵育一周，在长出的菌落上滴加1mM 4-甲基伞形基-β-D-木糖苷。71个在紫外灯下发荧光的菌落被挑出，于28℃孵育3-6天。
摇瓶培养基成份：1％木聚糖，0.2％酵母浸膏，0.2％胰蛋白胨，0.1％K2HPO4，0.1％KH2PO4。在28℃，175rpm条件下培养。两天后10毫升培养液中加入溶于0.2毫升甲醇的1毫克7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇或7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭III，继续培养两天。
另一种方法是先培养一天，加底物后再培养三天。
离心沉淀细胞，将其重悬在甲醇中，进行TLC和HPLC分析。71个菌落中，23个在TLC中出现产物斑点。这23个阳性菌落中，4个产生的10-去乙酰基紫杉醇(或10-去乙酰基巴卡亭III)量较多，在HPLC中出现明显的产物峰。由菌Leifsonia shinshuensis获得的产物浓度最高，该菌经再次划板纯化后用于以下实施例中。
实施例2：7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的水解
4升Erlenmeyer培养瓶中放入1升1％桦木木聚糖，0.2％酵母浸膏，0.2％胰蛋白胨，0.1％KH2PO4和0.1％K2HPO4，pH 7。将20毫升菌液接种于此培养基，30℃摇瓶培养3天。离心收集细胞，用50毫升50mM磷酸钾缓冲液(pH 7)洗涤，离心后重悬于此缓冲液中。在1.5毫升细胞悬液中加入1mg 7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(溶于0.2毫升甲醇和0.3毫升水)。100rpm，30℃混匀21小时。加入2毫升甲醇终止反应，进行HPLC分析。反应液中无7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇残留，并产生0.4毫克/毫升10-去乙酰基紫杉醇(产率100％)。此例反应过程如下：
实施例3：7-木糖-紫杉醇的水解
在1.5毫升细胞悬液(准备方法同例3)中加入0.5mg 7-木糖-紫杉醇(溶于0.2毫升甲醇和0.3毫升水)。100rpm，30℃混匀21小时。加入2毫升甲醇终止反应，进行HPLC分析。反应液中残留0.01毫克/毫升7-木糖-紫杉醇，并产生0.17毫克/毫升紫杉醇(产率77％)。
HPLC方法
柱：Kromasil ODS(4.6×200mm，5μm)
流动相：60％甲醇/40％水
流速：1毫升/分
柱温：室温
检测波长：227nm
实施例4：7-木糖-巴卡亭III的水解
菌于30℃摇瓶培养，培养基：2％甘油，0.2％酵母浸膏，0.2％胰蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.1％K2HPO4。1毫升菌液接种于100毫升培养基。4天后取出15毫升接种于1升培养基(4升Erlenmeyer培养瓶)中。3天后离心收集细胞，以50mM磷酸钾缓冲液(pH 7)洗涤，再次离心后冷冻保存。
2毫升含0.2mg 7-木糖-巴卡亭III的溶液加入1毫升上述菌液(0.24克细胞湿重)，100rpm混匀24小时。反应液用6毫升CH2Cl2抽提。抽提物干燥后再溶于甲醇中进行HPLC分析。检测到巴卡亭III(产率102％，以初始的7-木糖-紫杉醇浓度计算)。
实施例5：7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭III的水解
细胞准备方法同实施例4。1毫升含1mg 7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭III的溶液加入1毫升菌液(0.24克细胞湿重)，100rpm混匀24小时。反应液用6毫升CH2Cl2抽提。抽提物干燥后再溶于甲醇中进行HPLC分析。检测到10-去乙酰基巴卡亭III(产率100％，以初始的7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭III浓度计算)。
实施例6：7-木糖-10-去乙酰基三尖杉宁碱的水解
细胞准备方法同实施例4。2毫升含0.2mg 7-木糖-10-去乙酰基三尖杉宁碱的溶液加入1毫升菌液(0.24克细胞湿重)，100rpm混匀24小时。反应液用6毫升CH2Cl2抽提。抽提物干燥后再溶于甲醇中进行HPLC分析。检测到10-去乙酰基三尖杉宁碱(产率97％，以初始的7-木糖-10-去乙酰基三尖杉宁碱浓度计算)。
Claims (4)
1.一种可将糖基水解为羟基的微生物，其特征在于：所述微生物为Leifsonia shinshuensis DICP 16，CCTCC No.M 206026。
2.一种权利要求1所述微生物的应用，其特征在于：所述微生物Leifsonia shinshuensis sp.菌株DICP 16或其发酵产生的水解酶，接触含C-7糖基的紫杉烷并水解C-7糖基，使该位置变为羟基。
3.按照权利要求2所述微生物的应用，其特征在于：所述可被上述微生物水解的紫杉烷化合物具有以下结构，
R1是羟基或酰氧基，或者具有分子III的结构；R2是酰氧基或羟基；R3和R4是独立的氢，烷基，链烯基，炔基，环烷基，环链烯基，芳香基或杂环基；“sugar”是指直接键合在C-7位的糖基。
4.按照权利要求2或3所述微生物的应用，其特征在于：所述糖基为木糖基。
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