CN101381708A - 纤维化纤维单胞菌、水解酶及其在紫杉烷转化方面的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了有效转化紫杉烷木糖苷为紫杉醇或其类似物的纤维化纤维单胞菌及其水解酶，并提供了一种新的通过生物转化反应制备紫杉醇及其类似物的有效方法。此方法可以高效、廉价、环保的制备紫杉醇及其类似物，为充分利用紫杉烷资源提供了一条适应工业化生产的有效途径。

Description

纤维化纤维单胞菌、水解酶及其在紫杉烷转化方面的用途
技术领域
本发明属生物化学技术领域，具体涉及一种水解紫杉烷木糖苷的微生物并用其制备紫杉醇及其类似物的方法。
背景技术
紫杉烷是一类二萜化合物，其中紫杉醇(Paclitaxel，式II)和多烯紫杉醇(Docetaxel)，作为临床一线用药而广泛应用于多种肿瘤的治疗。目前，生产紫杉醇的途径主要有：(1)从红豆杉植物中直接提取紫杉醇；(2)半合成法——从红豆杉属植物中提取分离到具有紫杉醇母核结构的化合物，再用化学方法半合成紫杉醇、多烯紫杉醇等。这类具有紫杉醇母核结构的化合物主要包括巴卡亭III以及10-去乙酰巴卡亭III(简写10-DABIII)。
Figure A200710012698D00041
 (式II)
其中Ph是苯基，Ac是乙酰基，Bz是苯甲酰基。
除了上面提到的巴卡亭III以及10DAB，在红豆杉属植物中，还广泛存在另一类具有紫杉醇母核结构的化合物，即C-7木糖基的紫杉烷，如7-木糖紫杉醇(XT)，10-去乙酰-7-木糖紫杉醇(10-DAXT)，10-去乙酰-7-木糖三尖杉宁碱(10-DAXC)，10-去乙酰-7-木糖紫杉醇C(10-DAXTC)，这类化合物可以通过生物或/和化学手段去除木糖基，产生紫杉醇或C-7羟基的紫杉烷化合物，而后者可以作为制备具有抗癌活性紫杉烷的重要中间体，从而达到对红豆杉资源的有效利用。因此，C-7木糖基的去除已成为有效利用这类化合物的关键因素。
目前针对C-7紫杉烷木糖苷糖基的去除方法主要有化学法和生物法。化学法是首先利用高碘酸盐将木糖氧化为半缩醛，然后在酸性条件下将其水解获得C-7羟基的紫杉烷(US5412116，US6028206，US5856532，US6437154)。该方法需要两步反应才能去除C-7位木糖基，导致收率普遍很低(<50％)。此外，由于化学法用到水合肼等剧毒物质，如产业化，会对环境造成严重污染。
而生物法因其对环境友好，越来越引起人们的广泛关注。欧洲专利95300135.1公开了使用Moraxella sp.(莫氏杆菌)、Bacillus macerans(浸麻芽孢杆菌)、Bacillus circulans(环状芽孢杆菌)和Micrococcus sp.(微球菌)水解紫杉烷木糖苷糖基的方法。其中莫氏杆菌的转化能力较强，62.5mg莫氏杆菌(来自于20ml发酵液)可在7小时内将0.5mg7-木糖-10-去乙酰紫杉醇完全转化为10-去乙酰紫杉醇(Biotechnol Appl Biochem 1997，26，153-158)。除此之外，未见其它相关报道
现存技术中的微生物的产酶量普遍偏低，且均为胞内酶，导致水解效率降低，同时菌体容易对底物和产物产生吸附，因此不适合工业生产。
发明内容
本发明的目的是提供了能有效转化紫杉烷木糖苷为紫杉醇或其类似物的纤维化纤维单胞菌及其水解酶，并提供了一种新的通过生物转化反应制备紫杉醇及其类似物的有效方法。
本发明提供了一种水解酶，系由纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobiumcellulans)代谢产生的。
本发明提供的水解酶用于转化C-7紫杉烷木糖苷为紫杉醇或其类似物。
本发明还提供了一种紫杉醇及其类似物的生物转化制备方法：以C-7位紫杉烷木糖苷为原料，用纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobiumcellulans)释放产生的水解酶，进行水解，去除C-7位木糖基，得到紫杉醇或其类似物。
本发明提供的上述紫杉醇及其类似物的生物转化制备方法中，水解的反应条件为：将原料按0.1-2g/L加入所述的水解酶中，温度为20-40度，pH6.0-8.0，反应时间3-48h。
本发明提供了原料C-7紫杉烷木糖苷类化合物具有式I所示结构通式：
                (式I)
其中R1为H或乙酰基；R2和R3相同或者不同，为—T或—OT；其中T为H，芳基，芳烷基，C1至C20的直链、支链或环型烃基，及上述三种烃基的取代物，取代基包括羟基、C1至C8的烷氧基、缩醛、缩酮、卤素、硝基或氨基。
本发明提供了紫杉烷木糖苷类化合物的原料，是天然产物来源的在C-7位含有木糖基的紫杉烷类化合物的单体或其混合物，或者经由生物合成，化学半合成或全合成手段获得的在上述位置含有木糖基的紫杉烷。
本发明提供的紫杉醇及其类似物的生物转化制备方法中，所述的水解酶在游离状态下使用，或者将其用物理吸附或诱捕方法固定在支持物上使用。
本发明提供了一种纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)XZ-5 CCTCC No.M 207130新菌种。
为了实现本发明的目的，发明人对多个地区的土壤微生物转化活性进行了筛选，发现纤维化纤维单胞菌都能产生分泌型木糖苷酶，水解紫杉烷木糖苷，得到紫杉醇及其类似物。但是从浙江义乌地区红豆杉根部土壤中获得的纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)XZ-5 CCTCC No.M 207130新菌株的生物转化活性最强，它能够高水平产生分泌型木糖苷酶，对紫杉烷木糖苷进行水解，得到紫杉醇及其类似物。
本发明所涉及的纤维化纤维单胞菌，如CCTCC M207130，AS1.2019，AS1.1938，AS1.1920，ACCC0101，其特征在于：生长周期的初期产生菌丝体，后期破碎；培养基耗尽后，棒状菌体转化成短杆甚至球形细胞；在蛋白胨酵母提取物-葡萄糖琼脂平板上，菌落为圆形，直径0.9～5.0mm，黄白色突起，反光，边缘整齐。下列物质均可以作为唯一碳源：葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、D-木糖、甘油、纤维二糖、乳糖、L-乳酸盐、醋酸盐、丙酮酸盐、丙酸盐、戊酸盐、脯氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、组氨酸。而蜜三糖、DL-苹果酸和D-乳酸盐不能作为唯一碳源；触酶阳性；肽聚糖中含L-赖氨酸，内肽桥由D-Ser←D-Asp，type A4α组成；细胞壁的主要糖组分为鼠李糖，而岩藻糖和半乳糖是次要成分；主要甲基萘醌为MK-9(H4)，而MK-9(H2)、MK-8(H4)和MK-7(H4)是次要组分；基因组DNA的G-C含量为74mol％。
本发明所涉及的纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)XZ-5，此菌株已于2007年8月保藏在武汉中国微生物典藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 207130。
生物学纯的微生物纤维化纤维单胞菌，是新发现的产β-木糖苷酶的微生物。这种微生物的突变体，例如经化学的、物理的(如紫外辐射)或生物学方法(如分子生物学技术)改造以用于水解反应的突变菌株，也在本发明的考虑范围内。
本发明应用的酶是水解酶，尤其是木糖苷酶。本发明提供的微生物产生上述酶，可用提取和纯化的方法分离它们。本发明提供的微生物经遗传工程改良后的形式也在本发明考虑范围内。宿主细胞可以是任何细胞，如大肠杆菌，将本发明提供的微生物的一个基因或一组基因转入宿主，使其表达催化水解反应所需的一个酶或多个酶。
本发明所涉及到的原料为具有式I所示结构通式的紫杉烷木糖苷类化合物：
Figure A200710012698D00081
　　　　　　　　式I
其中R1为H或乙酰基；R2和R3相同或者不同，为—T或—OT；其中T为H，芳基，芳烷基，C1至C20的直链、支链或环型烃基，及上述三种烃基的取代物，取代基包括羟基、C1至C8的烷氧基、缩醛、缩酮、卤素、硝基或氨基。
特别之处在于，紫杉烷木糖苷类化合物既可以是天然产物，也可以经由生物合成，或者化学半合成或全合成手段获得的在C-7位含有木糖基的紫杉烷，如7-木糖紫杉醇，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，7-木糖巴卡亭III，7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III，7-木糖三尖杉宁碱，7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱，7-木糖紫杉醇C或7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C以及7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III等等。
本发明提供的水解方法已考虑到具有分子结构I的化合物的手性中心的所有立体构型，这些立体异构体或者单独被水解，或者与其它立体异构体混合在一起被水解。
本发明提供的方法使得被水解紫杉烷的C-7基团的立体构型优先保留于产品中。C-7取代基的绝对立体构型与紫杉醇C-7羟基的绝对立体构型相同。
本发明提供的水解方法可以在微生物发酵后进行(两阶段发酵和水解)，也可以与发酵同时进行(单阶段原位发酵和水解)，或将酶固定到固体支持物上(如阴离子交换剂)，再进行水解反应。
用本发明提供的方法产率超过90％，可特异性选择C-7位进行水解。
根据水解产物的特征，可以通过单独使用或适宜地联合使用以下方法进行纯化：如有机溶剂萃取法、吸附—解吸法、沉淀法、重结晶法等。例如，使用乙酸乙酯将水解产物从反应液中萃取出来，在减压条件下浓缩所得的有机层，将所得的浓缩物吸附在硅胶柱上，然后使用氯仿-甲醇、己烷-乙酸乙酯或己烷-丙酮的混合溶剂体系进行色谱层析。此外，如有需要，还可以将含有水解产物的部分从诸如乙酸乙酯或甲醇的有机溶剂中结晶出来。
本发明所述的方法，可以高效、廉价、环保的制备紫杉醇及其类似物，为充分利用紫杉烷资源提供了一条适应工业化生产的有效途径。
具体实施方式
下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。
实施例1：纤维化纤维单胞菌CCTCC No.M 207130水解7-木糖紫杉醇
使用含1％甘油，0.2％蛋白胨，0.2％酵母提取物，0.2％磷酸氢二钾的培养基(灭菌前pH7.0)作为种子培养基。
将上述种子培养基20ml分配到100ml锥形瓶中，在120度下灭菌15min，将1接种环的纤维化纤维单胞菌XZ-5菌株的琼脂斜面培养物接种到其中，并在30度下振荡培养2天作为种子液。
500ml Erlenmeyer培养瓶中放入100ml含1％淀粉，0.2％酵母浸膏，0.2％氯化铵，0.1％ NaH2PO4和0.1％ Na2HPO4的培养基，pH7，高压灭菌121度30min。将1ml种子液接种于此培养基，150rpm，30℃摇瓶培养5天。离心收集上清液，即为粗酶液。
在0.9ml粗酶液中加入1ml 50mM磷酸钾缓冲液(pH7)，再加入0.1ml7-木糖-紫杉醇的甲醇溶液(浓度为5mg/ml)。100rpm，30℃混匀5小时。加入2ml甲醇终止反应，15000转/分离心2分钟取上清液进行HPLC分析。反应液中无7-木糖-紫杉醇残留，并产生0.42mg紫杉醇(产率94％)。HPLC方法：
色谱柱：Kromasil ODS(4.6×200mm，5μm)
流动相：甲醇:水(60：40)
流速：1ml/min
柱温：室温
检测波长：227nm
实施例2：纤维化纤维单胞菌CCTCC No.M 207130水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇及产物的纯化
将10ml7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的甲醇溶液(浓度为5mg/ml)加入到90ml实施例1所述的粗酶液中，50rpm，30℃下反应20小时后，加入20ml乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并上层有机相，减压蒸干，获得固体物质105mg，上硅胶柱(20g)并用氯仿:甲醇(98:2)进行洗脱，得到40mg10-去乙酰紫杉醇(产率91％)。
实施例3：纤维化纤维单胞菌CCTCC No.M 207130水解混合紫杉烷木糖苷及产物的提纯
2000ml Erlenmeyer培养瓶中放入500ml含1％桦木木聚糖，0.5％尿素，0.2％KH2PO4和0.1％K2HPO4的培养基，pH7，高压灭菌30min。将10ml实施例1所述的种子液接种于此培养基，200rpm，30℃摇瓶培养2天。离心收集上清液，-20度冷冻保存待用。将200ml含有7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C的混合物(从天然红豆杉提取物中分离，含量分别为65％，9.9％，3.3％)的甲醇溶液(5mg/ml)加入到2000ml如前所述的粗酶液中，50rpm，35℃下反应8小时。反应液用乙酸乙酯萃取三次，每次200ml，合并有机相蒸干溶解于100ml甲醇中，用上述HPLC方法进行定量检测，发现其中无三种带木糖基的底物残留，得到的产物中10-去乙酰紫杉醇，10-去乙酰三尖杉宁碱，10-去乙酰紫杉醇C的含量分别503mg，77mg，26mg，回收率达到90％。
实施例4：纤维化纤维单胞菌CCTCC No.M 207130固定化酶水解混合紫杉烷木糖苷
将1L如实施例1所述的粗酶液加入到100ml经预先处理过的DE52阴离子交换填料中，充分混合后，离心弃上清液，再用50mM磷酸钾缓冲液(pH7)洗涤填料，再次离心，将沉淀重新悬浮在200ml上述磷酸缓冲液中，即为固定化酶。向其中加入20ml如实施例3所述的紫杉烷木糖苷的混合物，12rpm，28℃反应2小时。5000转/分离心5分钟取上清液，用乙酸乙酯萃取三次，每次20ml，合并有机相蒸干溶解于10ml甲醇中，用上述HPLC方法进行定量检测，发现其中无三种带木糖基的底物残留，产物中10-去乙酰紫杉醇，10-去乙酰三尖杉宁碱，10-去乙酰紫杉醇C的含量分别51.5mg，7.9mg，2.6mg，回收率达到92％。
实施例5：纤维化纤维单胞菌AS1.1920水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇
将1接种环的纤维化纤维单胞菌AS1.1920的琼脂斜面培养物接种到20ml实施例1所述的种子培养基中，并在30度下振荡培养2天作为种子液。
500ml Erlenmeyer培养瓶中放入100ml含1％麸皮，0.5％硝酸钾，0.1％NaH2PO4和0.1％ Na2HPO4的培养基，pH7，高压灭菌121度30min。将1ml种子液接种于此培养基，150rpm，30℃摇瓶培养5天。离心收集上清液，即为粗酶液。
在9ml上清液中加入10ml 50mM磷酸钾缓冲液(pH7)，再加入1ml7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的甲醇溶液(浓度为5mg/ml)。100rpm，30℃混匀8小时。加入20ml甲醇终止反应，15000转/分离心2分钟取上清液进行HPLC分析。反应液中无7-木糖-10-去乙酰紫杉醇残留，并产生4.2mg 10-去乙酰紫杉醇(产率98％)。
实施例6：纤维化纤维单胞菌AS1.1938水解混合紫杉烷木糖苷
将1接种环的纤维化纤维单胞菌AS1.1938的琼脂斜面培养物接种到20ml实施例1所述的种子培养基中，并在30度下振荡培养2天作为种子液。
500ml Erlenmeyer培养瓶中放入100ml含1％桦木木聚糖，0.2％酵母浸膏，0.2％氯化铵，0.1％ NaH2PO4和0.1％ Na2HPO4的培养基，pH6，高压灭菌121度30min。将1ml种子液接种于此培养基，150rpm，30℃摇瓶培养5天。离心收集上清液，即为粗酶液。
将10ml含有7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C的混合物的甲醇溶液(5mg/ml)加入到100ml如前所述的粗酶液中，50rpm，35℃下反应8小时。反应液中加入100ml甲醇溶液，进行HPLC检测，发现其中无三种带木糖基的底物残留，分别产生25mg 10-去乙酰紫杉醇，38mg 10-去乙酰三尖杉宁碱，13mg 10-去乙酰紫杉醇C，回收率达到90％。
实施例7：纤维化纤维单胞菌AS1.2019水解7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III
将1接种环的纤维化纤维单胞菌AS1.2019的琼脂斜面培养物接种到20ml实施例1所述的种子培养基中，并在30度下振荡培养2天作为种子液。
500ml Erlenmeyer培养瓶中放入100ml含1％麸皮，0.4％酵母浸膏，0.1％ NaH2PO4和0.1％ Na2HPO4的培养基，pH8，高压灭菌121度30min。将1ml种子液接种于此培养基，150rpm，30℃摇瓶培养5天。离心收集上清液，即为粗酶液。
0.05ml含0.5mg7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III的溶液加入0.9ml粗酶液和1ml50mM磷酸钾缓冲液(pH7)中，80rpm，30℃下反应10小时。加入2ml甲醇终止反应，离心后取上清液进行HPLC分析。检测到10-去乙酰巴卡亭III 0.39mg(产率98％)。
实施例8：纤维化纤维单胞菌ACCC01019水解7-木糖紫杉醇
将1接种环的纤维化纤维单胞菌ACCC01019的琼脂斜面培养物接种到20ml实施例1所述的种子培养基中，并在30度下振荡培养2天作为种子液。
500ml Erlenmeyer培养瓶中放入100ml含1％桦木木聚糖，0.2％酵母浸膏，0.2％氯化铵，0.1％ NaH2PO4和0.1％ Na2HPO4的培养基，pH7，高压灭菌121度30min。将1ml种子液接种于此培养基，150rpm，30℃摇瓶培养5天。离心收集上清液，即为粗酶液。
在0.9ml上清液中加入1ml 50mM磷酸钾缓冲液(pH7)，再加入0.1ml7-木糖-紫杉醇的甲醇溶液(浓度为5mg/ml)。100rpm，30℃混匀7小时。加入2ml甲醇终止反应，15000转/分离心2分钟取上清液进行HPLC分析。反应液中无7-木糖-紫杉醇残留，并产生0.42mg紫杉醇(产率94％)。

Claims (8)

1、一种水解酶，系由纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)代谢产生的。
2、权利要求1所述水解酶用于转化C-7紫杉烷木糖苷为紫杉醇或其类似物。
3、一种紫杉醇及其类似物的生物转化制备方法，其特征在于：以C-7位紫杉烷木糖苷为原料，用纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobiumcellulans)释放产生的水解酶，进行水解，去除C-7位木糖基，得到紫杉醇或其类似物。
4、按照权利要求3紫杉醇及其类似物的生物转化制备方法，其特征在于水解的反应条件为：将原料按0.1-2g/L加入所述的水解酶中，温度为20-40度，pH6.0-8.0，反应时间3-48h。
5、按照权利要求3所述紫杉醇及其类似物的生物转化制备方法，其特征在于：所述C-7紫杉烷木糖苷类化合物具有式I所示结构通式：
Figure A200710012698C00021
                 (式I)
其中R1为H或乙酰基；R2和R3相同或者不同，为一T或一OT；其中T为H，芳基，芳烷基，C1至C20的直链、支链或环型烃基，及上述三种烃基的取代物，取代基包括羟基、C1至C8的烷氧基、缩醛、缩酮、卤素、硝基或氨基。
6、按照权利要求3紫杉醇及其类似物的生物转化制备方法，其特征在于：所述紫杉烷木糖苷类化合物原料，是天然产物来源的在C-7位含有木糖基的紫杉烷类化合物的单体或其混合物，或者经由生物合成，化学半合成或全合成手段获得的在上述位置含有木糖基的紫杉烷。
7、按照权利要求3紫杉醇及其类似物的生物转化制备方法，其特征在于：所述的水解酶在游离状态下使用，或者将其用物理吸附或诱捕方法固定在支持物上使用。
8、一种纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)XZ-5CCTCCNo.M207130。
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