CN103451242A

CN103451242A - 一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法

Info

Publication number: CN103451242A
Application number: CN201310311859XA
Authority: CN
Inventors: 陆群; 冯海婷; 周傲群; 李正龙
Original assignee: Southwest Jiaotong University
Current assignee: Southwest Jiaotong University
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2013-12-18

Abstract

本发明公开了本发明是有关治疗骨质疏松症的药物1-α-羟基维生素D₂或D₃，即阿法骨化醇（paricalcitol）和度骨化醇（Doxercalciferol）的一种新的工业制备方法。采用假诺卡菌CGMCC No.5098对维生素D的1位进行微生物转化，一步直接得到1-α-羟基维生素D。本发明方法比化学法温和，无须保护和使用有毒的二氧化硒进行氧化，而且具有区域选择性，不需要进行基团保护，生物转化收率高达40-50%，环境友好，通过一步转化反应，大大缩短工艺路线，提高收率，降低制造成本，将已知的合成阿法骨化醇和度骨化醇的6步左右的化学反应缩短为一步，总收率提高到40-50%。

Description

一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法

技术领域

本发明涉及化学及生物制药，尤其是治疗骨质疏松症的药物1-α-羟基维生素D₂或D₃，即阿法骨化醇（paricalcitol）和度骨化醇（Doxercalciferol）制备技术领域。

背景技术

阿法骨化醇（paricalcitol）和度骨化醇（Doxercalciferol）活性维生素药物，临床上用于骨质疏松症及各种原因造成的佝偻病、骨软化症。

1-α-羟基维生素D类药物主要被用来治疗骨质疏松症和慢性肾衰竭等其他疾病。目前主要采用化学合成方法来生产制造。采用维生素D的1-α-位进行化学直接羟基化，是非常困难的，产率非常低。1-α-羟基维生素D的已知合成大多采用化学合成法，主要采用维生素D作为原料，经过酯化保护、环和、氧化、开环、纯化等多步反应生成。化学合成需进行多步的基团保护和脱保护，运用光照反应，开环和异构化，步骤繁多，分离纯化复杂。在生产上操作复杂，收率偏低，在10%左右。

发明内容

鉴于现有技术的以上不足，本发明的目的是提供一种制备1-α-羟基维生素D₂或D₃，即阿法骨化醇（paricalcitol）和度骨化醇（Doxercalciferol），使之具有生产工序简化、收率高、环境友好且制造成本低的优点。

本发明的目的是通过如下手段来实现的。

一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法，采用假诺卡菌CGMCC No.5098对维生素D的1位进行微生物转化，一步直接得到1-α-羟基维生素D:

培养基在发酵培养3天时,将维生素D作为底物与环糊精及复合溶剂混合溶解后加入到培养液中，底物浓度1-15g/升，环糊精与维生素D的比例为5：1到2：1；继续上述培养过程中产生1位的羟基化物，转化的时间1-10天；最后经过滤，浓缩，硅胶柱分离后得到目标1α位羟基化产物。

本发明是采用假诺卡菌CGMCC No.5098对维生素D的1位进行微生物转化，一步直接得到1-α-羟基维生素D₂或D₃。比化学法温和，无须保护和使用有毒的二氧化硒进行氧化，而且具有区域选择性，不需要进行基团保护，生物转化收率高达40-50%，环境友好，通过一步转化反应，大大缩短工艺路线，提高收率，降低制造成本，将已知的合成阿法骨化醇和度骨化醇的6步左右的化学反应缩短为1步，总收率提高到40-50%。生物转化法能够进行某些化学方法难于进行或不能合成的反应，转化条件温和，操作简单。

本发明直接在维生素D的1α-位引入羟基，解决了有机合成难以实现的问题，在短时间内直接引入羟基生成活性产物。本发明所利用的菌种为放线菌，假诺卡菌CGMMC No.5098，通过控制转化条件，微生物产生的细胞色素P450酶可直接对底物维生素D的1-α位羟基化，具有产物立体选择性高，收率高等特点。本发明也为解决阿法骨化醇和度骨化醇的工业制备提供一条新的工艺路线，缩短了工艺路线，提高了收率，降低制造成本。

附图说明

图1为本发明方法的工艺路线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的实施作进一步的描述。

本发明的技术方案路线见图1，虽然仅给出反应物维生素D₂制备目标产物为1-α-羟基维生素D₂的反应式，但反应物维生素D₃制备目标产物为1-α-羟基维生素D₃的反应式是完全对等的。

所用菌株不同于日本专利JP2005323618所用无枝酸菌属Amycolata菌株,是发明人从四川二峨山采取的土样中分离得到一株菌SWJTUQL-3721021，经鉴定菌株属于假诺卡氏菌类放线菌，定名为假诺卡氏菌SWJTUQL-3721021（Pseudonocardia autotrophicaSWJTUQL-3721021），保藏编号为CGMCC No.5098。

本发明工艺涉及用菌株CGMCC No.5098在通气、搅拌、碳源、氮源、矿物盐的培养基中对维生素D进行生物转化，得到1-羟基维生素D。

转化培养可在通气的摇瓶或发酵罐中进行，营养物质包括无机盐、氮源、糖或其它可溶性物质作为碳源，无机盐包括碱金属、碱土金属如镁、铁、锌、锰的氯化物、硝酸盐、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐，最好是MgSO4，KH₂PO4。氮源可以是铵盐，包括柠檬酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乙酸盐等；氨基酸及混合物，肽或蛋白质及其水解物，肉提取物、谷物如玉米、小麦的水溶性提取物；玉米麦芽提取物、玉米浸渍液、豆粕粉、花生粉、鹰豆粉、棉籽粉。碳源可以是葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、山梨糖、甘露糖、乳糖等等。无论固体培养还是深层培养均在通气条件下进行，发酵温度22-30℃，最好是27℃，pH范围6.5-7.5，最好是7.0。

本发明过程很容易进行，将维生素D₂或D₃等作为底物和γ或β-环糊精混合后加入到培养液中，底物浓度无特殊要求，最好是1-15g/升，环糊精与维生素D的比例为5：1到2：1，最好为3：1，继续上述的培养的过程中产生1位的羟基化物，转化的时间取决于培养基的组成和菌株，通常继续培养1-10天，最好是4天。

底物加入培养基的时间非常重要，通常是在发酵培养3天时，加入底物最佳，也可通过测定碳源中糖的浓度来控制，通常是降到0.05-0.002%。

底物的加入形式是原药固体溶于有机溶剂和表面活性剂组成的复合溶剂中，有机溶剂是如乙醇等低碳数的醇类有机溶剂，表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸非离子型表面活性酯，比如Triton X-100，Triton X-114等。表面活性的用量相对于培养基体积比（g/L)为0.1-1克/升.

本发明使用了环糊精，可以包括β-环糊精，γ-环糊精。此外环糊精衍生物，羟丙基-β-环糊精，糖基-β-环糊精和或甲基化环糊精。其中，最好甲基化环糊精。在这里，甲基环糊精，是完全甲基化β-环糊精或部分甲基化β-环糊精。在本发明，它是一个或多个这些甲基化环糊精之间的任何选择，最好是2,6-二甲基-β-环糊精。助溶剂如环糊精等的添加更有助于底物在培养液里的溶解，有助于提高转化率，相对于发酵培养液，用量为0.5~5克/升。为保持微生物的好氧条件，摇床培养时转速设置为200rpm。

转化产物采用过滤，对菌丝体用有机溶剂如有机氯代烷烃、酯类、芳香烷烃等如二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯等萃取、浓缩；滤液用非极性大孔树脂如101树脂等吸附，用前述的有机溶剂如乙醇、丙酮解吸附，浓缩得粗品，再经硅胶柱层析，有机溶剂正己烷、石油醚等和乙酯梯度或2：1作为洗脱剂，分离纯化得到纯的1αOH)VD。

实施例一

500ml摇瓶装100毫升培养液，1.5﹪葡萄糖，1.5﹪黄豆饼粉，0.5﹪玉米浆，0.5﹪NaCl，0.2﹪CaCO3，pH7.0。将培养基121℃，灭菌30min。接入菌株CGMCC No.5098的孢子悬液2毫升，27℃旋转振荡培养，转速240rpm，培养4天，50mg维生素D₃和10毫克的β-环糊精、10mgTriton X-100溶解于2mL乙醇，将此混合物加入培养液里，继续培养3天，过滤，滤液用乙酸乙酯2×50mL萃取，提取液浓缩，用硅胶柱[柱层析硅胶，乙酸乙酯：石油醚（1：2）]分离，得到1α位羟基化产物阿法骨化醇25mg，收率50%。

U V：λmax=265nm,λmin=211n m，¹H NMR（400MHz，DMSO)6.38(1H,d)，6.02(1H,d),5.33(1H,s)，5.01(1H，s)，4.444(1H,m)，4.23(1H，m)，2.82(1H,m),2.60(1H,m)，2.32(1H,m)，0.92(3H,d)，0.87(6H,m)。m/z:400[M]⁺。

实施例二

液体培养基配方：1.5﹪葡萄糖，1.5﹪黄豆饼粉，0.5﹪玉米浆，0.7%酵母膏，0.5﹪NaCl，0.2﹪CaCO3，pH自然。将培养基121℃，灭菌30min。把菌种接种在100mL的上述液体培养基中，在28℃，200rpm，摇床培养60h，将底物VD₂340mg用5ml无水乙醇溶解，加入1克的甲基化β-环糊精、100mgTriton X-100和5mlw无菌水，溶解混匀，加入发酵液中。继续培养72h。发酵液的提取：100mL发酵液中加入30ml丙酮，再加50mL乙酸乙酯，充分摇匀，静置，取上层清液，浓缩，进行层析，乙酸乙酯/石油醚=1/2，得到1α位羟基化产物度骨化醇140mg，收率约40%。

U V：λmax=265nm,λmin=211nm，MS(EI)(m/z):412(M⁺),¹H NMR（400MHz，CDCl₃)δ0.57(s,3H),0.76-0.91(m,9H),4.25(m,1H),4.45(m,1H),5.02(s,1H),5.21(m,2H,),5134(s,1H),6.03(d,1H),6.39(d,1H)。

实施例三

250ml摇瓶装50毫升培养液，1.5﹪葡萄糖，1.5﹪黄豆饼粉，0.5﹪玉米浆，0.5﹪NaCl，0.2﹪CaCO3，pH7.0。将培养基121℃，灭菌30min。接入菌株CGMCC No.5098菌落，27℃旋转振荡培养，转速200rpm，培养3天，30mg维生素D₂和10毫克的β-环糊精及5毫克γ-环糊精、5mgTriton X-100溶解于2mL乙醇和1m无菌水的混合溶剂中，将此混合物加入培养液里，继续培养3天，过滤，滤液用乙酸乙酯2×50mL萃取，提取液浓缩，用硅胶柱[柱层析硅胶，乙酸乙酯：石油醚（1：2）]分离，得到1α位羟基化产物度骨化醇10mg，收率33%。

实施例四

500ml摇瓶装100毫升培养液，1.5﹪葡萄糖，1.5%蛋白胨，1.5﹪黄豆饼粉，0.5﹪玉米浆，0.5﹪NaCl，0.2﹪CaCO₃，pH7.0。将培养基121℃，灭菌30min。接入菌株CGMCC No.5098菌落，27℃旋转振荡培养，转速240rpm，培养4天，100mg维生素D₃和300毫克的部分甲基化β-环糊精、100mgTriton X-100溶解于5mL乙醇和2毫升无菌水组成的混合液中，将此混合物加入培养液里，继续培养3天，过滤，滤液用乙酸乙酯2×50mL萃取，提取液浓缩，用硅胶柱[柱层析硅胶，乙酸乙酯：石油醚（1：2）]分离，得到1α位羟基化产物阿法骨化醇57mg，收率57%。

本发明为阿法骨化醇和度骨化醇的工业制备提供了一条新的工艺路线，提供了一种维生素D的1-α位直接羟基化的生物转化方法，将将已知的合成阿法骨化醇和度骨化醇的6步左右的化学反应缩短为一步，总收率提高到40-50%。工艺操作简便，降低制造成本，革除了剧毒试剂，环境友好。

Claims

1.一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法，采用假诺卡菌CGMCC No.5098对维生素D的1位进行微生物转化，一步直接得到1-α-羟基维生素D:

2.根据权利要求1所述的一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述反应物维生素D可为维生素D₂或维生素D₃；相应目标产物为1-α-羟基维生素D₂或1-α-羟基维生素D₃。

3.根据权利要求1所述的一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述溶解维生素D底物的复合溶剂由聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸非离子型表面活性酯和乙醇构成。

4.根据权利要求1所述的一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述环糊精采用β-环糊精或/和γ-环糊精。

5.根据权利要求1所述的一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法，其特征在于，环糊精与维生素D的比例为最好为3：1。

6.根据权利要求1所述的一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法，其特征在于，培养过程中产生1位的羟基化物的转化的时间最好是4天。

7.根据权利要求4所述的一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述环糊精采用2,6-二甲基-β-环糊精。