CN110396058B - 一种新型骨化二醇（25-羟基维生素d3）分离纯化方法 - Google Patents

一种新型骨化二醇（25-羟基维生素d3）分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型骨化二醇（25‑羟基维生素D3）分离纯化方法，主要包括以下步骤：利用有机溶剂对骨化二醇进行萃取分离，萃取液浓缩，重溶，制备骨化二醇的上柱原液，利用凝胶层析柱，初步纯化骨化二醇产品，进一步利用大孔吸附树脂对骨化二醇产品进行纯化分离，最后结合硅胶柱层析纯化，制备高纯度骨化二醇产品，上柱洗脱液经浓缩，结晶，得到骨化二醇结晶产品。本发明具备以下优点：1、利用该工艺分离纯化的骨化二醇产品纯度高，收率高。2、本专利首次将凝胶柱层析及大孔树脂吸附层析应用于骨化二醇产品的分离纯化中。3、该分离纯化工艺简单，操作方便，可以进行多次循环操作，设备成本低，极利于工业化推广。4、本工艺中采用的有机溶剂均可回收重复利用，降低生产成本，经济环保。

Description

一种新型骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种新型骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法。
背景技术
骨化二醇，又称为25-羟基维生素D3[25(OH)VD3]，是维生素D3的一种生物活性衍生物，维生素D3在人体内没有活性，必须通过生物酶转化成有活性的生物成分才能发挥作用。动物实验表明，骨化二醇对骨质疏松症、佝偻病、骨软化症等代谢性骨病有明显效果，同时还可用于治疗血液透析所致的低血钙症。还可作为保健食品原料及饲料添加剂使用，在保健食品，医药领域及饲料添加剂等方面有着广泛的应用。
骨化二醇可以利用化学法合成，但化学合成法存在反应步骤多、转化率低、且分离纯化过程复杂等缺点，不利于大规模的工业化生产。近年来，随着产酶菌株的筛选及基因工程菌的开发，使微生物转化维生素D3生产骨化二醇成为研究热点，微生物转化法生产骨化二醇具有生产成本低，反应特异性高，反应条件温和，环境友好等优点，是未来生产骨化二醇的研究重点。
目前对骨化二醇的生物转化多集中于产酶菌种的筛选、发酵产酶条件优化及酶转化工艺的研究，如：专利CN 103898004 B 假诺卡氏菌及其发酵法生产骨化二醇的方法和专利CN 201210112509.6 一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法中，都提到了一种微生物转化法生产骨化二醇的方法，主要是提出了几种产羟基化酶的菌种以及发酵产酶方法和酶催化方法，但是对骨化二醇的提取纯化工艺阐述较少。曾志刚等在论文“放线菌SIIA243对维生素D3羟基化研究”中提到，可利用硅胶柱及制备色谱纯化骨化二醇工艺，但该方法由于设备成本造价高，操作复杂，不可批量生产，所以仅适用于实验室中分析检测产品成分，较难进行工业化放大生产。
发明内容
鉴于上述问题，本专利提供了一种新型骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法，
该工艺提取骨化二醇产品纯度高，条件温和，处理能力强，有机溶剂可回收利用，更有利于工业化生产提取骨化二醇。
本发明是通过以下技术方法实现的：
（1）、以微生物酶催化维生素D3生成骨化二醇（25-羟基维生素D3）转化液为提取原液，加入有机溶剂A，震荡后静置萃取，收集上层有机溶剂，获得骨化二醇提取物a。
（2）、将骨化二醇提物a浓缩至膏状，回收有机溶剂A，用有机溶剂B对浓缩物进行重溶，获得骨化二醇上柱溶液b。
（3）、将骨化二醇上柱溶液b通过凝胶层析柱处理，用有机溶剂C对凝胶层析柱进行洗脱，收集洗脱液，得到骨化二醇提取物c。
（4）、将骨化二醇提取物c浓缩至膏状，回收有机溶剂C，用有机溶剂D对浓缩物进行重溶，获得骨化二醇上柱溶液d。
（5）、将骨化二醇上柱溶液d通过大孔吸附树脂吸附分离，用有机溶剂E对大孔吸附树脂柱进行冲洗，再用有机溶剂F进行洗脱，收集洗脱液，得到骨化二醇提取物e。
（6）、将骨化二醇提取物e浓缩至膏状，回收有机溶剂F，用有机溶剂G对浓缩物进行重溶，获得骨化二醇上柱溶液f。
（7）、将骨化二醇上柱溶液f通过硅胶柱层析纯化，用有机溶剂H对硅胶柱进行洗脱，收集洗脱液，得到骨化二醇提取物g。
（8）、将骨化二醇提取物g，进行减压浓缩，收集有机溶剂H，对浓缩液进行高温或者低温结晶处理，得到骨化二醇晶体物质i。
步骤（1）中，所述微生物酶催化维生素D3生成骨化二醇（25-羟基维生素D3）转化液，包括全细胞催化、酶液催化等方法得到的转化液，所述有机溶剂A包括，乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、石油醚等一种或者多种有机溶剂，有机溶剂萃取体积比为1:3~1:5，萃取采用常温震荡萃取，萃取时间1h~5h。
步骤（2）中，所述有机溶剂B包括，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮等一种或者多种有机溶剂。
步骤（3）中，所述凝胶层析包括琼脂糖凝胶过滤层析和葡聚糖凝胶过滤层析中的一种，层析分子量为300Da~800Da，上柱条件为：上样浓度0.5mg/L~2mg/L，上样流速1BV/h ~3BV/h。以1BV~5BV的有机溶剂C作为洗脱溶液，以1BV/h~3BV/h上样流速对其进行洗脱，所述有机溶剂C包括，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮等一种或者多种有机溶剂。
步骤（4）中，所述有机溶剂D包括，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮等一种或者多种有机溶剂。
步骤（5）中，所述大孔吸附树脂包括极性和中极性层析介质中的一种，上柱条件为：上样浓度0.5mg/L~2 mg/L，上样流速1BV/h~3BV/h。所述有机溶剂E、F包括，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮等一种或者多种有机溶剂。
步骤（6）中，所述有机溶剂G包括，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮等一种或者多种有机溶剂。
步骤（7）中，所述硅胶柱层析硅胶粒径10um~80um，上样浓度0.5mg/L~2mg/L，上样流速1BV/h~3BV/h。
步骤（8）中，所述减压浓缩，浓缩温度为40℃~99℃，浓缩压力小于-0.08MPa，所述有机溶剂G包括，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮等一种或者多种有机溶剂。
本发明的优点在于：
1、本发明提供了一种新型骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法，该工艺获得的产品纯度高，回收率高，最重要的是，采用的分离纯化方法操作简单，设备成本低，可重复性操作强，极利于工业化推广。
2、分离纯化工艺条件温和，处理量大，较之现行工艺，可以大批量得到高纯度的骨化二醇产品。
3、工艺中所采用的有机溶剂全部可以回收利用，经济环保，污染小。
附图说明：
图1为本发明工艺技术路线示意图。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
参考附图1，本发提供了以下实施例：
实施例1：
（1）、在微生物酶催化维生素D3生成骨化二醇（25-羟基维生素D3）转化液中，按照体积比1:1加入乙酸乙酯，震荡萃取1h，收集上层有机溶剂，得到骨化二醇提取液a。
（2）、将上述骨化二醇提取液a，经过减压浓缩，回收乙酸乙酯，用甲醇重新溶解浓缩物，调整骨化二醇浓度在0.5mg/L，得到上柱溶液b。
（3）、琼脂糖凝胶过滤层析经活化后，采用湿法装柱，将上柱溶液b以2BV/h的流速通过琼脂糖凝胶过滤层析柱，选用层析分子量为400Da，以1BV的乙酸乙酯做为洗脱液，以2BV/h的流速对其进行洗脱，收集洗脱液，在60℃，压力-0.08MPa条件下，减压浓缩，干燥，得到纯度32.1%的骨化二醇产品。
实施例2：
（1）、在微生物酶催化维生素D3生成骨化二醇（25-羟基维生素D3）转化液中，按照体积比1:2加入己酸乙酯，震荡萃取0.5h，收集上层有机溶剂，得到骨化二醇提取液a。
（2）、将上述骨化二醇提取液a，经过减压浓缩，回收己酸乙酯，用甲醇重新溶解浓缩物，调整骨化二醇浓度在0.8mg/L，得到上柱溶液b。
（3）、葡聚糖糖凝胶过滤层析经活化后，采用湿法装柱，将上柱溶液b以2BV/h的流速通过葡聚糖凝胶过滤层析柱，选用层析分子量为500Da，以1BV的乙酸乙酯做为洗脱液，以2BV/h的流速对其进行洗脱，收集洗脱液。
（4）、上述洗脱液经减压浓缩，回收乙酸乙酯，再用甲醇:石油醚为1:3的溶液对浓缩物进行重新溶解，调整骨化二醇浓度在0.5mg/L，得到上柱溶液c。
（5）、大孔吸附树脂经乙醇溶液活化后，采用湿法装柱，将上柱溶液c以2BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱，以0.5BV的甲醇:石油醚为1:3的溶液做为冲洗液，以2BV/h的流速冲洗大孔吸附树脂柱，以0.5BV的石油醚做为洗脱液，以2BV/h的流速对其进行洗脱，收集洗脱液，在60℃，压力-0.08MPa条件下减压浓缩，干燥，得到纯度52.4%的骨化二醇产品。
实施例3
（1）、在微生物酶催化维生素D3生成骨化二醇（25-羟基维生素D3）转化液中，按照体积比1:5加入石油醚，震荡萃取0.5h，收集上层有机溶剂，得到骨化二醇提取液a。
（2）、将上述骨化二醇提取液a，经过减压浓缩，回收石油醚，用甲醇重新溶解浓缩物，调整骨化二醇浓度在1mg/L，得到上柱溶液b。
（3）、琼脂糖凝胶过滤层析经活化后，采用湿法装柱，将上柱溶液b以2BV/h的流速通过琼脂糖凝胶过滤层析柱，选用层析分子量为700Da，以1BV的乙酸乙酯做为洗脱液，以2BV/h的流速对其进行洗脱，收集洗脱液。
（4）、上述洗脱液经减压浓缩，回收乙酸乙酯，再用甲醇:石油醚为1:5的溶液对浓缩物进行重新溶解，调整骨化二醇浓度在0.5mg/L，得到上柱溶液c。
（5）、大孔吸附树脂经乙醇溶液活化后，采用湿法装柱，将上柱溶液c以2BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱，以0.5BV甲醇:石油醚为1:5的溶液做为冲洗液，以2BV/h的流速冲洗大孔吸附树脂柱，以0.5BV的石油醚做为洗脱液，以2BV/h的流速对其进行洗脱，收集洗脱液。
（6）、上述洗脱液经减压浓缩，回收石油醚，再用乙醇:石油醚为1:3的溶液对浓缩物进行重新溶解，调整骨化二醇浓度在0.5mg/L，得到上柱溶液e。
（7）、粒径为50um硅胶，采用湿法装柱，将上柱溶液e以2BV/h的流速通过硅胶柱，以1BV的乙醇做为洗脱液，以2BV/h的流速对其进行洗脱，收集洗脱液，在60℃，压力-0.08MPa条件下浓缩，干燥，得到纯度75.5%的骨化二醇产品。
实施例4：
（1）、在微生物酶催化维生素D3生成骨化二醇（25-羟基维生素D3）转化液中，按照体积比1:5加入石油醚，震荡萃取0.5h，收集上层有机溶剂，得到骨化二醇提取液a。
（2）、将上述骨化二醇提取液a，经过减压浓缩，回收石油醚，用甲醇重新溶解浓缩物，调整骨化二醇浓度在1mg/L，得到上柱溶液b。
（3）、琼脂糖凝胶过滤层析经活化后，采用湿法装柱，将上柱溶液b以2BV/h的流速通过琼脂糖凝胶过滤层析柱，选用层析分子量为800Da，以1BV的己酸乙酯做为洗脱液，以2BV/h的流速对其进行洗脱，收集洗脱液。
（4）、上述洗脱液经减压浓缩，回收己酸乙酯，再用甲醇：石油醚为1:3的溶液对浓缩物进行重新溶解，调整骨化二醇浓度在0.5mg/L，得到上柱溶液c。
（5）、大孔吸附树脂经乙醇溶液活化后，采用湿法装柱，将上柱溶液c以2BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱，以0.5BV甲醇：石油醚为1:3的溶液做为冲洗液，以2BV/h的流速冲洗大孔吸附树脂柱，以0.5BV的石油醚做为洗脱液，以2BV/h的流速对其进行洗脱，收集洗脱液。
（6）、上述洗脱液经减压浓缩，回收石油醚，再用乙醇：石油醚为1:3的溶液对浓缩物进行重新溶解，调整骨化二醇浓度在0.5mg/L，得到上柱溶液e。
（7）、粒径为50um硅胶，采用湿法装柱，将上柱溶液e以2BV/h的流速通过硅胶柱脂柱，以1BV的乙醇做为洗脱液，以2BV/h的流速对其进行洗脱，收集洗脱液。
（8）、上述洗脱液在60℃，压力-0.08MPa条件下进行减压浓缩，得到浓缩液，在4℃条件下进行结晶，得到骨化二醇晶体，产品纯度85.6%。

Claims (6)

1.一种骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法，其特征在于，分离纯化过程包括：
（1）、以微生物酶催化维生素D3生成骨化二醇（25-羟基维生素D3）转化液为提取原液，加入乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、石油醚中的一种或者多种有机溶剂，震荡后静置萃取，收集上层有机溶剂，获得骨化二醇提取物a；
（2）、将骨化二醇提取物a浓缩至膏状，回收有机溶剂，用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮中的一种或者多种有机溶剂对浓缩物进行重溶，获得骨化二醇上柱溶液b；
（3）、将骨化二醇上柱溶液b通过凝胶层析柱处理，凝胶层析为琼脂糖凝胶过滤层析和葡聚糖凝胶过滤层析中的一种，层析分子量为300Da~800Da，用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮中的一种或者多种有机溶剂对凝胶层析柱进行洗脱，收集洗脱液，得到骨化二醇提取物c；
（4）、将骨化二醇提取物c浓缩至膏状，回收有机溶剂，用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮中的一种或者多种有机溶剂对浓缩物进行重溶，获得骨化二醇上柱溶液d；
（5）、将骨化二醇上柱溶液d通过大孔吸附树脂柱吸附分离，大孔吸附树脂为极性和中极性层析介质中的一种，用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮中的一种或者多种有机溶剂对大孔吸附树脂柱进行冲洗，再用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮中的一种或者多种有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，得到骨化二醇提取物e；
（6）、将骨化二醇提取物e浓缩至膏状，回收有机溶剂，用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮中的一种或者多种有机溶剂对浓缩物进行重溶，获得骨化二醇上柱溶液f；
（7）、将骨化二醇上柱溶液f通过硅胶柱层析纯化，用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚、丙酮中的一种或者多种有机溶剂对硅胶柱进行洗脱，硅胶柱层析硅胶粒径10um~80um，收集洗脱液，得到骨化二醇提取物g；
（8）、将骨化二醇提取物g，进行减压浓缩，收集有机溶剂，对浓缩液进行高温或者低温结晶处理，得到骨化二醇晶体物质i。
2.根据权利要求1的一种骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述微生物酶催化维生素D3生成骨化二醇（25-羟基维生素D3）转化液，为全细胞催化、酶液催化方法得到的转化液。
3.根据权利要求1的一种骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）中，所述上柱条件为：上样浓度0.5mg/L~2mg/L，上样流速1BV/h ~3BV/h。
4.根据权利要求1的一种骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法，其特征在于，步骤（5）中，所述上柱条件为上样浓度0.5mg/L~2mg/L，上样流速1BV/h~3BV/h。
5.根据权利要求1的一种骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法，其特征在于，步骤（7）中，所述上样浓度0.5mg/L~2mg/L，上样流速1BV/h~3BV/h。
6.根据权利要求1的一种骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法，其特征在于，步骤（8）中，所述减压浓缩，浓缩温度为40℃~99℃，浓缩压力小于-0.08MPa。
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