CN110003287A - 一种快速高效制备总神经节苷脂的方法 - Google Patents

一种快速高效制备总神经节苷脂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物制药领域，具体说是一种快速高效制备总神经节苷脂的方法。该方法有效利用了反相层析介质的特点，相比大孔树脂在常压下操作，本发明的富集浓缩步骤可在中高压系统下进行，自动化程度更高，更快的处理浸提液，大大缩短的生产周期，提高了效率，而且产物的质量和产量都得到提高，为后续的转化、分离工作奠定基础。

Description

一种快速高效制备总神经节苷脂的方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体说是一种快速高效制备总神经节苷脂的方法。
背景技术
神经节苷脂(GLS)是存在于细胞膜表面的一类含有唾液酸的酸性鞘糖脂，在神经系统中含量最为丰富，约含0.3％左右。单唾液四己糖神经节苷脂(GM1)是迄今研究最为深入的神经节苷脂成份。GM1是人类细胞膜的天然成份，安全性高，耐受性良好，临床广泛应用于脑外伤恢复、脑出血恢复、缺氧缺血性脑病、中枢神经系统损伤、神经退行性疾病如帕金森病、阿尔兹海默病、亨廷顿病，以及外周神经病变方面的治疗。
总神经节苷脂（如图1所示）是猪脑提取的产物，又是GM1生产过程中转化工艺的底物和中间体，它的数量和质量对转化效果有直接影响，是后续GM1分离工艺的基础，也是影响最终产品收率和产品质量的重要环节。
目前国内制备总神经节苷脂的方法第一步通常是以猪脑组织为原料，经过提取、分层、皂化等步骤获得神经节苷脂浸提液，第二步富集过程除了少数采用超临界流体萃取（CN 109320566 A、CN 101270137B）或连续多次超滤（CN 104151372、CN 1158295C）外，大多数仍采用大孔树脂进行吸附浓缩，从而获得总神经节苷脂（CN 108546276 A、CN 108822164A、CN 104151372 A、CN 102731584 B、CN 101177439 B）。上述富集浓缩方法中，超临界流体萃取需要在超过30MPa的高压下操作，对设备安全性要求高，处理量小，而连续多次超滤步骤繁琐，耗时久，产品纯度偏低，因此都难以应用于总神经节苷脂的工业化大规模生产。大孔树脂吸附虽然具有较强的吸附力，但所有的工艺基本都采用了一步冲洗，一步洗脱，仅能去除部分极性较大的杂质，无法有效分离浸提液中极性较小的磷脂（如图2所示）和胆固醇（如图3所示）类杂质，因此导致富集浓缩得到的总神经节苷脂纯度偏低，复溶困难，收率较低，而且工业规模树脂吸附往往需要装填数千升的树脂，溶剂消耗大，产生的固体废物和废液带来较大的环保压力。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速高效制备总神经节苷脂的方法，该方法不仅工艺流程简单，周期短，而且可提高总神经节苷脂的收率和纯度。
为解决上述问题，采取以下技术方案：
本发明的快速高效制备总神经节苷脂的方法的特点是包括以下步骤：
步骤一，总神经节苷脂的提取
a.取新鲜猪脑组织，或冷冻猪脑解冻后匀浆，按照猪脑和提取液的质量比1:（5~9）混合，搅拌1-2小时，静置后抽滤取清液；
b.向a取得的清液中加入0.3-0.4倍清液体积的纯水，搅拌0.5h以上，静置过夜，分层后收集上层清液；
c.向b收集的清液中加入0.3-0.4%氢氧化钠固体，控制温度50-60℃进行消化1.5-2h，得到总神经节苷脂浸提液。
步骤二，总神经节苷脂的富集浓缩
a.对步骤一中得到的总神经节苷脂浸提液进行减压蒸馏，准备进行反相层析吸附；
b.反相层析介质装填于动态轴向压缩柱中，以20-25%甲醇水溶液平衡动态轴向压缩柱，将a中浓缩后的浸提液以10-12BV/h流速上样至动态轴向压缩柱中，上样体积为70-90BV；
c.上样完成后，继续用20-25%甲醇水溶液冲洗动态轴向压缩柱3-5BV，流速5-6BV/h；
d.洗脱：用75-80%甲醇水溶液以2-3BV/h流速洗脱动态轴向压缩柱，收集洗脱液；
e.再生：用100%甲醇溶液以3-5BV/h流速清洗动态轴向压缩柱。
步骤三，将步骤二d中收集的洗脱液经40℃水浴减压浓缩，抽滤，干燥，既得总神经节苷脂。
其中，所述步骤一a中的提取液由甲醇、氯仿和水混合而成，其体积比为甲醇：氯仿：水=2:1:1。
所述步骤二a的减压蒸馏的目的在于去除总神经节苷脂浸提液中的氯仿，浓缩到浸提液中的甲醇浓度降低至10-20%。
所述反相层析介质选用Bettsep BP70介质。
采取上述方案，具有以下优点：
本发明提供的制备总神经节苷脂的方法，有效利用了反相层析介质的特点，相比大孔树脂在常压下操作，本发明的富集浓缩步骤可在中高压系统下进行，自动化程度更高，更快的处理浸提液，大大缩短的生产周期，提高了效率，而且产物的质量和产量都得到提高，为后续的转化、分离工作奠定基础。
附图说明
图1是神经节苷脂的结构图（包括GM1、GM2、GM3等）；
图2是磷脂的结构图；
图3是胆固醇的结构图；
图4是总神经节苷脂纯化图谱。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。
实施例一
本实施例的快速高效制备总神经节苷脂的方法包括以下步骤。
步骤一，总神经节苷脂的提取：
a.取新鲜猪脑组织，或冷冻猪脑解冻后匀浆，按照猪脑和提取液的质量比1:5混合，搅拌1小时，静置后抽滤取清液。
b.向a取得的清液中加入0.3倍清液体积的纯水，搅拌0.5h以上，静置过夜，分层后收集上层清液。
c.向b收集的清液中加入0.3%氢氧化钠固体，控制温度50℃进行消化1.5h，得到总神经节苷脂浸提液。
步骤二，总神经节苷脂的富集浓缩：
a.对步骤一中得到的总神经节苷脂浸提液进行减压蒸馏，准备进行反相层析吸附。
b.反相层析介质装填于动态轴向压缩柱中，以20%甲醇水溶液平衡动态轴向压缩柱，将a中浓缩后的浸提液以10BV/h流速上样至动态轴向压缩柱中，上样体积85BV。
c.上样完成后，继续用20%甲醇水溶液冲洗动态轴向压缩柱3BV，流速5BV/h。
d.洗脱：用75%甲醇水溶液以3BV/h流速洗脱动态轴向压缩柱，收集洗脱液。
e.再生：用100%甲醇溶液以3BV/h流速清洗动态轴向压缩柱，纯化图谱如图4所示。
步骤三，将步骤二d中收集的洗脱液经40℃水浴减压浓缩，抽滤，干燥，既得总神经节苷脂。
其中，所述步骤一a中的提取液由甲醇、氯仿和水混合而成，其体积比为甲醇：氯仿：水=2:1:1。
所述步骤二a的减压蒸馏的目的在于去除总神经节苷脂浸提液中的氯仿，浓缩到浸提液中的甲醇浓度降低至10%。
所述反相层析介质选用Bettsep BP70介质。
实施例二
本实施例的快速高效制备总神经节苷脂的方法包括以下步骤。
步骤一，总神经节苷脂的提取：
a.取新鲜猪脑组织，或冷冻猪脑解冻后匀浆，按照猪脑和提取液的质量比1:7混合，搅拌1.5小时，静置后抽滤取清液。
b.向a取得的清液中加入0.35倍清液体积的纯水，搅拌0.5h以上，静置过夜，分层后收集上层清液。
c.向b收集的清液中加入0.35%氢氧化钠固体，控制温度55℃进行消化1.5h，得到总神经节苷脂浸提液。
步骤二，总神经节苷脂的富集浓缩：
a.对步骤一中得到的总神经节苷脂浸提液进行减压蒸馏，准备进行反相层析吸附。
b.反相层析介质装填于动态轴向压缩柱中，以22%甲醇水溶液平衡动态轴向压缩柱，将a中浓缩后的浸提液以11BV/h流速上样至动态轴向压缩柱中，上样体积70BV。
c.上样完成后，继续用22%甲醇水溶液冲洗动态轴向压缩柱4BV，流速5BV/h。
d.洗脱：用78%甲醇水溶液以2.5BV/h流速洗脱动态轴向压缩柱，收集洗脱液。
e.再生：用100%甲醇溶液以4BV/h流速清洗动态轴向压缩柱，纯化图谱如图4所示。
步骤三，将步骤二d中收集的洗脱液经40℃水浴减压浓缩，抽滤，干燥，既得总神经节苷脂。
其中，所述步骤一a中的提取液由甲醇、氯仿和水混合而成，其体积比为甲醇：氯仿：水=2:1:1。
所述步骤二a的减压蒸馏的目的在于去除总神经节苷脂浸提液中的氯仿，浓缩到浸提液中的甲醇浓度降低至15%。
所述反相层析介质选用Bettsep BP70介质。
实施例三
本实施例的快速高效制备总神经节苷脂的方法包括以下步骤。
步骤一，总神经节苷脂的提取：
a.取新鲜猪脑组织，或冷冻猪脑解冻后匀浆，按照猪脑和提取液的质量比1:9混合，搅拌2小时，静置后抽滤取清液。
b.向a取得的清液中加入0.4倍清液体积的纯水，搅拌0.5h以上，静置过夜，分层后收集上层清液。
c.向b收集的清液中加入0.4%氢氧化钠固体，控制温度60℃进行消化2h，得到总神经节苷脂浸提液。
步骤二，总神经节苷脂的富集浓缩：
a.对步骤一中得到的总神经节苷脂浸提液进行减压蒸馏，准备进行反相层析吸附。
b.反相层析介质装填于动态轴向压缩柱中，以25%甲醇水溶液平衡动态轴向压缩柱，将a中浓缩后的浸提液以12BV/h流速上样至动态轴向压缩柱中，上样体积75BV。
c.上样完成后，继续用25%甲醇水溶液冲洗动态轴向压缩柱5BV，流速6BV/h。
d.洗脱：用80%甲醇水溶液以2BV/h流速洗脱动态轴向压缩柱，收集洗脱液。
e.再生：用100%甲醇溶液以5BV/h流速清洗动态轴向压缩柱，纯化图谱如图4所示。
步骤三，将步骤二d中收集的洗脱液经40℃水浴减压浓缩，抽滤，干燥，既得总神经节苷脂。
其中，所述步骤一a中的提取液由甲醇、氯仿和水混合而成，其体积比为甲醇：氯仿：水=2:1:1。
所述步骤二a的减压蒸馏的目的在于去除总神经节苷脂浸提液中的氯仿，浓缩到浸提液中的甲醇浓度降低至20%。
所述反相层析介质选用Bettsep BP70介质。
上述三个实施例获得的总神经节苷脂的分析数据如下表。
本发明所用Bettsep BP70层析法，相对于现有以大孔吸附树脂为代表的方法，具有以下优点：
1）分离选择性高；Bettsep BP70疏水性中等，对提取液中的神经节苷脂和磷脂以及胆固醇具有不同的结合力，可通过不同浓度的甲醇进行分步洗脱，相比大孔吸附树脂法用纯甲醇一步洗脱得到的神经节苷脂，其中磷脂和胆固醇含量显著降低；
2）相比大孔吸附树脂法，洗脱过程洗脱体积更小，整个纯化过程仅使用含有甲醇的水溶液，能够有效减少有机废水的产生，降低生产成本和减少环境污染；
3）产品纯度高；经过Bettsep BP70分步洗脱的纯化，可将粗品中含量仅有0.2%左右的总神经节苷脂提高至55-60%；
4）产品复溶性好；获得的总神经节苷脂固体中由于杂质胆固醇、磷脂大大降低，复溶性得到明显提高，方便后续进一步处理，减少产品损失；
5）纯化时间短；Bettsep BP70因其交联度高，耐压性更好，溶胀性非常低，可装填在动态轴向压缩柱（DAC）中，使用高流速操作，相比大孔吸附树脂只能使用蠕动泵，大大缩短整个纯化周期；
6）可采用现代工业层析系统实现全程操控、数字化数据记录，生产全流程具有可追溯性，产品质量控制更有保障，更符合现代化制药工业流程控制的理念；
7）柱体积至少缩小4倍，最终需要处理的废弃介质量大幅下降，减少环境污染压力。

Claims (4)

1.一种快速高效制备总神经节苷脂的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一，总神经节苷脂的提取
a.取新鲜猪脑组织，或冷冻猪脑解冻后匀浆，按照猪脑和提取液的质量比1:（5~9）混合，搅拌1-2小时，静置后抽滤取清液；
b.向a取得的清液中加入0.3-0.4倍清液体积的纯水，搅拌0.5h以上，静置过夜，分层后收集上层清液；
c.向b收集的清液中加入0.3-0.4%氢氧化钠固体，控制温度50-60℃进行消化1.5-2h，得到总神经节苷脂浸提液；
步骤二，总神经节苷脂的富集浓缩
a.对步骤一中得到的总神经节苷脂浸提液进行减压蒸馏，准备进行反相层析吸附；
b.反相层析介质装填于动态轴向压缩柱中，以20-25%甲醇水溶液平衡动态轴向压缩柱，将a中浓缩后的浸提液以10-12BV/h流速上样至动态轴向压缩柱中，上样体积为70-90BV；
c.上样完成后，继续用20-25%甲醇水溶液冲洗动态轴向压缩柱3-5BV，流速5-6BV/h；
d.洗脱：用75-80%甲醇水溶液以2-3BV/h流速洗脱动态轴向压缩柱，收集洗脱液；
e.再生：用100%甲醇溶液以3-5BV/h流速清洗动态轴向压缩柱；
步骤三，将步骤二d中收集的洗脱液经40℃水浴减压浓缩，抽滤，干燥，既得总神经节苷脂。
2.如权利要求1所述的快速高效制备总神经节苷脂的方法，其特征在于所述步骤一a中的提取液由甲醇、氯仿和水混合而成，其体积比为甲醇：氯仿：水=2:1:1。
3.如权利要求2所述的快速高效制备总神经节苷脂的方法，其特征在于所述步骤二a的减压蒸馏的目的在于去除总神经节苷脂浸提液中的氯仿，浓缩到浸提液中的甲醇浓度降低至10-20%。
4.如权利要求1所述的快速高效制备总神经节苷脂的方法，其特征在于所述反相层析介质选用Bettsep BP70介质。
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