CN104910216A - 一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法，提取方法工艺精简，原料药材淫羊藿来源广泛，成本低廉，提取分离过程环境友好，成本低廉，操作简便，可以分离得到大花淫羊藿苷A、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷SutchuenmedinA、斯皮诺鼠李糖苷、鼠李糖淫羊藿次苷II和淫羊藿次苷II多种成分，提高了淫羊藿的利用价值，适合实验室及工业化规模的生产需求。

Description

一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法。

背景技术

淫羊藿甙是来源于小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epimedium)植物的一种大多含有异戊烯基的黄酮甙类化合物，研究表明淫羊藿黄酮苷具有改善心脑血管系统功能、增强机体免疫力和促进DNA合成等生理活性。具有强心、降血压、抗心律失常、增加脑血流量、抑菌、抗病毒、抗炎、降血脂、抗肿瘤等多种作用，具有较高的药用和保健价值。但是，目前对淫羊藿的开发研究还处于初级阶段，对淫羊藿有效成分的研究尚不够深入。因此，利用我国的淫羊藿资源优势，运用祖国传统医学经验与现代科学技术相结合，在其有效成分、制剂工艺、药理作用和临床应用等方面进行深入的研究，淫羊藿有可能成为具有良好开发前景的增强免疫功能和免疫调节、抗骨质疏松、治疗心脑血管疾病的优势药物，具有广阔的应用前景。

目前从淫羊藿中初分离淫羊藿总黄酮苷的方法有两大类。一类是采用溶剂萃取的方法进行初分离，此法得到的是淫羊藿总黄酮苷的粗品，且收率不高，还有有机溶剂残留会影响产品质量。另一类采用大孔吸附树脂来分离，但其技术关键都是传统的吸附-解吸工艺，操作过程无法跟踪检测，此方法也是只能得到淫羊藿总黄酮苷粗品。淫羊藿中黄酮苷类单体物质的分离鉴定文献中涉及到大量的采用正相硅胶柱层析，凝胶柱层析，反相半制备HPLC分离的方法，其中正相硅胶柱层析由于对苷类物质吸附强而使分离效果拖尾严重，分离效果不佳，凝胶柱层析和反相半制备HPLC分离由于要用到昂贵的色谱级溶剂和分离量小无法用于规模化分离。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法，成本低廉，操作简便，可以同时分离多种成分，提高了淫羊藿的利用价值，适合实验室及工业化规模的生产需求。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法，包括如下步骤：

S1、将淫羊藿药材粉碎，称取3Kg，置于50L提取罐中，用30L 70％乙醇回流提取两次，每次3h，过滤，合并滤液，得提取液；

S2、将步骤S1所得的提取液减压浓缩至1000mL，得淫羊藿粗提物浓缩液；

S3、在步骤S2所得的浓缩液中加入2000mL95％乙醇，充分搅拌，室温静置24h，过滤，将滤液浓缩至500mL后，再加入2000mL95％乙醇，充分搅拌，室温静置24h，过滤，将滤液浓缩至无醇味，过高速离心机离心，得到淫羊藿醇沉组分600mL；

S4、取步骤S3所得的淫羊藿醇沉组分，加样至已处理好的D-101型大孔树脂层析柱中；依次用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，3倍柱体积30％乙醇洗脱，最后用3倍柱体积的85％乙醇洗脱，得淫羊藿总黄酮液，浓缩备用；

S5、步骤S4所得的淫羊藿总黄酮采用制备液相色谱分离。用初始流动相平衡色谱柱20min，取步骤S4所得的淫羊藿总黄酮浓缩液稀释5倍，进样，每次进样体积5mL，按设定梯度洗脱，紫外检测实时监控，根据峰及峰的保留时间进行收集，收集保留时间为16.72min、17.65min、18.45min、19.13min、20.48min、26.79min、27.95min和30.39min的共8个目标组分；

S6、40min以后，按照初始梯度平衡色谱柱，再次进样，收集洗脱组分；共进样5次，将5次收集得到的洗脱组分按保留时间合并相同部分，浓缩，真空离心干燥得到不同黄酮苷成分；

S7、将收集得到的各组份经HPLC检验纯度，均为为98.5％。由于梯度分析样品时间较长，所以样品纯度分析时用等度检测。

其中，所述步骤S3中离心机的频率为25000r/min。

其中，所述步骤S5中色谱柱为c18(10μm，250mm×50mm)，紫外检测波长为270nm，柱流速为60mL/min，洗脱梯度：洗脱剂采用乙腈-水-磷酸体系，首先用体积百分比为15％的乙腈，体积百分比为0.2％的磷酸洗脱；再用体积百分比为30％的乙腈，体积百分比为0.2％的磷酸洗脱；再用体积百分比为45％乙腈，体积百分比为0.2％的磷酸洗脱，最后用体积百分比为60％乙腈，体积百分比为0.2％的磷酸洗脱，40min完成一个分离周期。

其中，所述步骤S7中制备柱中保留时间为20.48min及其前面的4个成分的HPLC分析条件为：c18(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为乙腈∶水∶磷酸30∶69.8∶0.2，检测波长为270nm，流速为1mL/min，柱温为25℃。

其中，所述步骤S7中制备柱中保留时间在20.48min后面的3个样品的HPLC分析条件为：c18(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为乙腈∶水∶磷酸50∶49.8∶0.2，检测波长为270nm，流速为1mL/min，柱温为25℃。

根据文献及核磁共振谱图解析结果，所得组分依次为大花淫羊藿苷A、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷Sutchuenmedin A、斯皮诺鼠李糖苷、鼠李糖淫羊藿次苷II和淫羊藿次苷II。

本发明具有以下有益效果：

提取方法，工艺精简，原料淫羊藿来源广泛，成本低廉，提取制备过程环境友好，成本低廉，操作简便，可以同时分离多种成分，提高了淫羊藿的利用价值，适合实验室及工业化规模的生产需求。

附图说明

图1为本发明实施例中淫羊藿大孔树脂洗得总黄酮的HPLC分析图谱。

图2为本发明实施例中淫羊藿总黄酮中各单体成分分离的制备HPLC谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法，包括如下步骤：

S1、将淫羊藿药材粉碎，称取3Kg，置于50L提取罐中，用30L70％乙醇回流提取两次，每次3h，过滤，合并滤液，得提取液；

S2、将步骤S1所得的提取液减压浓缩至1000mL，得淫羊藿粗提物浓缩液：

S3、在步骤S2所得的浓缩液中加入2000mL95％乙醇，充分搅拌，室温静置24h，过滤，将滤液浓缩至500mL后，再加入2000mL95％乙醇，充分搅拌，室温静置24h，过滤，将滤液浓缩至无醇味，过高速离心机离心，离心机的频率为25000r/min，得到淫羊藿醇沉组分600mL：

S4、取步骤S3所得的淫羊藿醇沉组分，加样至已处理好的D-101型大孔树脂层析柱中；依次用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，3倍柱体积的30％乙醇洗脱，最后3倍柱体积的85％乙醇洗脱，得淫羊藿总黄酮液，浓缩备用；

S5、步骤S4所得的淫羊藿总黄酮采用制备液相色谱分离。取步骤S4所得的淫羊藿总黄酮浓缩液稀释5倍，用初始流动相平衡色谱柱20min，进样，每次进样体积5mL，按设定梯度洗脱，紫外检测实时监控，色谱柱为c18(10μm，250mm×50mm)，紫外检测波长为270nm，柱流速为60mL/min，洗脱梯度见表1

表1制备液相色谱洗脱梯度。

时间(t)	乙腈	水	磷酸
				0	15	84.8	0.2

15	3069.8	0.2
			20	4554.8	0.2
40	6039.8	0.2

根据峰及峰的保留时间进行收集，收集保留时间为16.72min、17.65min、18.45min、19.13min、20.48min、26.79min、27.95min和30.39min的共8个目标组分；

S6、40min以后，按照初始梯度平衡色谱柱，再次进样，收集洗脱组分；共进样5次，将5次收集得到的洗脱组分按保留时间合并相同部分，浓缩，真空离心干燥得到黄酮苷成分；

S7、将收集得到的各组份经HPLC检验纯度，均为为98.5％。由于梯度分析样品时间较长，所以将分析样品的条件改为等度检测。制备柱中保留时间为20.48min及其前面的4个成分的HPLC分析条件为：c18(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为乙腈∶水∶磷酸30∶69.8∶0.2，检测波长为270nm，流速为1mL/min，柱温为25℃；制备柱中保留时间在20.48min后面的3个样品的HPLC分析条件为：C18(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为乙腈∶水∶磷酸50∶49.8∶0.2，检测波长为270nm，流速为1mL/min，柱温为25℃。

根据文献及核磁共振谱图解析结果，所得组分依次为大花淫羊藿苷A、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿Sutchuenmedin A、斯皮诺鼠李糖苷、鼠李糖淫羊藿次苷II和淫羊藿次苷II。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将淫羊藿药材粉碎，称取3Kg，置于50L提取罐中，30L70％乙醇回流提取两次，每次3h，过滤，合并滤液，得提取液；

S2、将步骤S1所得的提取液减压浓缩至1000mL，得淫羊藿粗提物浓缩液；

S3、在步骤S2所得的浓缩液中加入2000mL95％乙醇，充分搅拌，室温静置24h，过滤，将滤液浓缩至500mL后，再加入2000mL95％乙醇，充分搅拌，室温静置24h，过滤，将滤液浓缩至无醇味，过高速离心机离心，得到淫羊藿醇沉组分600mL；

S4、取步骤S3所得的淫羊藿醇沉组分，加样至己处理好的D-101型大孔树脂层析柱中；依次用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，3倍柱体积的30％乙醇洗脱，3倍柱体积的85％乙醇洗脱，得淫羊藿总黄酮液，浓缩备用；

S5、步骤S4所得的淫羊藿总黄酮采用制备液相色谱分离。用初始流动相平衡色谱柱20min，取步骤S4所得的淫羊藿总黄酮浓缩液稀释5倍，进样，每次进样5mL，按设定梯度洗脱，紫外检测实时监控，根据峰及峰的保留时间进行收集，收集保留时间为16.72min、17.65min、18.45min、19.13min、20.48min、26.79min、27.95min和30.39min的共8个目标组分；

S6、40min以后，按照初始梯度平衡色谱柱，再次进样，收集洗脱组分；共进样5次，将5次收集得到的洗脱组分按保留时间合并相同部分，浓缩，真空离心干燥得到不同黄酮成分；

S7、将收集得到的各组份经HPLC检验纯度，纯度均大于98.5％。

2.根据权利要求1所述的一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法，其特征在于，所述步骤S3中离心机的频率为25000r/min。

3.根据权利要求1所述的一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法，其特征在于，所述步骤S5中色谱柱为c18(10μm，250mm×50mm)，紫外检测波长为270nm，柱流速为60mL/min，洗脱梯度：首先用体积百分比为15％的乙腈，体积百分比为0.2％的磷酸洗脱；再用体积百分比为30％的乙腈，体积百分比为0.2％的磷酸洗脱；再用体积百分比为45％乙腈，体积百分比为0.2％的磷酸洗脱，最后用体积百分比为60％乙腈，体积百分比为0.2％的磷酸洗脱，40min完成一个分离周期。

4.根据权利要求1所述的一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法，其特征在于，所述步骤S7中制备柱中保留时间为20.48min及其前面的4个成分的HPLC分析条件为：c18(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为乙腈∶水∶磷酸30∶69.8∶0.2，检测波长为270nm，流速为1mL/min，柱温为25℃。

5.根据权利要求1所述的一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法，其特征在于，所述步骤S7中制备柱中保留时间在20.48min后面的3个样品的HPLC分析条件为：c18(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为乙腈∶水∶磷酸50∶49.8∶0.2，检测波长为270nm，流速为1mL/min，柱温为25℃。

6.根据权利要求1所述的一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法，其特征在于，所得组分依次为大花淫羊藿苷A、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷Sutchuenmedin A、斯皮诺鼠李糖苷、鼠李糖淫羊藿次苷II和淫羊藿次苷II。