CN102660618A - 一种微生物转化制造25-羟基维生素d的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法。本发明主要采用中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的链霉菌（Streptomycessp.wsbee2009112）对维生素D进行25位羟基转化，保藏编号为CGMCC No.5831。本发明的具体转化方法为：将制备好的孢子悬液接种于培养基中，在转速为200～280rpm、温度为22℃～30℃的摇床上培养2～5天；往培养基中加入由环糊精、维生素D、表面活性剂和有机溶剂混合制成的混合物，继续培养1～10天；经过滤等步骤后得到成品。本发明具有可在维生素D的25位进行直接羟基化、产率高、生产步骤简单、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种转化制造25-羟基维生素D的方法，具体是指一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法。
背景技术
25-羟基维生素D3等活性维生素在临床上用于骨质疏松症及各种原因造成的佝偻病、骨软化症，也可作为饲料添加剂用于饲料行业。
25-羟基维生素D3，又名骨化二醇，是维生素D3的活性代谢物，具有更强的生理活性，并且不需要经过肝脏的代谢。它不仅具有普通维生素D3所有的功能，25-羟基维生素D3作为一种活性物质绕过肝脏转化，直接供人或动物吸收作用；在禽类动物中使用，可以促进禽类动物的骨骼发育，促进骨密度最大化，减少雏鸡死亡率1%～3%，减少骨质疏松症及笼养蛋鸡疲劳症，改善蛋壳质量减少蛋壳破损率2%，提高孵化率1-3%，延长产蛋周期︰一个完整的育种周期中，每个母鸡至少多孵化了2～4个蛋，一个完整的产蛋周期中，每个母鸡至少多产1～6个蛋；在种猪使用，可以提高精液质量，提高受精率，预防钙磷代谢障碍所致瘫痪和裂蹄，降低8%的仔猪淘汰率，减少三天的断奶至配种间隔，增加0.5头的断奶仔猪数/头母猪/年。
维生素D的25位进行化学直接羟基化，是非常困难的，产率非常低。25-羟基维生素D的已知合成大多采用化学合成法，主要采用维生素D作为原料，经过酯化保护、环和、断键、偶合、氧化、开环、纯化等多步反应生成。化学合成需进行多步的基团保护和脱保护，运用光照反应，开环和异构化。合成步骤繁多，分离纯化复杂。在生产上操作复杂，收率偏低，在10%左右。
发明内容
本发明的目的在于提供收率高、操作简单，制造成本低的一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法。
实现本发明的技术方案如下︰一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法，主要采用链霉菌（Streptomyces sp. wsbee2009112）对维生素D进行25位羟基转化，所述链霉菌（Streptomyces sp. wsbee2009112）已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏；保藏日期：2012年2月29日；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No. 5831。
进一步，所述转化方法由以下步骤构成：
（1）制备出培养基；制备出孢子悬液；将孢子悬液接种到培养基中，在转速为200～280rpm、温度为22℃～30℃的摇床上培养2～5天或培养到培养基中糖浓度降到0.002～0.05%；
（2）往培养基中加入准备好的环糊精、维生素D、表面活性剂和有机溶剂混合制成的混合物，继续培养1～10天；
（3）培养基经过滤、萃取、浓缩、层析、分离后得到成品。
为了提高其转化率，所述培养基中环糊精的浓度优选为0.5～5g/L。
为了最大限度的使维生素D溶解于培养基中，所述环糊精与维生素D的重量比为2︰1～5︰1。其中3︰1为最优的选择。
进一步，所述培养基中表面活性剂的浓度为0.1～1g/L。
作为一种优选，所述步骤（4）中环糊精采用β环糊精、γ-环糊精、环糊精衍生物、羟丙基-β-环糊精、糖基-β-环糊精和甲基化环糊精中的一种或多种。
为了更好的实现本发明，所述步骤（4）中表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸非离子型表面活性酯。
作为一种优选，所述步骤（4）中有机溶剂为醇类有机溶剂。
为了保证转化效率高，所述维生素D为维生素D2或维生素D3。
本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明采用微生物对维生素D进行转化，该转化条件温和，为工业制备提供了一条新的工艺路线；
2、本发明采用微生物直接在维生素D的25位引入羟基的方法，解决了有机合成难以实现的问题，在短时间内直接引入羟基生成活性产物；
3、本发明采用微生物产生的细胞色素P450酶直接对维生素D的25位羟基化，具有产物立体选择性高，收率高等特点；
4、本发明中环糊精等助溶剂的添加更有助于维生素D在培养基中的溶解，有助于提高转化率；
5、本发明具有制造成本低、工艺路线短等优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所用菌株是发明人从四川省仁寿县二峨山地区采取的土样中分离得到的一种菌株wsbee2009112。菌落为灰白色，背面黄褐色，菌落粘着力较好，结构呈粉质粉，菌落粗糙干燥，质地蜡样，有些培养上能产生色素；孢子丝长而直，或有短分支，生长末期易断裂。将该菌落wsbee2009112在不同种类的培养基上进行培养，培养出的菌落形态如表1。
表1
| 培养基 | 生长情况 | 颜色 |
| 燕麦培养基 | 中度 | 白色 |
| 葡萄糖黄豆饼粉培养基 | 丰茂 | 浅黄色，菌落边缘整齐 |
| 高氏一号培养基 | 丰茂 | 菌落灰白色，周边一圈白色，背面黄褐色 |
| 蔗糖查氏培养基 | 中度 | 菌落圆形，灰黑色 |
| 葡萄糖蛋白胨培养基 | 丰茂 | 白色 |
| 蛋白胨牛肉盐琼脂培养基 | 丰茂 | 菌落呈粉状，淡绿色，背面为淡褐色 |
| 牛肉膏琼脂培养基 | 丰茂 | 菌落呈粉状，淡绿色，边缘为白色，背面黄褐色 |
| 黄豆饼粉浸汁琼脂培养基 | 丰茂 | 灰黄色，背面黑色 |
菌株能使液化明胶，淀粉水解，牛奶不发生胨化，不产生H2S。对葡萄糖，肌醇，D-甘露糖，甘露醇，果糖等糖醇均有不同程度的利用能力，但不利用鼠李糖，棉子糖，L-阿拉伯糖，D-木糖。
综上初步鉴定菌株属于放线菌链霉菌属（Streptomyces sp. wsbee2009112）保藏编号为CGMCC No. 5831。
本发明的菌株培养方式为液体培养，采用深层培养方式，在通气条件下进行培养，发酵温度为22～30℃，最优的选择是27℃，培养基的pH值范围为6.5～7.5，最好为7.0。
本发明培养基中的营养物质包括无机盐、氮源、碳源。无机盐包括碱金属氯化物、碱土金属氯化物、硝酸盐、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐，本发明的最优选择为CaCO4或NaH2PO4。氮源为铵盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、硝酸、氨基酸及混合物、肽或蛋白质及其水解物、肉提取物、谷物的水溶性提取物、玉米麦芽提取物、玉米浸渍液、豆粕粉、花生粉和棉籽粉等中的一种或多种；所述谷物的水溶性提取物为玉米、小麦等物质的水溶性提取物。碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、甘露糖和乳糖等中的一种或多种。
实施例1
（1）选用重量百分比为1.5﹪葡萄糖、1.5﹪黄豆饼粉、0.5﹪玉米浆、0.5﹪NaCl、0.2﹪CaCO3和95.8﹪蒸馏水混合均匀，调节pH到 7.0，取出100mL培养基放置于500mL摇瓶中，在121℃条件下灭菌30min。
制备出孢子悬液。将平板培养上的孢子全部接入含20ml无菌水的三角瓶（含玻璃珠）中，摇床260rpm约15min，制成孢子悬液。同时将该孢子液采用平板计数法，三次计数后，每毫升孢子量基本稳定在108个/ml。
将4mL孢子悬液接种到该培养基中，在转速为240rpm、温度为27℃的摇床上培养4d。
（2）往培养基中加入准备好的50mg环糊精、10mg维生素D3、10mg Triton X-100和2mL无水乙醇混合制成的混合物，继续培养3d，得到发酵液。该混合物的混合步骤为将50mg维生素D3和10mg的β -环糊精、10mgTriton X- 100溶解于2mL无水乙醇中混合即可。
（3）过滤发酵液，滤液用乙酸乙酯50mL萃取两次，萃取后的提取液浓缩，用硅胶柱[柱层析硅胶]，然后用比例为1︰2的乙酸乙酯和石油醚对层析后的液体进行分离，即可得到25位羟基化产物骨化二醇。
经检测得知︰得到25位羟基化产物骨化二醇为25mg，收率达到50%。
实施例2
（1）选用重量百分比为1.5﹪葡萄糖、1.5﹪黄豆饼粉、0.5﹪玉米浆、0.7%酵母膏、0.5﹪NaCl、0.2﹪CaCO3和95.1﹪蒸馏水混合均匀，取出100mL培养基放置于500mL摇瓶中，在121℃条件下灭菌30min。
制备出孢子悬液，采用实施例1中的方式制备出相同浓度的孢子悬液。
将4mL孢子悬液接种到该培养基中，在转速为200rpm、温度为28℃的摇床上培养60h。
（2）往培养基中加入准备好的1g的β-环糊精、340mg维生素D2、100mg Triton X-100和5mL无水乙醇以及5mL无菌水混合制成的混合物，继续培养72h，得到发酵液。该混合物的混合步骤为：将340mg维生素D2用5ml无水乙醇溶解，加入1g的甲基化β -环糊精、100mg的Triton X- 100和5ml的无菌水，溶解混匀即可。
（3）在100mL发酵液中加入30ml丙酮，再加50mL乙酸乙酯，充分摇匀，静置，取上层清液，将上层清液浓缩，浓缩后的液体进行层析，用体积比为1︰2的乙酸乙酯和石油醚对层析后的液体进行分离，即可得到25位羟基化维生素D2。
经检测得知：得到25位羟基化维生素D2 140mg，收率约达到40%。
实施例3
（1）选用重量百分比为1.5﹪葡萄糖、1.5﹪黄豆饼粉、0.5﹪玉米浆、0.5﹪NaCl、0.2﹪CaCO3和95.8﹪蒸馏水混合均匀，调节pH到 7.0，取出50mL培养基放置于250mL摇瓶中，在121℃条件下灭菌30min。
制备出孢子悬液，采用实施例1中的方式制备出相同浓度的孢子悬液。
将4mL孢子悬液接种到该培养基中，在转速为200rpm、温度为27℃的摇床上培养3d。
（2）往培养基中加入准备好的10mg的β-环糊精、5mg的γ-环糊精、30mg维生素D2、5mg的 Triton X-100和2mL无水乙醇以及1mL无菌水混合制成的混合物，继续培养3d，得到发酵液。该混合物的混合步骤为：将30mg维生素D2、10mg的β -环糊精、5mg的γ-环糊精和5mg的Triton X-100溶解于2mL无水乙醇与1mL无菌水的混合溶剂中即可。
（3）在50mL发酵液过滤，滤液用50mL乙酸乙酯萃取两次，萃取液浓缩，用硅胶柱[柱层析硅胶]，用体积比为1︰2的乙酸乙酯和石油醚对层析后的液体进行分离，即可得到25位羟基化维生素D2。
经检测得知︰得到25位羟基化维生素D210mg，收率达到33%。
实施例4
（1）选用重量百分比为1.5﹪葡萄糖、1.5%蛋白胨、1.5﹪黄豆饼粉、0.5﹪玉米浆、0.5﹪NaCl、0.2﹪CaCO3和94.3﹪蒸馏水混合均匀，调节pH到 7.0，取出100mL培养基放置于500mL摇瓶中，在121℃条件下灭菌30min。
制备出孢子悬液，采用实施例1中的方式制备出相同浓度的孢子悬液。
将4mL孢子悬液接种到该培养基中，在转速为240rpm、温度为27℃的摇床上培养4d。
（2）往培养基中加入准备好的300mg的甲基化β -环糊精、100mg 维生素D3、100mg的 Triton X- 100和5mL无水乙醇以及2mL无菌水混合制成的混合物，继续培养3d，得到发酵液。该混合物的混合步骤为：将100mg维生素D3、300mg的部分甲基化β -环糊精和100mg的Triton X- 100溶解于5mL无水乙醇与2mL无菌水组成的混合液中即可。
（3）在100mL发酵液过滤，滤液用50mL乙酸乙酯萃取两次，萃取液浓缩，用硅胶柱[柱层析硅胶]，用体积比为1︰2的乙酸乙酯和石油醚对层析后的液体进行分离，即可得到25位羟基化产物骨化二醇。
经检测得知︰得到25位羟基化产物骨化二醇57mg，收率达到57%。
根据以上实施例可得出：本发明不仅为骨化二醇等25羟基维生素D类药物的工业制备提供了一条新的工艺路线，提供了一种维生素D的25位直接羟基化的生物转化方法；而且将已知的合成骨化二醇多个化学反应步骤缩短为一个步骤，总收率提高到40～50%，降低制造成本，环境友好。
Claims (9)
1.一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法，其特征在于，主要采用链霉菌（Streptomyces sp. wsbee2009112）对维生素D进行25位羟基转化，所述链霉菌（Streptomyces sp. wsbee2009112）已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏；保藏日期：2012年2月29日；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No. 5831。
2.根据权利要求1所述的一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述转化方法由以下步骤构成：
（1）制备出培养基；制备出孢子悬液；将孢子悬液接种到培养基中，在转速为200～280rpm、温度为22℃～30℃的摇床上培养2～5天或培养到培养基中糖浓度降到0.002～0.05%；
（2）往培养基中加入准备好的环糊精、维生素D、表面活性剂和有机溶剂混合制成的混合物，继续培养1～10天；
（3）培养基经过滤、萃取、浓缩、层析、分离后得到成品。
3.根据权利要求2所述的一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述培养基中环糊精的浓度为0.5～5g/L。
4.根据权利要求3中任一项所述的一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述环糊精与维生素D的重量比为5︰1～2︰1。
5.根据权利要求4所述的一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述培养基中表面活性剂的浓度为0.1～1g/L。
6.根据权利要求2～5任一项所述的一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述步骤（4）中环糊精采用β环糊精、γ-环糊精、环糊精衍生物、羟丙基-β-环糊精、糖基-β-环糊精和甲基化环糊精中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述步骤（4）中表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸非离子型表面活性酯。
8.根据权利要求7所述的一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述步骤（4）中有机溶剂为醇类有机溶剂。
9.根据权利要求8所述的一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述维生素D为维生素D2或维生素D3。
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