CN1876828A - 维生素d衍生物异构物的分离及异构化的方法 - Google Patents
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Abstract
一含有C－24羟基支键的维生素D衍生物，由于C－24位置为一对掌中心(chiral center)的碳原子，所以其维生素D衍生物含有C－24R羟基与C－24S羟基的两种异构物形式；其中，通常以C－24S羟基的结构具有较佳的生理活性。因此，本发明有关一种选择性酵素酯化或选择性酵素溶剂分解(solvolysis)一C－24羟基维生素D衍生物异构物的混合物方法，以分离出两种C－24R羟基与C－24S羟基的异构物。此外，本发明方法不仅易于纯化C－24R羟基与C－24S羟基的异构物，且更提供一种异构化反应，使C－24R羟基维生素D衍生物经由此方法可达到回收再利用的特色。
Description
技术领域
本发明是关于一种纯化一C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物的方法，尤指一种适用于选择性酵素酯化与选择性酵素溶剂分解、以及异构化反应的方法。
背景技术
目前具有生物活性的维生素D衍生物已陆续被开发出来，例如1α，25-dihydroxylvitaminD2的支链C-25羟基取代为C-24羟基，且不同支链的修饰与取代，可具有不同性质的药物活性。一C-24羟基维生素D衍生物的结构中，由于C-24位置为一对掌中心(chiral center)的碳原子，所以包含有C-24R羟基与C-24S羟基的两种异构物形式。其中，又以C-24S羟基维生素D衍生物具有较佳的生物活性。因此，传统上C-24羟基维生素D衍生物工艺的关键步骤即是分离出C-24羟基的两种异构物形式。然而，公知方法中，有人是将C-24酮基进行不对称还原反应、或利用合成法将具有正确位向的支键直接与维生素D骨架连结，但是由于反应条件过于严苛且反应时所需原料过于昂贵，导致生产成本提高，而不易量产。另有建议传统管柱层析的方法，由于C-24R羟基与C-24S羟基的异构物极性相当且结构差异不大，因此分离效果不彰，即应用性不佳。此外，有人采用酵素反应进行异构物位向的选择，但是传统方法中对于制程所获得的C-24R羟基维生素D衍生物大都不再处理而废弃。如此，不仅造成环境污染，亦增加工艺成本等问题。
因此，目前亟需一种用以纯化一C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物的方法，其不仅可有效地分离出C-24R羟基与C-24S羟基的异构物，且可将较不具有生物活性的C-24R羟基维生素D衍生物再回收利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种选择性酵素酯化一C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物的方法，其步骤包含有提供一C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物、将C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物与一酯化试剂溶于一有机溶剂中或直接溶于该酯化试剂中，而获得到一混合物、以及将一酵素(lipase)加入于上述的混合物中，进行选择性酯化反应后，即得到一C-24羟基维生素D衍生物的酯化异构物。
于本发明中所提及异构物的混合物是选自包括下列式(I)或式(II)的化合物：
其中，R1为氢或羟基保护基；且R2为C1-C6烷基、C3-C6环烷基、或C6-C12芳基。此外，R2较佳可为环丙烷基或异丙烷基。
另外，于本发明中所使用的有机溶剂是为直链或支链型碳数12以内的烷类、烷基酸烷基酯类、二烷基醚类、或其组合，且本发明较佳适用的有机溶剂可为hexane、diisoproyl ether、ethyl acetate、vinyl butyrate、tert-butylmethyl ether、diethyl ether或其组合。于本发明中所提及的酯化试剂是为酰卤素类(acyl halides)、酸酐类(acid anhydrides)、具有C2至C6低碳烷羧酸的乙烯酯类(vinyl esters)、或其组合，且较佳可为酰氯(acyl chloride)、醋酸酐(acetic anhydride)、醋酸乙烯酯(vinyl acetate)、丁酸乙烯酯(vinyl butyrate)、或其组合。由此，本发明能将C-24(R，S)羟基维生素D衍生物进行选择性酯化，而易于分离出异构物的混合物。
于本发明的一态样中，本发明选择性酵素酯化方法所使用的酵素可为公知任一种酵素，较佳可为产碱菌属脂肪酶(Alcaligenes sp.Lipase)、或假单胞菌属脂肪酶(Pseudomonas sp.Lipase)。此外，该酵素的使用可为一固定化(fixed)技术或一非固定化(free)技术。
一较佳具体例中，本发明C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物为[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol.，且该混合物的异构物被选择性酯化者为[5E，7E，22E，24(R)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
另一较佳具体例中，本发明C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物为[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol.，且该混合物的异构物被选择性酯化者为[5Z，7E，22E，24(R)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
为了增加本发明的应用，本发明选择性酵素酯化一C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物的方法可选择性含有一步骤，利用一管柱层析法，以便分离经由酵素酯化后的C-24-acetoxy维生素D衍生物的异构物、与未经酵素酯化后的C-24羟基维生素D衍生物异构物，而使本发明中所提的异构物的混合物可达到易于分离与纯化的目的。此外，本发明还可于上述选择性步骤后，可选择性地再包含另一步骤，是将上述管柱层析法分离所获得的C-24-acetoxy维生素D衍生物的酯化异构物进行一水解反应，以取得至少一C-24羟基维生素D衍生物的表异构物(epimer)。
于本发明的一具体例中，本发明C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物可为[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol，且经由酵素选择性酯化而利用管柱层析法分离后，即可分别获得[5E，7E，22E，24(R)]-24-acetoxy-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯、以及一表异构物(epimer)[5E，7E，22E，24(S)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。最后，将上述C-24-acetoxy异构物进行一水解反应，即可获得另一表异构物(epimer)[5E，7E，22E，24(R)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
在传统C-24羟基维生素D衍生物异构物的制备中，所产生较不具商业价值R-form的C-24羟基维生素D衍生物，大都废弃而不再回收处理。但是，上述本发明水解反应所获得的R-form的C-24羟基维生素D衍生物可更利用以下本发明异构化的化学反应，重新获得反应起始物C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物。此外，可再由上述本发明酵素酯化方法重新再合成出具有商业价值的S-form的C-24羟基维生素D衍生物。如此循环的反应路径，不仅可促使反应的回收率增加，且提高了本发明的产业利用性。
上述异构化方法是将上述本发明水解反应所获得的R-form的C-24羟基维生素D衍生物进行一Mitsunobu反应，而获得C-24(R，S)酯类维生素D衍生物异构化的混合物。其中，本发明Mitsunobu的反应条件可为公知的条件，较佳可将R-form的C-24羟基维生素D衍生物加入一酯化试剂、一有机酸与一非质子性溶剂存在的环境下，于-30℃至80℃的反应温度范围内，进行一异构化反应，而得到C-24(R，S)酯类维生素D衍生物异构物的混合物。最后，将C-24(R，S)酯类维生素D衍生物异构化的混合物进行一水解反应或一还原反应，可重新得到C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物。
于本发明的一具体例中，本发明是将表异构物(epimer)[5E，7E，22E，24(R)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol进行一Mitsunobu反应，而获得[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-酯类-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯的异构混合物。接着，再进行一水解反应或一还原反应，即重新得到可供进行选择性酵素酯化反应的起始产物[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
另一具体例中，本发明是将表异构物(epimer)[5Z，7E，22E，24(R)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol进行一Mitsunobu反应，而获得[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-酯类-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯的异构混合物。并且，再进行一水解反应或一还原反应，而重新得到可供进行选择性酵素酯化反应的起始产物[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
本发明亦提供一种用于选择性酵素溶剂分解(solvolysis)一C-24-acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物的方法，其包含有提供一C-24-acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物、将C-24-acetoxy异构物的混合物加入一含有一酵素、一缓冲剂与一溶剂的混合液中，进行选择性酵素溶剂分解(solvolysis)，以得到一溶剂分解后的C-24羟基维生素D衍生物的异构物与一未经酵素溶剂分解的C-24-acetoxy维生素D衍生物的异构物。最后，分离C-24羟基维生素D衍生物异构物与C-24-acetoxy维生素D衍生物的异构物即可。一具体例中，本发明是利用管柱层析法来分离两者，但不限于此方法。
本发明所适用的C-24-acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物是选自包括下列式(III)或式(IV)的化合物：
其中，R1为氢或是羟基保护基；R2为C1-C6烷基、C3-C6环烷基、或C6-C12芳基。此外，R2较佳可为环丙烷基或异丙烷基。
本发明选择性酵素溶剂分解(solvolysis)方法所使用的酵素是为产碱菌属脂肪酶(Alcaligenes sp.Lipase)、或假单胞菌属脂肪酶(Pseudomonas sp.Lipase)，且该酵素的使用可为一固定化(fixed)技术或一非固定化(free)技术。另外，于本发明中所适用的缓冲剂为水、低级烷醇类(lower alkylalcohol)、弱酸盐水溶液或其组合的溶液，较佳可为乙醇、含有磷酸盐的水溶液、或水。其中，低级烷(lower alkyl)是指一1至10个直链碳或支链碳型的烷基，且不限为环状或非环状结构。
上述本发明所提及的溶剂可为公知任一种溶剂，较佳可为直链或支链型碳数12以内的烷类、烷基酸烷基酯类、二烷基醚类、或其组合，且更佳适用的有机溶剂可为hexane、diisoproyl ether、ethyl acetate、vinyl butyrate、tert-butyl methylether或其组合。
于本发明的一具体例中，本发明C-24-acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物是为[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-酯类-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯，且该混合物的异构物可被选择性酵素溶剂分解者为[5E，7E，22E，24(R)]-24-酯类-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯。
另一具体例中，本发明C-24-acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物可为[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-酯类-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯，且该混合物的异构物可被选择性酵素溶剂分解者为[5Z，7E，22E，24(R)]-24-酯类-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯。
为了获得C-24(S)羟基维生素D衍生物异构物，本发明选择性酵素溶剂分解的方法可选择性地还包含一步骤，将未经酵素溶剂分解的C-24(S)-acetoxy维生素D衍生物的异构物进行一水解反应，以得到一C-24(S)羟基维生素D衍生物的表异构物(epimer)。
然而，为了回收经由选择性酵素溶剂分解后的C-24(R)羟基维生素D衍生物异构物，本发明选择性酵素溶剂分解的方法亦可选择性地还包含一步骤，将C-24(R)羟基维生素D衍生物异构物进行一Mitsunobu反应，而获得C-24(R，S)酯类维生素D衍生物异构物的混合物。最后，将C-24(R，S)酯类维生素D衍生物异构物的混合物进行一水解反应或一还原反应，即可获得C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物。由此，可将选择性酵素solvolysis后较不具价值C-24(R)羟基维生素D衍生物异构物，再次反应而重新获得C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物，以提升本发明的回收率并增加产业的应用性。在此，所提及的Mitsunobu反应可如同前述本发明异构化反应的条件。
本发明还提供一种异构化一立体异构物(stereoisomer)的方法，其包括的步骤有提供一C-24羟基维生素D衍生物的异构物、将该立体异构物在一酯化试剂、一有机酸与一非质子性溶剂的存在下，于-30℃至80℃的反应温度内，进行一异构化反应，以得到一C-24(R，S)-酯类维生素D衍生物异构物的混合物、且最后将上述C-24(R，S)-酯类维生素D衍生物异构物的混合物进行一水解反应或一还原反应，以得到一C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物。
上述本发明异构化方法所提及的异构物是为下列式(Ia)或式(IIa)：
其中，R1为氢或是羟基保护基，与R2为C1-C4烷基、C3-C6环烷基，或C6-C12芳基。
本发明中任何所提及的酯化试剂可为公知Mitsunobu反应所需的组成，较佳可包含一膦化物(phosphine)、与一偶氮化合物。一较佳具体例中，膦化物可为一具有下列化学式的化合物：
(R)3-P
其中，R可为C1-C4烷基、C3-C6环烷基，或C6-C12芳基。偶氮化合物较佳地可为一具有下列化学式的化合物：
其中，R9与R10独立地分别可为C1-C4烷基、C3-C6环烷基，或C6-C12芳基，更佳的偶氮化合物可为diisopropyl azodicarboxylate(DIAD)、diethylazodicarboxylate(DEAD)或其组合。
另外，本发明所适用的有机酸可不限其种类，较佳可为含有羧酸(Carboxylic Acid)的化合物；更佳可为含有C1-C6的饱和酸(aliphatic acid)、或含有苯环的有机酸(aromatic acid)，其化学式可如下所示：
其中，R1、R2、R3、R4及R5可分别独立为H、NO2、OCH3、CH3或卤素。然而，本发明最适用的有机酸可为benzoic acid、chloroacetic acid、o-anisic acid、3-nitrobenzoic acid、3，5-dinitrobenzoic acid或其组合。
再者，于本发明所使用的非质子性溶剂可为公知任一种非质子性溶剂，较佳可为四氢呋喃、甲苯、二甲基甲酰胺(N，N-dimethyl formamide)或其组合。
其中，本发明中任何水解反应的条件可为公知水解反应条件，并不限于酸性或碱性水解，较佳可为一碱性水解反应，更佳为一碱金族或碱土族氢氧化物水解反应。
本发明中所提及的任何还原反应的条件，可为任何公知任一种还原试剂，较佳可为硼氢化物、或金属氢化物，更佳可为硼氢化钠、四氢化锂铝(LiAlH4)或其组合。
再者，本发明所提及的选择性酵素酯化或选择性酵素溶剂分解反应，其反应温度无限制，较佳可介于10至60℃的范围，且更佳可介于20至40℃的范围。另外，其反应时间亦无限制，较佳可介于1至100小时的反应时间，且更佳可介于42至72小时。
对于C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物，于本发明一态样中，本发明选择性酵素酯化反应可使特定位向的异构物达到80mole％以上的酯化效果，而另一位向的异构物则不超过20mole％(diastereomer ratio80∶20)。此外，反应参数可取决本发明选择性酵素酯化的成效。一较佳具体例中，本发明选择性酯化的成效diastereomer ratio可达90∶10以上。一更佳具体例中，选择性酯化的成效diastereomer ratio可达95∶5以上。
于本发明的另一态样中，本发明选择性酵素溶剂分解(solvolysis)反应可使特定位向的异构物达到80mole％以上的分解效果，而另一位向的异构物则不超过20mole％(diastereomer ratio 80∶20)。此外，反应参数亦可取决本发明选择性酵素溶剂分解(solvolysis)的成效。一较佳具体例中，本发明选择性solvolysis成效其异构物比例可达90∶10以上。一更佳具体例中，选择性酯化的成效其异构物比例可达95∶5以上。
本发明方法不仅有效地分离出C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物，且将C-24(R)羟基维生素D衍生物异构物重新回收再利用后，即可再次生成R-form与S-form的C-24羟基维生素D衍生物异构物。因此，本发明除了降低制程成本，亦可减少废弃物的排放，且提升C-24(S)羟基维生素D衍生物异构物的总产率。
具体实施方式
本发明选择性酵素酯化或选择性酵素溶剂分解的反应过程中，皆可利用HPLC及TLC检测其反应程度。其中，本发明实施例中是使用JasscoHPLC(si-60，250×4mm；5μm)，其分析条件为ethyl acetate/hexane＝1/10进行分析。藉由HPLC可分析生成物C-24(R，S)的diastereomeric excess(d.e.值)，进而可决定其反应终点。当d.e.值大于80％时，即可结束反应的进行，且最佳的反应终点其d.e.值可大于95％。待反应结束后，即可利用一般过滤法将酵素分离，如离心过滤或抽真空过滤，并且再浓缩滤液，即获得粗产物。最后，再利用管柱层析法分离出不同结构的异构物。
A.选择性酵素酯化
本发明选择性酵素酯化的方法，可参照下列反应路径1所示。其中，C-24羟基维生素D衍生物的A ring上具有-OH基时，并不会同时与C-24(R)OH发生竞争性的酯化反应，即C-24羟基维生素D衍生物其A ring上的-OH基，并不会发生选择性酵素酯化反应。因此，无论C-24羟基维生素D衍生物其A ring上的-OH基是否接上保护基，都不影响本发明对于C-24羟基的选择性酵素酯化反应。一具体例中，本发明所使用的保护基为第三丁基二甲基硅氧基(tert-butyldimethylsilyl)。
反应路径1
实施例一
提供10g(19.5mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl，且此混合物R∶S异构物比为56∶36。将上述10g异构物的混合物与10mL vinylacetate(107.5mmol)一并加入10mL正己烷后，再加入1.0g Alcaligenes sp.Lipase以非固定化方式反应，然后在35℃下持续搅拌反应。利用HPLC(厂牌：Jassco，冲提管柱：si-60，250×4mm；5μm)分析反应状态，当混合物中C-24(R)羟基异构物几乎完全转换成酯类时，即停止反应，其反应时间约为48小时。经由HPLC分析结果，本反应的diastereomeric excess值(d.e.值)可达90％以上。
过滤反应完的溶液，并浓缩干燥的，即获得一粗产物。然后，利用管柱层析法分离与纯化此粗产物，在此系使用silica gel为冲提管柱，冲提液为含有6.0％ethyl acetate(EA)的hexane溶液，经分段收集及浓缩后获得5.4g C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)与2.3g C-24(S)羟基化合物(Ib)。其中，C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)的NMR(200MHz，CDCl3)6：2.05(s，3H，CH3)、3.80～3.85(m，1H，3-H)、4.62～4.70(m，2H，19-H&24-H)、4.90(s，1H，19-H)、5.28～5.39(m，1H，22-H)、5.41～5.63(m，1H，23-H)、5.82(d，1H，J＝11.4Hz，6-H)、6.44(d，1H，J＝11.4Hz，7-H)。C-24(S)羟基化合物(Ib)的NMR(200MHz，CDCl3)6：3.42～3.44(br，1H，24-H)、3.82～3.84(m，1H，3-H)、4.62(s，1H，19-H)、4.90(s，1H，19-H)、5.42～5.54(m，2H，22-H&23-H)、5.83(d，1H，J＝11.4Hz，6-H)、6.44(d，1H，J＝11.4Hz，7-H)。
实施例二
本实施例步骤相同于实施例一，除了取1.0g Alcaligenes sp.Lipase与4g作为载体(carrier)的Eupergit C(Rohm，Germany)以固定化方式反应，且反应物的摩尔数略作调整。本实施例是取0.6g(1.17mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。另外，以1.0mL(10.8mmol)vinylacetate作为乙酰化试剂，而以1mL hexane为溶剂。在35℃下搅拌6小时后，以HPLC分析反应结果，即含有30％C-24(R)羟基维生素D衍生物异构物(Ia)、35％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、与35％C-24(S)羟基化合物(Ib)。
实施例三
本实施例步骤相同于实施例一，除了将有机溶剂改用为2mLdiisopropyl ether，且反应物的摩尔数略作调整。本实施例是取1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。另外，取2mL(21.6mmol)vinyl acetate作为乙酰化试剂，而采用非固定化100mg Alcaligenes sp.Lipase作为反应酵素。室温下搅拌42小时后，以HPLC分析反应结果，所获得的粗产物含有56％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、与35％C-24(S)羟基化合物(Ib)。
实施例四
本实施例步骤相同于实施例一，除了直接将20mL(216mmol)vinylacetate的乙酰化试剂作为有机溶剂的外，且反应物的摩尔数略作调整。本实施例是取1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl，并且以非固定化方式取100mg Alcaligenes sp.Lipase为反应酵素。室温下搅拌42小时后，以HPLC分析反应结果，所获得的粗产物含有56％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、与35％C-24(S)羟基化合物(Ib)。
实施例五
本实施例步骤相同于实施例一，除了将有机溶剂改用为2mL tert-butylmethyl ether，且反应物的摩尔数略作调整。本实施例是取1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。另外，取2mL(21.6mmol)vinyl acetate作为乙酰化试剂，而采用非固定化100mg Alcaligenes sp.Lipase作为反应酵素。室温下搅拌42小时后，以HPLC分析反应结果，所获得的粗产物含有56％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、与35％C-24(S)羟基化合物(Ib)。
实施例六选择性酵素酯化
本实施例步骤相同于实施例一，除了将有机溶剂改用为15mL carbontetrachloride，且反应物的摩尔数略作调整。本实施例是取1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。另外，取4.4mL(47.5mmol)vinyl acetate作为乙酰化试剂，而采用非固定化100mg Alcaligenes sp.Lipase作为反应酵素。室温下搅拌20小时后，以HPLC分析反应结果，所获得的粗产物含有54％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、与34％C-24(S)羟基化合物(Ib)。
实施例七
本实施例步骤相同于实施例一，除了改用非固定化100mgPseudomonas sp.Lipase作为反应酵素，carbon tetrachloride为溶剂，且反应物的摩尔数略作调整。本实施例是取1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。另外，以2mL(21.6mmol)vinylacetate作为乙酰化试剂，而以2mL carbon tetrachloride为溶剂。室温下搅拌42小时后，以HPLC分析反应结果，所获得的粗产物含有54％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、与34％C-24(S)羟基化合物(Ib)。
实施例八
本实施例步骤相同于实施例一，除了乙酰化试剂为10mL(0.109mol)vinyl butyrate，以87mL hexane为溶剂，且反应酵素为非固定化的500mgPseudomonas sp.Lipase。其中，本实施例使用5g(9.7mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。在35℃下搅拌50小时后，以HPLC分析反应结果，所获得的粗产物含有类似C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)结构的54％C-24(R)butanoate化合物、与34％C-24(S)羟基化合物(Ib)。
实施例九
本实施例步骤相同于实施例一，除了有机溶剂为10mL Ethylacetate(EA)，使用2mL(21.6mmol)vinyl acetate为乙酰化试剂，且以非固定化500mg Pseudomonas sp.Lipase作为反应酵素。本实施例使用5g(9.7mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。在35℃下搅拌8小时后，以HPLC分析反应结果，所获得的粗产物含有30％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、34％C-24(S)羟基化合物(Ib)、以及26％未参与反应的C-24(R)羟基化合物(Ia)。
实施例十
本实施例步骤相同于实施例一，除了有机溶剂为10mL tert-butylmethyl ether，以10mL(108mmol)vinyl acetate为乙酰化试剂，且以非固定化500mg Pseudomonas sp.Lipase作为反应酵素。本实施例使用5g(9.7mmol)如式(Ia)的C-24(R)羟基维生素D衍生物异构物，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。在35℃下搅拌80小时后，以HPLC分析反应结果，即获得99％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)。
实施例十一
本实施例步骤相同于实施例一，除了以非固定化100mg Pseudomonassp.Lipase作为反应酵素。其中，本实施例的乙酰化试剂为2mL(21.6mmol)vinyl acetate，且有机溶剂为2mL hexane。本实施例使用1g(1.95mmol)如式(II)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。在室温下搅拌48小时后，以HPLC分析反应结果，其生成物即含有54％C-24(R)acetoxy化合物(IVa)、与34％C-24(S)羟基化合物(IIb)。
实施例十二
本实施例步骤相同于实施例一，除了以非固定化1g Pseudomonas sp.Lipase作为反应酵素，且加入过量的乙酰化试剂。其中，本实施例的乙酰化试剂为2mL(21.6mmol)vinyl acetate，且有机溶剂为2mL ethyl acetate。本实施例使用0.1g(0.195mmol)如式(II)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为H；R2为cyclopropyl。在室温下搅拌80小时后，以HPLC分析反应结果，其生成物即含有56％C-24(R)acetoxy化合物(IVa)、与35％C-24(S)羟基化合物(IIb)。由本实施例可证实，即使维生素D衍生物于A ring上具有-OH基，仍不会发生酯化反应，所以本发明的方法只会在C-24(R)羟基位置上进行选择性酵素酯化反应。
实施例十三
本实施例步骤相同于实施例一，除了有机溶剂为2mL tert-methylbutyl ether，使用2mL(21.6mmol)vinyl acetate为乙酰化试剂，且以非固定化100mg Pseudomonas sp.Lipase作为反应酵素。本实施例使用1g(1.95mmol)如式(II)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。在35℃下搅拌48小时后，以HPLC分析反应结果显示，C-24(R)羟基化合物几乎已转换为C-24(R)acetoxy化合物(IVa)，而剩余未经酯化的C-24(S)羟基化合物(IIb)其diastereomeric excess值[(S-R/S+R)×100％，在此S为C-24(S)羟基化合物(IIb)，R为C-24(R)羟基化合物(IIa)]大于80％以上。最后，将生成物进行管柱层析，利用silica gel为层析管柱，且冲提液为含有6.0％EA的hexane溶液，经分段收集及浓缩后获得0.54g C-24(R)acetoxy化合物(IVa)与0.23g C-24(S)羟基化合物(IIb)。
实施例十四
本实施例步骤相同于实施例一，除了以非固定化100mg Pseudomonassp.Lipase作为反应酵素。其中，本实施例的乙酰化试剂为2mL(21.6mmol)vinyl acetate，且有机溶剂为2mL hexane。本实施例使用1g(1.95mmol)如式(II)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R∶S＝55∶32)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为isopropyl。在室温下搅拌48小时后，以HPLC分析反应结果，其生成物即含有52％C-24(R)acetoxy化合物(IVa)、与30％C-24(S)羟基化合物(IIb)。
B.选择性酵素溶剂分解(solvolysis)
本发明在进行选择性酵素溶剂分解的前，可由C-24-羟基维生素D衍生物异构物的混合物先进行传统的酯化反应后，而得到C-24acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物。或者，直接取C-24acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物进行选择性酵素溶剂分解。其反应步骤可如反应路径2所示。其中，式(I)的化合物经由一传统的酯化反应，而生成式(III)的化合物，且其酯化试剂可为公知的任一种酯化试剂。一具体例中，本发明采用aceticanhydride作为酯化试剂，但不限于此。相同地，式(II)的化合物系经由一传统的酯化反应，而生成式(IV)的化合物。
反应路径2：选择性酵素溶剂分解
实施例十五
首先，提供1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl，且此混合物R∶S异构物比为56∶36。将上述1g异构物的混合物溶入8mL pyridine中，再加入0.4mL acetic anhydride(4.2mmol)，且于室温下搅拌24小时。反应后所得的混合物以10mL hexane进行萃取，取得有机相溶液，再将溶剂挥发即获得如式(III)的0.8g C-24(R，S)acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物。
取上述如式(III)的C-24(R，S)acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物进行选择性酵素solvolysis反应。将100mg(0.23mmol)C-24(R，S)acetoxy维生素D衍生物异构物(R∶S＝56∶36)、0.2mL Ethanol、2mL hexane、以及500mg非固定化的Pseudomonas sp.Lipase混合搅拌，并于35℃下反应180小时。反应所得的生成物经由HPLC分析的结果，其含有50％C-24(R)羟基化合物(Ia)与34％C-24(S)acetoxy化合物(IIIb)。
实施例十六
将100mg(0.23mmol)如式(III)的C-24(R，S)acetoxy维生素D衍生物异构物(R∶S＝56∶36)、5mL水、1.5mL hexane、以及250mg非固定化的Pseudomonas sp.Lipase混合搅拌，并于室温下反应500小时，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。反应所得的生成物经由HPLC分析的结果，其含有50％C-24(R)羟基化合物(Ia)与25％C-24(S)acetoxy化合物(IIIb)。
实施例十七
首先，提供1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl，且此混合物R∶S异构物比为56∶36。保持一低于20℃的环境下，将上述1g异构物的混合物溶入10mL pyridine与0.05g DMAP(0.39mmol，4-dimethylaminopyridine)中，再加入0.4mL acetic anhydride(4.2mmol)进行反应。反应后所得的混合物以10mL hexane进行萃取，取得有机相溶液，再将溶剂挥发即获得如式(III)的0.8g C-24(R，S)acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物。
取上述如式(III)的C-24(R，S)acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物进行选择性酵素solvolysis反应。将100mg(0.23mmol)C-24(R，S)acetoxy维生素D衍生物异构物(R∶S＝56∶36)、1.2mL磷酸钾缓冲溶液(pH＝7.0)、2mL acetone或2mL THF、以及200mg非固定化的Pseudomonas sp.Lipase混合搅拌，并于室温下反应78小时。反应所得的生成物经由HPLC分析的结果，其含有56％C-24(R)羟基化合物(Ia)与约35％C-24(S)acetoxy化合物(IIIb)。
实施例十八
首先，提供1g(1.mmol)如式(I)的C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为isopropyl，且此混合物R∶S异构物比为54∶32。将上述1g异构物的混合物溶入8mL pyridine中，再加入0.4mL acetic anhydride(4.2mmol)，且于室温下搅拌24小时。反应后所得的混合物以10mL hexane进行萃取，取得有机相溶液，再将溶剂挥发即获得如式(III)的0.8g C-24(R，S)acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物。
取上述如式(III)的C-24(R，S)acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物进行选择性酵素solvolysis反应。将100mg(0.23mmol)C-24(R，S)acetoxy维生素D衍生物异构物(R∶S＝56∶36)1、0.2mL Ethanol、2mL hexane、以及500mg非固定化的Pseudomonas sp.Lipase混合搅拌，并于35℃下反应180小时。反应所得的生成物经由HPLC分析的结果，其含有约50％C-24(R)羟基化合物(Ia)与约34％C-24(S)acetoxy化合物(IIIb)。
C.异构化反应(Epimerization)
C-24(R，S)羟基的维生素D衍生物，经由本发明酵素选择性酯化方法、或先形成酯类再进行酵素选择性solvolysis方法后，可利用管柱层析法，成功地分离出R-form与S-form两种异构物。其中，本发明更提供一化学合成途径，使较不具商业价值的C-24(R)羟基异构物经由一Mitsunobu反应以及一水解或还原反应，而重新异构化生成C-24(R)羟基及C-24(S)羟基的混合物。由此，可达到回收再利用的效果，并降低成本、减少废弃物及提高产率。本发明异构化反应系如下列反应路径3所示。
反应路径3
实施例十九
[5E，7E，22E，24(R)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol的异构化反应
首先，提供一如式(I a)1.10g(2.15mmol)的C-24(R)羟基化合物(d.e.值＞92％)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。将此化合物与1.13g(4.31mmol)triphenyl phosphine、0.41g(4.33mmol)chloroacetic acid(其溶解于10mL除水tetrahydrofuran)混合后，再将所得的混合物加入一含有0.87g(4.30mmol)diisopropyl azodicarboxylate的3mL除水tetrahydrofuran溶液中。然后，将反应物冷却至-10℃，搅拌1小时。反应结束后，每次以20mL hexane萃取三次后，将有机相溶液以减压浓缩方式取得1.5g含有如式(III)的C-24(R，S)酯类化合物的粗产物。
接着，将上述产物溶解于5mL ethyl acetate、10mL methanol、2mL水以及0.2g碳酸钾的溶液中，进行水解反应。所获得的混合物在室温下搅拌1小时，即以减压浓缩方式挥发有机溶剂，再以ethyl acetate(5ml)及水(5ml)进行萃取、分层后，有机层进行减压浓缩后，即获得1.0g内含约71％如式(I)的C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl)，且此混合物d.e.值约为-1.41％。
实施例二十
首先，提供一如式(Ia)1.0g(1.95mmol)的C-24(R)羟基化合物(d.e.值＞92％)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。将此化合物与1.03g(3.92mmol)triphenyl phosphine、0.60g(3.92mmol)o-Anisic acid(其溶解于5mL除水tetrahydrofuran)混合后，再将所得的混合物加入一含有0.79g(3.92mmol)diisopropyl azodiearboxylate的3mL除水tetrahydrofuran溶液中。然后，将反应物冷却至-10℃，搅拌1小时。反应结束后，每次以20mLhexane萃取三次后，将有机相溶液以减压浓缩方式取得1.5g含有如式(III)的C-24(R，S)酯类化合物的粗产物。
接着，将上述产物溶解于5mL ethyl acetate、10mL methanol、2mL水以及0.2g氢氧化钾的溶液中，进行水解反应。所获得的混合物在室温下搅拌1小时，即以减压浓缩方式挥发有机溶剂，再以Ethyl acetate(5ml)及水(5ml)进行萃取、分层后，有机层进行减压浓缩后，即获得1.0g内含约70％如式(I)的C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl)，且此混合物d.e.值约为-26％。
实施例二十一
首先，提供一如式(Ia)1.0g(1.95mmol)的C-24(R)羟基化合物(d.e.值＞92％)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。将此化合物与1.03g(3.92mmol)triphenyl phosphine、0.48g(3.90mmol)benzoic acid(其溶解于5mL除水tetrahydrofuran)混合后，再将所得的混合物加入一含有0.79g(3.92mmol)diisopropyl azodicarboxylate的3mL除水tetrahydrofuran溶液中。然后，将反应物冷却至-10℃，搅拌1小时。反应结束后，每次以20mLhexane萃取三次后，将有机相溶液以减压浓缩方式取得1.35g含有如式(III)的C-24(R，S)酯类化合物的粗产物。
接着，将上述产物溶解于5mL ethyl acetate、10mL methanol、2mL水以及0.2g氢氧化钾的溶液中。所获得的混合物在室温下搅拌1小时，即以减压浓缩方式挥发有机溶剂，再以Ethyl acetate(5ml)及水(5ml)进行萃取、分层后，有机层进行减压浓缩后，即获得1.1g内含约87.6％如式(I)的C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl)，且此混合物d.e.值约为-24.9％。
实施例二十二
首先，提供一如式(Ia)1.0g(1.95mmol)的C-24(R)羟基化合物(d.e.值＞92％)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。将此化合物与1.03g(3.92mmol)triphenyl phosphine、0.65g(3.90mmol)3-nitrobenoic acid(其溶解于5mL除水tetrahydrofuran)混合后，再将所得的混合物加入一含有0.79g(3.92mmol)diisopropyl azodicarboxylate的3mL除水tetrahydrofuran溶液中。然后，将反应物冷却至-10℃，搅拌1小时。反应结束后，每次以20mL hexane萃取三次后，将有机相溶液以减压浓缩方式取得1.5g含有如式(III)的C-24(R，S)酯类化合物的粗产物。
接着，将上述产物溶解于5mL除水tetrahydrofuran中，并加入0.5mLLiAlH4(浓度为1M且溶解于HF中)，在室温下搅拌1小时，以进行还原反应。然后，再加入10mL的5％KOH溶液，即结束反应。取反应后的混合物每次以20mL hexane进行萃取(3次)，再收集萃取后的有机溶液，以减压浓缩方式挥发有机溶剂，即获得0.8g内含约99％如式(I)的C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl)，且此混合物d.e.值约为-16.77％。
实施例二十三
首先，提供一如式(II a)1.10g(2.15mmol)的C-24(R)羟基化合物(d.e.值＞92％)，其中R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl。将此化合物与1.13g(4.3lmmol)triphenyl phosphine、0.41g(4.33mmol)chloroacetic acid(其溶解于10mL除水tetrahydrofuran)混合后，再将所得的混合物加入一含有0.87g(4.30mmol)diisopropyl azodicarboxylate的3mL除水tetrahydrofuran溶液中。然后，将反应物冷却至0℃，搅拌1小时。反应结束后，每次以20mL hexane萃取三次后，将有机相溶液以减压浓缩方式取得1.5g含有如式(IV)的C-24(R，S)酯类化合物的粗产物。
接着，将上述产物溶解于5mL ethyl acetate、10mL methanol、以及2mL的水中，并加入0.2g碳酸钾，在室温下搅拌1小时，以进行水解反应，即以减压浓缩方式挥发有机溶剂，再以Ethyl acetate(5ml)及水(5ml)进行萃取、分层后，有机层进行减压浓缩后，即获得0.85g内含约65％如式(II)的C-24(R，S)羟基维生素D衍生物异构物的混合物(R1为tert-butyldimethylsilyl；R2为cyclopropyl)，且此混合物d.e.值约为-1.0％。
实施例二十四至四十一
实施例二十四至四十一的反应步骤是相同于实施例十九的方法。其中，各实施例的反应条件与结果如表1所示。
表1：
| 实施例 | 有机酸 | 起始物 | 有机溶剂3 | 反应温度(℃) | 时间(小时) | 异构混合物的纯度(％) | d.e.4，5(％) | 初产率％ |
| 24 | Choroaceticacid | Ia1 | THF | 60 | 0.5 | 60 | 1 | 70 |
| 25 | Choroaceticacid | Ia1 | THF | RT | 1 | 70 | -1.4 | 95 |
| 26 | Choroaceticacid | Ia1 | DMF | -10 | 2 | 35 | -1.0 | 30 |
| 27 | Choroaceticacid | Ia1 | Tol | -10 | 6 | 71 | -1.2 | 85 |
| 28 | Benzoicacid | Ia1 | THF | 60 | 0.5 | 65 | -20 | 60 |
| 29 | Benzoicacid | Ia1 | THF | RT | 0.5 | 85 | -24 | 90 |
| 30 | Benzoicacid | Ia1 | DMF | -10 | 8 | 50 | -24 | 60 |
| 31 | Benzoicacid | Ia1 | Tol | -10 | 1 | 85 | -23.2 | 80 |
| 32 | o-Anisicacid | Ia1 | THF | 60 | 1 | 50 | -20 | 65 |
| 33 | o-Anisicacid | Ia1 | THF | RT | 1 | 70 | -25 | 88 |
| 34 | o-Anisicacid | Ia1 | THF | -10 | 1 | 70 | -26 | 100 |
| 35 | o-Anisicacid | Ia1 | DMF | -10 | 12 | 40 | -10 | 45 |
| 36 | o-Anisicacid | Ia1 | Tol | -10 | 4 | 70 | -24 | 85 |
| 37 | 3-nitrobenzoicacid | Ia1 | THF | 60 | 0.5 | 65 | -16 | 35 |
| 38 | 3-nitrobenzoicacid | Ia1 | THF | RT | 0.5 | 95 | -16 | 80 |
| 39 | 3-nitrobenzoicacid | Ia1 | DMF | -10 | 2 | 80 | -10 | 45 |
| 40 | 3-nitrobenzoicacid | Ia1 | Tol | -10 | 6 | 80 | -16 | 85 |
| 41 | 3，5-dinitrobenzoicacid | IIa2 | THF | -10 | 3 | 80 | -15.2 | 75 |
注：
1.化合物Ia其D.E.值(diastereomeric excess)为92％
2.化合物IIa其D.E.值为92％
3.THF为tetrahyrofuran，Tol为toluene，DMF为N，N-dimethylformanamide
4.D.E(％)：[(Ia-Ib)/(Ia+Ib)]×100％
5.D.E(％)：[(IIa-IIb)/(IIa+IIb)]×100％
异构化反应(Epimerization)于每一实施例中所提及的维生素D衍生物，其C-24位置R-form与S-form的比值，皆为其C-24(R，S)酯类的维生素D衍生物进行水解或还原后，而形成C-24(R，S)羟基维生素D衍生物，再经由HPLC分析所得到的结果。抑或，直接以HPLC来分析C-24(R，S)羟基维生素D衍生物的R-form与S-form的比值。
上述实施例仅为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请专利范围所述为准，而非仅限于上述实施例。
Claims (18)
1.一种用于选择性酵素酯化一C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物的方法，其包括下列步骤：
(a)提供一C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物，其中该异构物的混合物选自包括下列式(I)或式(II)的化合物：
其中，R1为氢或是羟基保护基；R2为C1-C6烷基、C3-C6环烷基、或C6-C12芳基；
(b)将该C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物与一酯化试剂溶于一有机溶剂中或直接溶于该酯化试剂中，以得到一混合物；以及
(c)将一酵素加入于该混合物中，进行选择性酯化反应，以得到一C-24羟基维生素D衍生物的酯化异构物；
其中，该有机溶剂为直链或支链型碳数12以内的烷类、烷基酸烷基酯类、二烷基醚类、或其组合；且该酯化试剂为酰卤素类、酸酐类、具有C2至C6低碳烷羧酸的乙烯酯类、或其组合。
2.如权利要求1的方法，其中该酵素为产碱菌属脂肪酶、或假单胞菌属脂肪酶。
3.如权利要求1的方法，其中该C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物为[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol、或[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
4.如权利要求3的方法，其中该C-24羟基维生素D衍生物的异构物可被选择性酯化者为：
[5E，7E，22E，24(R)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol；或
[5Z，7E，22E，24(R)]-24-环丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
5.如权利要求1的方法，其中该酯化试剂为酰氯、醋酸酐、醋酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、或其组合。
6.如权利要求1的方法，其中还包括一步骤(d)，利用一管柱层析法，以分离一经由酵素酯化C-24-acetoxy维生素D衍生物的异构物与该未经酵素酯化的C-24羟基维生素D衍生物异构物。
7.如权利要求6的方法，其中还包括一步骤(e)，将由该管柱层析法分离所得的该C-24-acetoxy维生素D衍生物的异构物进行水解反应，以得到至少一C-24羟基维生素D衍生物的表异构物。
8.如权利要求7的方法，其中还包括下列步骤：(f)在一酯化试剂、一有机酸与一非质子性溶剂的存在下，于-30℃至80℃的温度内，将该至少一C-24羟基维生素D衍生物的表异构物进行一异构化反应，以得到一C-24-酯类维生素D衍生物异构物的混合物；以及(g)将该C-24-酯类维生素D衍生物异构物的混合物进行水解反应或是还原反应，以重新得到该C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物。
9.如权利要求8的方法，其中该酯化试剂包含：(i)一膦，其具有下列的化学式：
(R)3-P
其中，R为C1-C4烷基、C3-C6环烷基，或C6-C12芳基；以及
(ii)一偶氮化合物，其具有下列的化学式：
其中，R9与R10独立地为C1-C4烷基、C3-C6环烷基，或C6-C12芳基。
10.一种用于选择性酵素溶剂分解一C-24-acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物的方法，其包括下列步骤：
(a)提供一C-24-acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物，其中该C-24-acetoxy异构物的混合物选自包括下列式(III)或式(IV)的化合物：
其中，R1为氢或是羟基保护基；R2为C1-C6烷基、C3-C6环烷基、或C6-C12芳基；
(b)将C-24-acetoxy异构物的混合物加入一含有一酵素、一缓冲剂与一溶剂的混合液中，进行选择性酵素溶剂分解，以得到一溶剂分解后的C-24羟基维生素D衍生物的异构物与一未经酵素溶剂分解的C-24-acetoxy维生素D衍生物的异构物；以及
(c)分离该C-24羟基维生素D衍生物异构物与该C-24-acetoxy维生素D衍生物的酯化异构物；
其中，该酵素为产碱菌属脂肪酶、或假单胞菌属脂肪酶；且该缓冲剂为水、烷醇类、弱酸盐水溶液或其组合。
11.如权利要求10的方法，其中该C-24-acetoxy维生素D衍生物异构物的混合物为：
[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-acetoxy-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯；或
[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-acetoxy-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯。
12.如权利要求10的方法，其中该C-24-acetoxy维生素D衍生物的异构物可被选择性酵素溶剂分解者为：
[5E，7E，22E，24(R)]-24-actoxy-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯；或
[5Z，7E，22E，24(R)]-24-acetoxy-24-环丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯。
13.如权利要求10的方法，其中还包括一步骤(d1)，将该未经酵素溶剂分解的C-24-acetoxy维生素D衍生物的异构物进行一水解反应，以得到至少一C-24羟基维生素D衍生物的表异构物。
14.如权利要求10的方法，其中还包括一步骤(d2)，在一酯化试剂、一有机酸与一非质子性溶剂的存在下，于-30℃至80℃的温度内，将该溶剂分解后的C-24羟基维生素D衍生物异构物进行一异构化反应，以得到一C-24-酯类维生素D衍生物异构物的混合物；以及(e)，将该异构物的混合物进行水解或还原反应，以重新得到该C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物。
15.如权利要求14的方法，其中该酯化试剂包含：
(i)一膦，其具有下列的化学式：
(R)3-P
其中，R为C1-C4烷基、C3-C6环烷基，或C6-C12芳基；以及
(ii)一偶氮化合物，其具有下列的化学式：
其中，R9与R10独立地为C1-C4烷基、C3-C6环烷基、或C6-C12芳基。
16.如权利要求10的方法，其中该步骤(c)的分离由一管柱层析法进行。
17.一种异构化一立体异构物的方法，包括的步骤有：
(a)提供一C-24羟基维生素D衍生物异构物，其中该异构物为下列式(Ia)或式(IIa)：
其中，R1为氢或是羟基保护基，与R2为C1-C4烷基、C3-C6环烷基，或C6-C12芳基；
(b)在一酯化试剂、一有机酸与一非质子性溶剂的存在下，于-30℃至80℃的温度内，将该立体异构物进行一异构化反应，以得到一C-24-酯类维生素D衍生物异构化的混合物；以及
(c)将该C-24-酯类维生素D衍生物异构化的混合物进行水解反应或是还原反应，以得到一C-24羟基维生素D衍生物异构物的混合物。
18.如权利要求17的方法，其中该酯化试剂包含：
(i)一膦，其具有下列的化学式：
(R11)3-P
其中，R11为C1-C4烷基、C3-C6环烷基，或C6-C12芳基；以及
(ii)一偶氮化合物，其具有下列的化学式：
其中，R9与R10独立地为C1-C4烷基、C3-C6环烷基，或C6-C12芳基。
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