CN111057661A - 25-羟基维生素d3生产菌株及其筛选方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及25‑羟基维生素D3生产菌株及其筛选方法与应用，属于生物工程技术领域。所述25‑羟基维生素D3生产菌株的保藏编号为：CCTCC M 2019385，保藏日期为：2019年5月23日。上述菌株可应用于高效转化底物维生素D3合成25‑羟基维生素D3。经本发明筛选出的菌株转化维生素D3效率高，易培养，易于工业化放大。

Description

25-羟基维生素D3生产菌株及其筛选方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及25-羟基维生素D3生产菌株及其筛选方法与应用。
背景技术
25羟基维生素D3(以下简称25OH-VD3)，维持和调节机体钙磷的正常代谢,促进钙、磷的吸收，维持血钙、血磷水平,保持骨骼的正常生长发育,临床上用于治疗佝偻病、软骨症等疾病。在养殖业中，25OH-VD3可以促进骨骼的发育，提高肉鸡增重速度、增强饲料转化效率、降低死淘率、改善肌肉嫩度、提高加工性能和产肉率。
目前，25OH-VD3的生产工艺主要有化学合成法、光照射法，化学反应步骤繁琐、需要卤素试剂、反应过程中产生外消旋体，分离难度大。其中卤素化合物的残留不容忽视。光化学照射法原料为25-羟基-7-去氢胆固醇，但是该化合物同样需要多步化学反应获取，来源受限。而生物转化法可以很好的避免污染环境、中间试剂残留等问题，由于25OH-VD3相当比例地应用于饲料和医药行业，从生物转化法产生的25OH-VD3更具有市场潜力。
微生物转化法利用的菌株主要包括有链霉菌属、红球菌属、分枝杆菌属、诺卡氏菌属等。Sasaki及其同事(Sasaki等，1991)筛选了约300个链霉菌属菌株，发现两种菌株的转化生产率约为7.0mg/L/min。Yasutake等用Nisin处理的含有VdhT107A的红球菌细胞可以合成573mg/L 25OH-VD3(Yasutake等，2013)。Luo等人筛选获得菌株Pseudonocardiaautotrophica CGMCC5098，并使用全细胞系统在120小时内，以维生素D3(以下简称VD3)为底物合成639mg/L25OH-VD3，是迄今为止微生物合成25OH-VD3最高报道(Luo等，2007)。然而这些菌株培养周期长，会引发生产成本居高不下。
细菌属转化VD3鲜有报道，细菌属生长培养基配方简单、生长迅速、培养周期短，对环境的适应性强，因而更易于工业放大。
发明内容
本发明的目的是提供一种25OH-VD3生产菌株及其筛选方法及利用该菌株转化VD3获取25OH-VD3。
根据本发明的一个方面，本发明提供一株25OH-VD3生产菌株，命名为zju4-2，分类名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019385，保藏时间为2019年5月23日，拉丁学名为Bacillus cereus。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种25OH-VD3生产菌株的筛选方法，其特征在于，从化工厂附近深土层取土样，加入无菌水中制备菌悬液，吸取菌悬液接种于富集培养基，培养后稀释涂布于分离培养基平板，挑取不同形态的代表性单菌落至种子培养基培养，再转接至转化培养基中进行转化实验，萃取转化液用于高效液相色谱检测25-羟基维生素D3的浓度，从而筛选得到所述25-羟基维生素D3生产菌株。
所述富集培养基组分为：0.5g/L酵母粉，5g/L磷酸氢二铵，1g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钠，0.25g/L无水硫酸镁，20g/L琼脂粉；
分离培养基组分为：0.5g/L维生素D3，5g/L磷酸氢二铵，1g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钠，0.25g/L无水硫酸镁，20g/L琼脂粉；
所述种子培养基组分为：5g/L葡萄糖，0.5g/L酵母粉，5g/L磷酸氢二铵，1g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钠，0.25g/L无水硫酸镁；
转化培养基组分为：5g/L葡萄糖，3g/L酵母粉，5g/L磷酸氢二铵，1g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钠，0.25g/L无水硫酸镁，β-环糊精10g/L。
根据本发明的第三个方面，本发明提供了上述25OH-VD3生产菌株的应用，其特征在于，所述25OH-VD3生产菌株用于以维生素D3为底物合成25OH-VD3。
其中，所述底物维生素D3溶解于丙二醇或者丙二醇和乙醇的混合溶剂中，其中，丙二醇与乙醇的体积比为10：0～5：5。
在上述合成25OH-VD3中，维生素D3添加时间为稳定期前期，维生素D3添加浓度为2g/L，培养温度为37℃，pH为7.2。
本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明筛选获得一株转化VD3合成25OH-VD3的菌株，属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，在同属菌中尚未报道，为25OH-VD3的生产提供新型菌株；此外，提供了底物VD3的溶解体系，以及转化VD3合成25OH-VD3的条件，为工业化生产25OH-VD3提供研究基础。本发明筛选的菌株易于培养，生长迅速，会大幅缩短了生产周期，降低发酵法生产成本，转化效率较高，易于工业化放大。
附图说明
图1 zju 4-2转化VD3为25OH-VD3液相色谱图谱
图2 zju 4-2菌株菌落形态以及革兰氏染色结果图
图3 zju 4-2系统发育树图
图4 溶解VD3的不同溶剂对25OH-VD3合成比较图
图5 不同丙二醇与乙醇比例对25OH-VD3合成比较图
图6 不同VD3添加时间对25OH-VD3合成比较图
图7 不同VD3添加浓度对25OH-VD3合成比较图
图8 不同培养温度对25OH-VD3合成比较图
图9 不同培养pH对25OH-VD3合成比较图
图10 5L发酵罐放大转化体系的过程曲线图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1 高产25-羟基维生素D3菌株的筛选
从化工厂附近深土层取土样，称取约1.0g，加入到30mL无菌水中制备菌悬液。吸取0.5mL菌悬液接种于富集培养基中，37℃恒温摇床培养3天。培养液为母液稀释涂布于分离培养基平板上，37℃培养24h。挑取254个单菌落进行转化实验，萃取转化液后用高效液相色谱检测25-羟基维生素D3的浓度。具体如下：
(1)挑取单菌落至种子培养基37℃培养12h得到种子液；
(2)种子液接种于50mL转化培养基中培养12小时；
(3)取1mL VD3母液添加入上述转化培养基中，继续培养48小时后，收集培养液；
(4)取2倍体积的乙酸乙酯与培养液混匀后充分萃取，10000rpm离心10min，取上相经0.22μm有机滤膜过滤后，HPLC外标法测定VD3及25OH-VD3的含量；液相检测方法为，色谱柱：安捷伦C18柱(4.6mm×250mm)；流动相：95％(V/V)色谱甲醇；柱温：30℃；检测波长：265nm；进样量：10μL；流速：1mL/min。
根据液相色谱结果(图1)，筛选得到一株收率为70.4％的25OH-VD3生产菌株，经生理生化实验鉴定，该菌株菌落呈现灰白色，不透明且边缘粗糙，在显微镜下呈现短棒状，孢子在中间或末端形成(图2)。结合菌株16srDNA(SEQ ID No.1)鉴定(图3)，该菌株属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，因此将该菌株命名为Bacillus cereus zju 4-2，该菌株于2019年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019385。
实施例2 不同VD3溶解溶剂对25OH-VD3收率的影响
尽管zju 4-2可以获得较高的收率(70.4％)，但VD3的添加溶度较低(0.039g/L溶解于200g/Lβ-环糊精)，不利于大规模工业化生产。
为了提高VD3的分散性，在200rpm恒速振荡下，以体积比为10％，VD3浓度为0.1mM的条件下，对乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙二醇和乙二醇五种常用溶剂进行了评价。如表1所示，五种溶剂对VD3的溶解度均远大于β-环糊精。此外，如图4所示，乙醇溶解VD3转化获得的25OH-VD3的收率(40％)和丙二醇溶解VD3转化获得的25OH-VD3收率(54％)高于乙酸乙酯(20％)、甲醇(17％)和乙二醇(35％)。因此，乙醇与丙二醇更适合用于溶解底物VD3合成25OH-VD3。
表1不同溶剂对VD3的溶解度
Figure BDA0002278397580000051
实施例3 VD3溶解溶剂中丙二醇与乙醇的比例对25OH-VD3收率的影响
由于乙醇与丙二醇溶解VD3转化合成25OH-VD3的收率较高，但两者对VD3溶解度不同。进一步的，对丙二醇与乙醇混合溶剂溶解VD3转化合成25OH-VD3。的可行性进行评价，通过调整两者的比例达到溶解度与收率的平衡。如图5所示，丙二醇与乙醇的比例在10：0～5：5(v/v)之间均能获得较高的25OH-VD3收率以及细胞干重。特别是丙二醇与乙醇的比例(v/v)为9:1时，得率为50.1％，且VD3在共溶剂混合物中的溶解度显著提高至24.49g/L，此时VD3溶解度以及25OH-VD3收率均达到最高，为最佳溶剂配比。
实施例4 底物VD3的添加对25OH-VD3收率的影响
对VD3底物添加的时间进行研究，分别选取3，6，9，12，15和18h(从对数前期至稳定期)，结果显示(图6)，当12h添加时，25OH-VD3收率最高。进一步的对VD3添加浓度进行研究，结果显示(图7)，当添加浓度为2g/L时，25OH-VD3收率最高，为最佳VD3底物添加浓度。
实施例5 pH与温度对收率的影响
由于温度在细胞生长和细胞内酶促反应中起着至关重要的作用，因此对最佳转化温度(26、30、33、37和40℃)进行了后续研究。如图8所示，在26～37℃范围内，随着转化温度的升高，产率和DCW急剧升高。当温度为37℃时，25(OH)VD3收率最高，为最佳25OH-VD3合成温度。
同样，pH也会影响细胞的生长和酶的活性。通过对不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.2、7.5和8.0)的检测表明(图9)，当pH值为7.2时，25(OH)VD3收率最高，为最佳25OH-VD3合成pH。
实施例6 5L发酵罐放大培养Bacillus cereus zju 4-2转化合成25OH-VD3
采用上述优化后的条件，在5L发酵罐中研究Bacillus cereus zju 4-2转化合成25OH-VD3。发酵罐中装液量为2L，接种量为10％(V/V)，培养温度37℃，通气量为1.0vvm，pH7.2。如图10所示，转化60h，25OH-VD3产量为830mg/L，生产率为25.94mg/L/h，收率为41.5％。与现有技术相比，利用Bacillus cereus zju4-2转化合成25OH-VD3，所用培养与转化时间得到显著的缩短，25OH-VD3产量与转化率较高，易于工业化生产。
Figure BDA0002278397580000071
序列表
<110> 浙江圣达生物药业股份有限公司
<120> 25-羟基维生素D3生产菌株及其筛选方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
aaaaggttac cccaccgact tcgggtgttc aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta 60
caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct 120
tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg aactgagaac ggttttatga gattagctcc 180
acctcgcggt cttgcagctc tttgtaccgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 240
aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc 300
ttagagtgcc caacttaatg atggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 360
aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgctccc 420
gaaggagaag ccctatctct agggttttca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg 480
cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 540
agtttcagcc ttgcggccgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttaa cttcagcact 600
aaagggcgga aaccctctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta 660
tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc gcctcagtgt cagttacaga ccagaaagtc 720
gccttcgcca ctggtgttcc tccatatctc tacgcatttc accgctacac atggaattcc 780
actttcctct tctgcactca agtctcccag tttccaatga ccctccacgg ttgagccgtg 840
ggctttcaca tcagacttaa gaaaccacct gcgcgcgctt tacgcccaat aattccggat 900
aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg 960
ttaggtaccg tcaaggtgcc agcttattca actagcactt gttcttccct aacaacagag 1020
ttttacgacc cgaaagcctt catcactcac gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat 1080
tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg 1140
tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgttgcct tggtgagccg ttacctcacc 1200
aactagctaa tgcgacgcgg gtccatccat aagtgacagc cgaagccgcc tttcaatttc 1260
gaaccatgcg gttcaaaatg ttatccggta ttagccccgg tttcccggag ttatcccagt 1320
cttatgggca ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc gctaacttca taagagcaag 1380
ctcttaatcc atcgctcgac tgca 1404

Claims (7)

1.25-羟基维生素D3生产菌株，其特征在于：其分类名为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)，保藏编号为：CCTCC M 2019385。
2.权利要求1所述的25-羟基维生素D3生产菌株的筛选方法，其特征在于：从化工厂附近深土层取土样，加入无菌水中制备菌悬液，吸取菌悬液接种于富集培养基，培养后稀释涂布于分离培养基平板，挑取不同形态的代表性单菌落至种子培养基培养，再转接至转化培养基中进行转化实验，萃取转化液用于高效液相色谱检测25-羟基维生素D3的浓度，从而筛选得到所述25-羟基维生素D3生产菌株。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：
所述富集培养基组分为：0.5g/L酵母粉，5g/L磷酸氢二铵，1g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钠，0.25g/L无水硫酸镁，20g/L琼脂粉；
分离培养基组分为：0.5g/L维生素D3，5g/L磷酸氢二铵，1g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钠，0.25g/L无水硫酸镁，20g/L琼脂粉。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：
所述种子培养基组分为：5g/L葡萄糖，0.5g/L酵母粉，5g/L磷酸氢二铵，1g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钠，0.25g/L无水硫酸镁；
转化培养基组分为：5g/L葡萄糖，3g/L酵母粉，5g/L磷酸氢二铵，1g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钠，0.25g/L无水硫酸镁，β-环糊精10g/L。
5.权利要求1所述25-羟基维生素D3生产菌株的应用，其特征在于，所述25-羟基维生素D3菌株用于以维生素D3为底物合成25-羟基维生素D3。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在25-羟基维生素D3生产菌株合成25-羟基维生素D3过程中，所述底物维生素D3溶解于丙二醇或者丙二醇和乙醇的混合溶剂中，其中，丙二醇与乙醇的体积比为10：0～5：5。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，维生素D3添加时间为稳定期前期，维生素D3添加浓度为2g/L，培养温度为37℃，pH为7.2。
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