KR20160096876A - 갑각류 양식용 미생물 제재 및 이를 이용한 갑각류의 생산성 증진방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상기 바이오-플락1 및 바이오-플락2 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제재를 갑각류 양식장의 사육수에 투여함으로써 갑각류에게 유익한 미생물을 증가시키고 유해한 미생물을 감소시킴으로써 우점화할 수 있다. 본 발명은 이러한 우점화를 통해 양식장의 수질을 개선시키고 갑각류의 면역력을 증진시킴으로써 흰반점 증후군 바이러스와 이외 유해균의 감염에 의한 갑각류의 폐사율을 감소시킬 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 방법에 의하면 국내에서 갑각류의 연 2모작이 가능하여 갑각류 생산성을 증가시킬 수 있다.

Description

갑각류 양식용 미생물 제재 및 이를 이용한 갑각류의 생산성 증진방법{Microorganism agent for crustacea aquaculture and a method for improving productivity of crustacea aquaculture using the same}
본 명세서에 기재된 내용은 갑각류의 생산성 증진을 위한 갑각류 양식용 미생물 제재 및 이를 이용한 갑각류의 생산성 증진 방법에 관한 것이다.
새우는 수온에 민감한 어류로서 국내에서는 5월-9월말 사이에 주로 양식된다. 새우 실내 양식은 1년에 2-3모작이 가능하나 하우스 및 수온 유지 시설 등에 대한 설치 및 관리 비용이 크다는 단점이 있어, 실외 양식이 주로 이용된다. 그러나 새우 실외 양식은 비용이 저렴한 반면, 수온 변화 및 바이러스 감염에 대한 취약성, 병해 등의 영향으로 인하여 5-9월 사이에 1번 밖에 양식할 수 없으며, 이러한 1번의 양식기회를 놓치는 경우 해당 년도의 양식을 전혀 할 수 없게 된다는 문제가 있다.
한편, 새우에 영향을 미칠 수 있는 바이러스들 중 흰반점증후군바이러스는 새우에게 가장 치명적인 바이러스 중 하나로 꼽힌다. 상기 흰반점증후군바이러스(White Spot Syndrome Virus, WSSV)는 바이론 말단부위에 꼬리와 유사한 부착물을 갖고 로드(rod) 형태의 캡시드(capsid) 및 피막(envelop)이 존재하는 난형의 바실러스와 유사한 형태를 가지고 있으며, 휘스포바이러스(whispovirus)로 명명된다. 흰반점증후군바이러스는 주로 새우, 가재, 게 등의 갑각류에 감염되는데, 특히, 흰반점증후군바이러스에 감염될 경우 흰반점 바이러스 증후군(White Spot Syndrome Disease, WSSD)이 발현되어, 갑각류의 갑피(carapace), 외지(appendage) 및 큐티클에 흰반점이 나타나고, 간 췌장(hepatopancreas)이 붉은색을 띠게 된다. 감염 강도에 따라 3∼10일 내에 100∼80% 폐사되며, 20일 이내에 전량 폐사되는 새우류에 치명적인 질병이다. 특히 대하(Fenneropenaeus chinensis)는 상기 흰반점 바이러스 증후군(White Spot Syndrome Disease, WSSD)에 매우 취약하여, 현재 국내 시장에서 생산량이 크게 감소된 상태다.
지난 몇 십년 동안 새우를 포함하는 갑각류 양식산업은 국내뿐만 아니라 전세계에서 가장 빠르게 급증하는 식량 생산산업 중 하나로, 매년 16.8%씩 증가하고 있다. 반면 새우의 질병에 따른 새우 손실액이 전 세계적으로 30억 달러에 이르는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 새우의 생산성을 증진시키기 위하여는 상기와 같은 흰반점 증후군 바이러스에 의한 감염의 문제의 해결이 시급하다.
대한민국 등록특허공보 제10-0824106호(2008.04.15.)
본 발명은 갑각류의 양식에 사용되는 해수 및/또는 담수에 유용미생물을 투여함으로써 바이러스에 의한 갑각류 폐사율을 감소시키고 생산성을 증가시킬 수 있는 미생물 제재 및 이를 이용한 갑각류의 생산성 증가 방법을 제공하고자 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 구현예들은 갑각류 생산성을 증진시키기 위한 갑각류 양식용 미생물 제재로, 바실러스서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스코아귤런스(Bacillus coagulans), 바실러스리첸포르니스(Bacillus lichenfornis), 바실러스세레우스(Bacillus cereus)바실러스폴리퍼멘티커스(Bacillus polyfermenticus)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바실러스속(Bacillus sp.) 균주 및 락토바실러스락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스델브구에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스파라카세이(Lactobacillus paracasei) 락토바실러스불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 락토바실러스속(Lacobacillu sp.) 균주 및 사카로미세스세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 균주가 혼합된 혼합 균주의 배양물을 포함하고, pH는 3~4이고 상기 혼합 균주의 균수는 1X108~109cfu/ml인 바이오 플락 1(Bio-floc 1); 및 로도박터캡슐라터스(Rhodobactor capsulatus) 로도슈도모나스파루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)로 이루어진 군에서 선택된 1종의 광합성 균주의 배양물을 포함하고, pH는 8~9이고 상기 광합성 균주의 균수는 1X108~109cfu/ml인 바이오 플락 2(Bio-floc 2) 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 갑각류 양식용 미생물 제재를 제공한다.
본 발명의 구현예들은 상기 갑각류 양식용 미생물 제재의 제조방법으로, 상기 바이오 플락 1의 제조방법은 상기 혼합균주를 당밀, 당, 쌀겨, 및 담수, 해수 또는 이들의 혼합물을 포함하는 배양액에 주입하는 단계; 상기 혼합균주를 주입한 배양액을 32~38℃에서 15~20일간 공기를 차단하여 배양하는 단계를 포함하고, 상기 바이오 플락 2의 제조방법은 상기 광합성 균주를 말산염, 비타민 B 및 담수, 해수 또는 이들의 혼합물을 포함하는 배양액에 주입하는 단계; 상기 광합성 균주를 주입한 배양액을 28~32℃에서 2~4일간 배양하는 단계를 포함하는 갑각류 양식용 미생물 제재의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 구현예들은 상기 갑각류 양식용 미생물 제재를 4~6일 주기로 갑각류 양식장의 사육수에 반복하여 투여하는 미생물 제재 투여단계, 및 상기 사육수의 수온을 28~32℃로 유지하며 갑각류를 사육하는 갑각류 양식단계를 포함하는 갑각류 생산성 증진 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 바이오-플락1 및 바이오-플락2 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제재를 새우와 같은 갑각류 양식장의 사육수에 투여함으로써 갑각류에게 유익한 미생물을 증가시키고 유해한 미생물을 감소시킴으로써 우점화할 수 있다. 본 발명은 이러한 우점화를 통해 양식장의 수질을 개선시키고 갑각류의 면역력을 증진시킴으로써 흰반점 증후군 바이러스와 이외 유해균의 감염에 의한 갑각류의 폐사율을 감소시킬 수 있으며 나아가 갑각류의 생장기간을 단축시킬 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 방법에 의하면 국내의 실외 양식에 있어서 갑각류의 연 2모작이 가능하여 갑각류 생산성을 증가시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 투여한 사육수의 용존산소량(DO) 변화를 미생물 제재의 투여농도에 따라 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 투여한 사육수의 화학적 산소 요구량(COD) 변화를 미생물 제재의 투여농도에 따라 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 투여한 사육수의 부유물질(SS) 변화를 미생물 제재의 투여농도에 따라 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 투여한 사육수의 총 질소(Total-N) 변화를 미생물 제재의 투여농도에 따라 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 투여한 사육수의 암모니아성 질소(NH4 +-N) 변화를 미생물 제재의 투여농도에 따라 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 투여한 사육수의 인산 인(PO4 --P) 변화를 미생물 제재의 투여농도에 따라 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 사육수에 투여한 농도와 경과시간에 따른 바실러스속 균수의 변화를나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 사육수에 투여한 농도와 경과시간에 따른 락토바실러스속 균수의 변화를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 사육수에 투여한 농도와 경과시간에 따른 로도박터캡슐라터스 균수의 변화를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 사육수에 투여한 농도와 경과시간에 따른 총 균수의 변화를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 사육수에 투여한 후 45일과 90일 경과후 미생물에 따른 새우의 체중증가 정도를 비교한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 사육수에 투여한 후 45일과 90일 경과후 미생물에 따른 새우의 전장 증가 정도를 비교한 도이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 사육수에 투여한 후 새우의 간췌장 내에서의 면역유전자로서 proPO(proPhenoloxidase) 유전자 발현변화를 나타낸 도이다.
도 14 는 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 사육수에 투여한 후 새우의 간췌장 내에서의 면역유전자로서 LYS(Lysozyme) 유전자 발현변화를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 사육수에 투여한 후 새우의 간췌장 내에서의 면역유전자로서 SP(Serine Proteinase) 유전자 발현변화를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재에 노출된 새우의 간췌장 내 SOD(Superoxide dismutase) 활성분석 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재에 노출된 새우의 간췌장 내 카탈라제활성분석 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재에 노출된 새우의 간췌장 내 글루타치온 함량분석 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명의 일 구현예에 따른 바이오 플락 1의 제조에 있어서, 배양기간(0~30일)에 따른 배양물의 균주수 변화를 측정하여 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명의 일 구현예에 따른 바이오 플락 1의 제조에 있어서, 배양기간(0~30일)에 따른 배양물의 pH 변화를 측정하여 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명의 일 구현예에 따른 바이오 플락 1의 제조에 있어서, 배양기간(0~30일) 및 배양온도(20, 25, 30, 35℃)에 따른 배양물의 균주수 변화를 측정하여 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 구현예들은 갑각류 생산성을 증진시키기 위한 갑각류 양식용 미생물 제재로, 바실러스서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스코아귤런스(Bacillus coagulans), 바실러스리첸포르니스(Bacillus lichenfornis), 바실러스세레우스(Bacillus cereus)바실러스폴리퍼멘티커스(Bacillus polyfermenticus)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바실러스속(Bacillus sp.) 균주 및 락토바실러스락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스델브구에키 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스파라카세이(Lactobacillus paracasei) 락토바실러스불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 락토바실러스속(Lacobacillu sp.) 균주 및 사카로미세스세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)균주가 혼합된 혼합 균주의 배양물을 포함하고, pH는 3~4이고 상기 혼합 균주의 균수는 1X108~109cfu/ml인 바이오 플락 1(Bio-floc 1); 및 로도박터캡슐라터스(Rhodobactor capsulatus) 로도슈도모나스파루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)로 이루어진 군에서 선택된 1종의 광합성 균주의 배양물을 포함하고, pH는 8~9이고 상기 광합성 균주의 균수는 1X108~109cfu/ml인 바이오 플락 2(Bio-floc 2) 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 갑각류 양식용 미생물 제재를 제공한다.
이때 본 명세서에서 바이오 플락(Bio floc)이란 사육수 내 존재하는 미생물, 플랑크톤, 사료찌꺼기 등이 서로 얽혀있는 양질의 유기물 덩어리를 의미하며, 상기 사육수는 양식장에서 새우 등의 갑각류가 양식되고 있는 물을 의미하는 것으로, 양식장에 공급되거나 저장된 물을 모두 포함하는 가장 넓은 개념이다.
본 발명의 구현예들에 따르면 상기 갑각류는 수중생활을 하는 절지동물로서, 새우, 게 및 가재 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함한다. 일 구현예로서 새우는 무척추동물로서 비특이적인 면역반응을 가지고 있기 때문에, 백신이나 면역증강제 같은 경우에는 특이 병원체에 대하여 단기간 동안에만 효과가 있다. 그러나, 본 발명은 상기와 같은 유용 미생물을 배양시킨 바이오 플락 1 및 2를 제공함으로써, 새우의 장에서 혈청학적 면역력과 경쟁적 배제를 증가시키는 결과를 가져와서 비특이적 질병 보호 효과가 우수하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오 플락 1의 바실러스 균주는 다양한 엑소엔자임(exoenzyme)을 분비하며, 장에 존재함으로써 유해균을 차단하여 유용미생물의 선점을 통해 갑각류의 생존율을 증가시킬 수 있다. 또한 양식수와 갑각류의 소화관에서 군집을 형성하고 비브리오균 대신 장에 존재하며 매우 다양한 항생 물질을 자연적으로 생산하여 갑각류의 생존율을 증가시킬 수 있다. 갑각류의 소화관에서 리파아제, 프로테아제, 아밀라아제의 활성을 증가시킬 수 있으며 갑각류에서 세포성과 체액성면역 방어 활성을 통해 질병을 예방할 수 있다. 또한 과립성 백혈구의 포식세포활성을 자극시켜 갑각류에 면역원으로서 작용할 수 있다.
상기 바이오 플락 1의 락토바실러스 균주는 갑각류의 소화기관에 존재하는 유해균을 줄여주는 역할을 하며 숙주 대사를 향상시키고 혈청 콜레스테롤과 아민을 감소시킬 수 있어, 갑각류의 폐사율을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
또한, 수산양식 중에서도 특히 갑각류양식에 있어서는 많은 양의 질소성 물질 즉, 아질산성 질소, 질산성 질소, 암모니아성 질소들과 인 물질들이 발생하는데, 이런 현상들에 의해 조류가 증폭되고 과부화 현상이 나타나는 등 환경적인 문제점이 많이 발생하고 있다.
이에 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 바이오 플락 2의 광합성 균주는 혐기성 광영향 생물로서 빈산소나 혐기성 조건에서 유기물을 분해하는 역할을 한다. 따라서 유기물의 오염이나 양식장 환경수에 대하여 영양염을 분해함으로써 수질을 개선하는 역할을 한다.
본 발명의 일 구현예로서 상기 갑각류 양식용 미생물 제재는 바이오 플락 1 및 바이오 플락 2를 8~12 : 1의 부피비로 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 10:1의 부피비로 포함할 수 있다. 또한, 일 구현예에 따른 상기 바이오 플락 1의 혼합 균주는 상기 바실러스속 균주, 락토바실러스속 균주 및 사카로미세스세레비시에 균주를 배양액 총 부피에 대하여 1 : 1.5~2.5 : 0.4~0.7 또는 1.5~2.5 : 1.5~2.5 : 0.4~0.7의 CFU(Colony Forming Unit)비로 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예들은, 상기와 같은 갑각류 양식용 미생물 제재의 제조방법으로 하기의 바이오 플락 1 및 2의 제조방법을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 바이오 플락 1의 제조방법은 상기 혼합균주를 당밀, 당, 쌀겨, 및 담수, 해수 또는 이들의 혼합물을 포함하는 배양액에 주입하는 단계; 상기 혼합균주를 주입한 배양액을 25~40℃, 보다 구체적으로는 32~38℃에서 15~20일간 공기를 차단하여 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 바이오 플락 2의 제조방법은 상기 광합성 균주를 말산염, 비타민 B 및 담수, 해수 또는 이들의 혼합물을 포함하는 배양액에 주입하는 단계; 상기 광합성 균주를 주입한 배양액을 25~35℃에서 2~4일간, 보다 구체적으로는 28~32℃에서 3일간 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이때 상기 바이오 플락 2의 제조방법은 광합성 균주가 주입된 배양액을 배양시 약간의 에어레이션(airation)을 할 수 있다.
상기 바이오 플락 1 및 2의 배양에 사용되는 담수는 염분 함유량이 500mg/l 이하의 통상적인 육수(陸水)를 의미하는 것이며, 해수(海水)는 3.5~3.6%의 염분을 포함하고 이외 염화마그네슘, 황산칼륨, 황산마그네슘 등을 포함하는 간수, 영양염류, 산소나 질소 등의 기체 등을 포함하는 바닷물을 의미한다. 또한, 해수와 담수가 섞인 용액은 3.5%이하의 염도로 변화될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 바이오 플락 1의 배양액은 당밀 10~50L, 당 1~5 kg, 쌀겨 1~10L 및 담수, 해수 또는 이들의 혼합물 1000L의 혼합물을 예로 들 수 있다. 또한, 상기 바이오 플락 2의 배양액은 말산염 1~20kg, 비타민 B 0.5~5L 및 담수, 해수 또는 이들의 혼합물 1000L의 혼합물을 예로 들 수 있다. 보다 구체적으로 상기 바이오 플락 1 및 2의 담수, 해수 또는 이들의 혼합물은 해수 및 담수가 3:1.5~2.5의 부피비로 혼합된 것일 수 있다.
또한, 상기 바이오 플락 2의 제조방법의 상기 광합성 균주를 주입한 배양액을 배양하는 단계에서 광주기는 1,000~30,000Lx일 수 있으며, 파장은 650~800nm일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 본 발명은 상기와 같은 갑각류 양식용 미생물 제재를 3~8일 주기로 갑각류 양식장의 사육수에 반복하여 투여하는 미생물 제재 투여단계; 및 상기 사육수의 수온을 20~35℃로 유지하며 갑각류를 사육하는 갑각류 양식단계를 포함하는 갑각류 생산성 증진 방법을 제공한다.
미생물 균종마다 적용되는 균의 농도가 다르지만, 대하와 같은 갑각류는 수색이 너무 맑으면 생존율이 낮아지며, 106cfu/ml내외일 경우 생존율이 높아진다. 수색이 맑다는 것은 미생물의 존재여부, 유기물의 양, 부유물질(SS)의 양등에 의해 나타나며, 미생물 균의 농도가 108~ 109에서 106~107로 변하는 데는 약 5일 내외로 소요된다. 이에 본 발명의 구현예들에 따른 상기 미생물 제재를 4~6일, 보다 구체적으로는 5일 주기로 사육수에 반복하여 투여함으로써 미생물의 작용에 의해 수질을 균의 농도가 106이하가 되도록 조절할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 미생물 제재 투여단계는 사육수에 대한 미생물 제재의 농도가 사육수 50ton에 대한 미생물 제재 1L를 농도 100%로 할 때 100~140%가 되도록 미생물 제재의 투여량을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 농도구간을 벗어날 경우 미생물 제재의 수질 정화능력이 저하되며, 미생물의 성장도 더디게 나타날 수 있다.
나아가, 상기 미생물 제재 투여단계는 일 구현예로서 미생물 제재의 투여 전에 사육수의 아질산 농도 1~5ppm, 암모니아 농도 0.01~0.1ppm, pH 6~9 및 화학적 산소 요구량(COD) 3~10ppm 중 하나 이상의 조건을 만족하도록 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 사육수가 상기 조건을 만족할 경우에는 사육수 내 암모니아, 아질산 등 오염물질의 양과 투여되는 미생물의 양이 균형을 이루게 되어, 사육수를 환수하지 않고 갑각류를 양식할 수 있다.
이로써, 상기 본 발명의 구현예들에 따른 갑각류 생산성 증진 방법은 상기 미생물 제재가 사육수의 우점화를 달성함으로써 흰반점 증후군 바이러스 항원과 같은 직접적인 면역력 향상 제재를 사용하지 않고도 갑각류의 면역력을 간접적으로 증진시켜 흰반점 바이러스에 의한 갑각류 폐사율을 감소시킬 수 있다. 그에 따라, 궁극적으로 갑각류의 생산성을 증진시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 제조예 및 실험예를 통하여 설명한다. 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 실시예의 범위로 제한되는 것은 아니다.
또한, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 이 발명의 기술 사상의 범주를 이탈하지 않고 첨부한 특허청구범위 내에서 다양한 변형 및 모방이 가능함은 명백한 사실이다.
[제조예1]새우 양식용 미생물 제재(바이오 플락 1)의 제조
바실러스세레우스(Bacillus cereus), 바실러스서브틸리스(Bacillus subtilis) 락토바실러스파라카세이(Lactobacillus paracasei)사카로미세스세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 균주가 각각 5 x 105~106cfu/ml, 1 x 108~1010cfu/ml, 1 x 106~107cfu/ml, 5 x 105~106cfu/ml로 포함된 20L의 샘플(EM-1, ㈜에버미라클)을 당밀 20L, 당 2kg, 쌀겨 5L, 해수 580L 및 담수 380L가 혼합된 배양액에 주입하고, 공기를 차단한 후 35℃에서 15일간 배양하여 pH 3-4, 미생물 균수 1 x 108~109cfu/mL인 미생물 배양물(제조예1)을 제조하였다.
[제조예 2] 새우 양식용 미생물 제재(바이오 플락 2)의 제조
로도박터캡슐라터스(Rhodobactorcapsulatus) (DS-PSB, (주)두산에코비즈넷)가 1 x 106cfu/ml로 포함된 샘플 0.5L을 말산염 5kg, 비타민 B 1L 및 해수 99.4L가 혼합된 배양액에 주입하고, 약한 에어레이션(aeration) 하에서 30℃에서 3일 간 배양하여 pH 8-9, 미생물 균수1 x 108~109cfu/mL인 미생물 배양물(제조예2)을 제조하였다.
[제조예 3] 새우 양식용 미생물 제재의 제조
상기 제조예 1 및 2에서 제조한 바이오 플락 1 및 2를 10:1의 부피비로 혼합하여 미생물 제재(제조예 3)를 제조하였다. 이하 후술되는 실험예들에서는 상기 제조예 3의 미생물 제재를 사용하여 실험하였다.
[실험예 1] 미생물 제재의 투여에 따른 수질개선 결과 분석
실험 조건 설정
후술되는 실험예들에 사용한 실험새우는 인천수산연구소에서 분양 받은 대하(Fenneropenaeuschinensis)로, 1주간 순치시킨 후 전장 1.5cm내외, 평균체중 0.00575g의 치하를 사용하였다. 선별된 개체는 400×400×600mm의 원형 수조 내 해수 180L를 채워 입식하였고 모래를 3cm가량 채워 넣었다. 실험을 위한 외부온도는 24.5±0.5℃로 일정하게 유지하였으며, 실험에 사용된 해수(사육수)의 수질은 하기 표 1과 같다.
구분
온도 (℃) 24.5±0.5
pH 8.0±0.5
염도 (‰) 30.5±1.0
DO (mg/L) 7.1±0.3
COD (mg/L) 1.13±0.1
SS (mg/L) 1.22±0.5
NO2 --N (㎍/L) 1.3±0.3
NO3 --N (㎍/L) 11.48±1.0
NH4 +-N (㎍/L) 12.5±0.7
PO4 --P (㎍/L) 1.5±0.5
또한, 본 실험에 앞서, 상기 제조예3에서 제조한 미생물 제재 1L를 50ton의 해수에 투여한 것을 농도100%로 할 때, 상기 미생물 제재를 농도가 0, 60, 80, 100, 120, 140%가 되도록 해수에 투여하였다.
수질 분석
상기 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재의 투여 농도에 따른 사육수의 수질 변화를 45일 및 90일 후에 측정하였으며, 측정방법은 국토해양부에서 정한 해양환경공정시험기준(2010.12.8 개정)에 따랐다.
구체적으로, 용존산소(DO)는 Winkler(1888)가 처음 제정한 방법을 Strickland 와 Parsons(1968)에 수정한 것을 사용하였으며 염화망간과 알칼리 요오드화나트륨(NaI)용액을 첨가하여 수산화망간(II)을 침전시켜 용존산소량에 대응하여 유리된 요오드를 티오황산나트륨으로 적정하여 정량하여 측정하였다.
화학적 산소 요구량 (COD)은 산화제인 과망간산칼륨을 넣은 후 60분간 가열 반응하여 화학적으로 산화시킬 수 있는 물질을 산화시키며 티오황산나트륨(Na2S2O3)으로 적정하였다. 이때 소비되는 산소량을 측정하는 것으로 유기물의 양을 간접적으로 측정했다.
부유 물질 (SS)은 잘 혼합된 시료를 유리섬유여과지 (GF/F filter paper, 공경 0.7μm)에 여과한 후 105-110℃에 항량으로 건조하여 여과지의 증가된 무게를 부유물질의 양으로 하였다.
총 질소 (Total-N) 중 아질산성 질소는 술퍼닐아미드와 반응하여 디아조늄 이온을 형성한 후 나프틸에틸렌디아미드와 반응하여 아조화합물을 생성하게 되는데 이 때 발색된 시료를 분광광도계를 이용하여 흡광도 543nm에서 측정하였다. 질산성 질소는 해수 중에서 질소계 화합물 중 열역학적으로 비교적으로 안정화 되어있으므로 구리 촉매로 처리된 카드뮴 환원관을 이용하여 아질산성 질소로 환원시킨 후 아질산성 질소의 측정원리에 측정하였다. 암모니아성 질소 (NH4 +-N)는 염기성 차아염소산용액과 산화 반응하여 모노크롤아민을 생성하며 이를 페놀과 촉매인 니트로프러시드, 차아염소산에 의해 인도페놀을 형성시켜 발색된 시료를 분광광도계를 이용하여 흡광도 640nm에서 측정하였다.
인산 인 (PO4 --P)은 산성 조건에서 인산몰리브덴산암모늄과 주석산안티몬칼륨과 반응하여 인산몰디브덴산착화합물을 형성하는데 이는 아스코르브산에 의해 환원되어 푸른색의 용액을 생성하게 된다. 이렇게 발색된 시료를 분광광도계를 이용하여 흡광도 885nm에서 측정하였다.
상기 지표의 각 측정 결과를 도 1-6에 나타내었다. Total-N, NH4 +-N 및 PO4 --P의 양은 시간이 흐를수록, 즉 45일보다 90일 경과 후에 대조군과 비교하여 감소되는 경향을 나타내었다. 하지만 본 발명의 미생물 제재의 농도에 따른 수질 변화는 보이지 않았다.
[실험예 2] 미생물 제재의 투여에 따른 사육수 내 미생물 조성 분석
본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 농도가 100, 150%가 되도록 해수에 투여하고, 5일, 10일 후 미생물 제재에 포함되었던 미생물들의 조성변화를 분석하였다.
미생물 조성에 따라 각각의 수조에서 물을 채수하여 10배씩 희석하고 각 단계별로 1mL씩 아래의 미생물 종류에 따라 배지에 분주하여 35℃, 48시간 후 집락수를 조사하였다.
구체적으로, 총균수(Total bacterial count, TBC)는 1% NaCl, NA(Nutrient Agar) 23g을 1L의 3차 증류수에 넣어 녹인 후 121℃ 15분 오토클레이브(Autoclave)에 고압 멸균 시킨 다음, 페트리디쉬에 부운 후 각 농도별의 시료를 단계 희석하여 집락의 수를 확인하여 측정하였다.
락토바실러스속 균은 MRS Broth 55g, 1.7% Agar, 1% NaCl을 1L의 3차 증류수에 넣어 녹인 후 121℃ 15분 오토클레이브에 고압 멸균 시킨 다음, 페트리디쉬에 부운 후 각 농도별의 시료를 단계 희석하여 집락의 수를 확인하여 측정하였다. 이때 API(E&50CHB&CHL) 등의 생화학적 test를 통하여 세균을 확인하였다.
바실러스속 균은 MYP(Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin)아가 46g, 1% NaCl을 1L의 3차 증류수에 넣어 녹인 후 121℃ 15분 오토클레이브에 고압 멸균 시킨 다음, 45-50℃정도 식힌 후 12.5ml 난황농축액(Egg Yolk Enrichment) 50%와 4.1ml 폴리믹신(Polymyxin)을 넣어준 후 잘 섞어주었다. 그 뒤 페트리디쉬에 부운 후 각 농도별의 시료를 단계 희석하여 집락의 수를 확인하였다. 이때 API(E&50CHB&CHL) 등의 생화학적 test를 통하여 세균을 확인하였다.
로도박터캡슐라터스균은 말레이트 기저배양액(Malate basal broth)에 1.7% 아가, 1% NaCl을 1L의 3차 증류수에 넣어 녹인 후 121℃ 15분 오토클레이브에 고압 멸균 시킨 다음, 페트리디쉬에 부운 후 각 농도별의 시료를 단계 희석하여 집락의 수를 확인하였다.
그 결과, 도 7-10에 나타난 바와 같이, 시간이 지날수록 각각의 균에 대한 농도가 감소하였으며, 투여한 미생물 제재의 농도가 높을수록 균의 농도가 작은 폭으로 감소하였음을 확인할 수 있었다.
[실험예 3]미생물 제재의 투여에 따른 새우 생산성 증진 분석
새우의 성장률 분석
본 발명의 구현예에 따른 미생물 제재의 새우 성장정도에 대한 영향을 분석하기 위하여, 실험 전 새우의 전 전장과 체중을 측정한 다음, 미생물 제재를 0, 60, 80, 100, 120, 140%의 농도로 사육수에 각각 투입한 후 45일, 90일 경과후 사육수 내 새우의 전장과 체중을 측정하였다. 일일전장성장량, 일일체중성장량은 다음과 같이 측정하였다.
[수학식 1]
일일성장량(Daily growth gain) = (Wf - Wi)/day
Wf = Final length or weight
Wi = Initial length or weight
새우의 45일, 90일 후의 체중성장정도를 각각 측정한 결과를 도 11에 나타내었다. 45일 후 미생물 제재의 농도가 100, 120 및 140%일 때 유의한 체중 증가를 보였으며 120%농도구간에서 가장 높은 성장률을 보였다. 90일 후의 전장의 변화 역시 미생물 제재의 농도가 120%, 140%일 때 유의한 증가를 보였으며 120%농도구간에서 가장 높은 성장을 보였다.
또한, 새우의 45일 후의 전장의 변화는 미생물 제재의 농도가 100, 120 및 140%일 때 유의한 증가를 보였으며 120% 농도구간에서 가장 큰 성장률을 보였다. 90일 후의 전장의 변화 역시 미생물 제재의 농도가 100, 120 및 140%일 때 유의한 증가를 보였으며 120%농도구간에서 가장 큰 성장률을 보였다.
새우의 면역성 분석
본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 0, 60, 80, 100, 120, 140%의 농도로 사육수에 각각 투입한 후 45일, 90일 경과 후 새우의 면역성을 분석하였다.
새우의 간췌장의 면역 유전자 발현을 측정하기 위해 트리솔(Trisol)로테프론-글래스호모게나이져(teflon-glass homogenizer 099CK4424, Glass-Col, Germany)를 이용하여 조직을 균질화하였다. 그 뒤 클로로폼(Chloroform)을 첨가하여 볼텍싱(vortexing)시킨 후 이를 4℃, 12000g로 15분간 원심 분리하여 상등액을 분리하였다. 상층액과 동량의 이소프로판올을 넣고 4℃, 12000g로 15분간 원심 분리하여 펠렛을 만들었다. 80% 에틸알콜로 첨가 후 4℃, 12,000g로 15분간 원심분리하여 세척하였다.
그 다음, NFW를 이용하여 RNA를 희석 후 1㎍/㎕ 정량하여 cDNA 합성 키트 (Promega, MADI, USA)를 이용하여 cDNA로 합성시켰다. 합성된 cDNA를 하기 표 2에 따른 프라이머를 사용하였으며 하우스키핑(House keeping) 유전자로는 β-actin을 사용하였다. 프라이머는 primer3 프로그램을 이용하여 제작 후 바이오니어(bioneer)에서 프라이머를 공급받았다. 그리고, TOPrealqPCR 2X Premix (SYBR Green, Enzynomics, Korea)로 real-time PCR (Roche)을 이용하여 상대적 mRNA 발현을 확인하였다. PCR의 조건은 하기 표 3와 같다. 그리고 실험에 사용된 면역유전자로서 proPO(proPhenoloxiase), LYS(Lysozyme), SP(Serine Proteinase)의 프라이머 염기서열은 표 4-6에 나타내었다.
Primer β-actin Sequence (5´ to 3´)
Forward CGA GGT ATC CTC ACC CTG A
Reverse CGG AGC TCG TTG TAG AAG G
Temperature (℃) Time cycle
Pre-incubation 95 10 min 1
Denaturation 95 10 sec 45
Annealing 60 15 sec
Extension 72 25 sec
Melting curve 95, 60, 72 10, 15, 25 sec 1
Primer proPhenoloxiase (proPO) Sequence (5´ to 3´)
Forward GAT ATC CTC GGC GAT GTG T
Reverse AGG GTC ATG CGA GAA AGC T
Primer Lysozyme (LYS) Sequence (5´ to 3´)
Forward GTA ACA AAC GCG ACC TCG A
Reverse CCG TGC CAG GCT GTA TAT C
Primer Serine Proteinase (SP) Sequence (5´ to 3´)
Forward TAT GTG GCG GAT CCC TTA T
Reverse GGT GAT AGT CCC CAA GAC G
먼저, 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재에 노출된 새우의 간췌장 내 proPO(proPhenoloxidase)의 면역 유전자 발현 결과를 도 13에 나타내었다. proPO의 발현은 대조군과 비교하여 다른 구간에서는 유의한 차이가 없었으나 미생물 제재의 농도가 60, 120, 140%구간에서는 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 상기 proPO은 새우의 면역에 중요한 작용을 하는 유전자로서 SP의 효소에 의해 PO로 전환되면서 면역을 작용하는데, proPO가 증가하였으므로 이는 새우의 면역력이 증가하였다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재에 노출된 새우의 간췌장 내 LYS (Lysozyme)의 면역 유전자 발현 결과는 도 14에 나타내었다. LYS 활성은 대조군과 비교하여 미생물 제재의 농도가 증가함에 따라 대체로 유의한 증가를 나타냈고, LYS의 발현도 높아지는 경향을 나타내었으며 120, 140 구간에서 유의한 증가를 보였다. 상기 LYS은 새우의 선천적인 면역에서 가장 중요한 작용을 하므로, LYS이 증가했다는 것은 새우의 면역력이 증가하였다는 것을 의미한다.
마지막으로, 본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재에 노출된 새우의 간췌장 내 SP (Serine Proteinase)의 면역 유전자 발현 결과는 도 15에 나타내었다. SP는 대조군과 비교하여 미생물 제재의 농도가 증가함에 따라 유의한 차이를 나타나지 않았으나, 가장 높은 농도 구간인 140%에서는 SP의 활성이 높아지는 경향을 나타내었다.
새우의 생화학분석
본 발명의 일 구현예에 따른 미생물 제재를 0, 60, 80, 100, 120, 140%의 농도로 사육수에 각각 투입한 후 45일, 90일 경과 후 새우의 효소활성을 생화학 분석하였다.
새우의 간췌장의 효소 활성을 측정하기 위해 조직을 워싱버퍼(0.1M KCl, pH 7.4)로 세척 후, 호모게나이징 버퍼(0.1M PBS, pH 7.4)로 테프론-글래스호모게나이져(099CK4424, Glass-Col, Germany)를 이용하여 균질화하였다. 이것을 4℃, 10000g로 30분간 원심분리하여 상등액을 실험에 사용하였다.
먼저, SOD(Superoxide dismutase)활성을 측정하기 위해 1X 용균버퍼(10mM Tris, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1 mM EDTA)를 사용하여 조직을 균질화한 후, 이를4℃, 12000g로 10분간 원심분리하여 상등액을 실험에 사용하였다 모든 상층액은 실험 전까지 -75℃ (MDF-U53V, SANYO Electric Co. Ltd., Japan)에 보관하였다.조직의 단백질 함량은 Bradford (1976) 방법을 이용한 kit (Biorad. Co., Ltd.)를 이용하여 정량하였다. SOD 활성은 크로마겐 환원(chromagen reduction)의 억제제율(inhibitor rate)로 측정하는 SOD Assay Kit (Cell biolabsInc)를 이용하였다. 각 상등액은5의 배수씩 0.1mM PBS로 희석 후 분광광도계를 이용하여 흡광도490nm에서 측정하였다. 측정값으로 inhibitor rate를 구하여 unit/mg protein으로 표시하였다. 이때 SOD 활성은 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.
[수학식 2]
SOD activity (inhibition %) = (ODblank-ODsample) / (ODblank) x 100
본 발명의 일 구현예의 미생물 제재에 노출된 새우의 간췌장 내 SOD 활성분석 결과를 도 16에 나타내었다. SOD 활성은 대조군 비교하여 미생물 제재의 농도가 증가함에 따라 농도가 80%에서부터 유의한 활성 감소를 나타냈고, 미생물 제재의농도가 높은 구간인 120, 140%에서 가장 낮은 활성을 나타내었다.
다음으로, 카탈라제(Catalase) 활성은 과산화수소의 분해의 비율에 따른 카탈라제의 농도에 대하여 남아있는 과산화수소에 반응하는 양을 측정하는 카탈라제어세이 키트(Cell biolabsInc)를 이용하였다. 2가지 반응을 통하여 분광광도계를 이용하여 흡광도520nm에서 측정하였다. 카탈라제 활성 어세이 표준 곡선을 이용하여 OD값에 대한 카탈라제 활성을 측정하였고 unit/mg protein으로 표시하였다.
본 발명의 일 구현예의 미생물 제재에 노출된 새우의 간췌장 내 카탈라제활성분석 결과를 도 17에 나타내었다. 카탈라제의 활성은 대조군과 비교하여 미생물 제재의 농도가 120, 140%인 구간에서 유의한 감소를 나타냈고 120%에서 가장 낮은 활성을 보였다.
마지막으로, 환원된 글루타치온(Glutathione, GSH)의 함량을 버틀러등(1963)의 방법을 이용하여 분석하였다. 상등액에 침전요액(metaphosphoric acid, Na2EDTA, NaCl)을 첨가하여 혼합한 후 4500g에 10분간 원심분리 하였다. 그 상등액에 0.3M Na2HPO4을 넣고, 0.5mM DTNB로 발색시켜 분광광도계로 412nm에서 흡광도를 측정하였다. 글루타치온의 함량은 환원된 글루타치온 표준곡선을 이용하여 측정하였고, nmol GSH/mg protein으로 표시하였다.
본 발명의 일 구현예의 미생물 제재에 노출된 새우의 간췌장 내 환원된 글루타치온 함량 분석 결과를 도 18에 나타내었다. 글루타치온의 함량은 대조군과 비교하여 유의한 감소를 나타냈지만, 미생물 제재의 농도별로 보았을 때는 유의한 차이를 보이지 않았다.
[실험예4]새우 양식용 미생물 제재(바이오 플락 1)의 제조조건 분석
바실러스세레우스(Bacillus cereus) , 바실러스서브틸리스(Bacillus subtilis), 락토바실러스파라카세이(Lactobacillus paracasei) 사카로미세스세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 균주가 각각 5 x 105~106cfu/ml, 1 x 108~1010cfu/ml, 1 x 106~107cfu/ml, 5 x 105~106cfu/ml로 포함된 샘플(EM-1, ㈜에버미라클) 20L을 당밀 20L, 당 2kg, 쌀겨 5L, 해수 580L 및 담수 380L가 혼합된 배양액에 주입하고 공기를 차단한 후, 배양기간(0~30일), 수온(20, 25, 30, 35℃)에 따른 배양물의 균주수의 변화 및 pH변화를 측정하였다.
그 결과, 도 19 및 20에 나타난 바와 같이, 배양기간이 15일~20일일 때 균주수가109cfu/ml로 목적하는 바이오 플락 1이 효과적으로 제조되었다(배양온도 25~40℃ 기준). 또한, 도 21에 나타난 바와 같이, 배양기간이 15~20일이고, 배양온도가 30~35℃인 경우 균주수가 109cfu/ml로 목적하는 바이오 플락 1이 효과적으로 제조되었음을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 갑각류(Crustacea)의 생산성을 증진시키기 위한 갑각류 양식용 미생물 제재로,
    바실러스서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스코아귤런스(Bacillus coagulans), 바실러스리첸포르니스(Bacillus lichenfornis), 바실러스세레우스(Bacillus cereus)바실러스폴리퍼멘티커스(Bacillus polyfermenticus)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바실러스속(Bacillus sp.)균주, 락토바실러스락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스델브구에키 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스파라카세이(Lactobacillus paracasei) 락토바실러스불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 락토바실러스속(Lacobacillu sp.)균주, 및 사카로미세스세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)균주가 혼합된 혼합균주의 배양물을 포함하고, pH는 3~4이고 상기 혼합균주의 균수는 1X108~109cfu/ml인 바이오 플락 1(Bio-floc1); 및
    로도박터캡슐라터스(Rhodobactor capsulatus) 로도슈도모나스파루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)로 이루어진 군에서 선택된 1종의 광합성 균주의 배양물을 포함하고, pH는 8~9이고 상기 광합성 균주의 균수는 1X108~109cfu/ml인 바이오 플락 2(Bio-floc2) 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 갑각류 양식용 미생물 제재.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 갑각류는 새우, 게 및 가재로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 갑각류 양식용 미생물 제재.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 갑각류 양식용 미생물 제재는 바이오 플락1 및 바이오 플락 2를 8~12 : 1의 부피비로 포함하는 갑각류 양식용 미생물 제재.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이오 플락 1의 혼합 균주는 상기 바실러스속균주, 락토바실러스속균주 및 사카로미세스세레비시에균주를 배양액 총 부피에 대하여1:1.5~2.5:0.4~0.7 또는 1.5~2.5 : 1.5~2.5 : 0.4~0.7의 CFU(Colony Forming Unit)비로 포함하는 갑각류 양식용 미생물 제재.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 갑각류 양식용 미생물 제재의 제조방법으로서,
    상기 바이오 플락 1의 제조방법은 상기 혼합균주를 당밀, 당, 쌀겨, 및 담수, 해수 또는 이들의 혼합물을 포함하는 배양액에 주입하는 단계; 상기 혼합균주를 주입한 배양액을 25~40℃에서 15~20일간 공기를 차단하여 배양하는 단계를 포함하고,
    상기 바이오 플락 2의 제조방법은 상기 광합성 균주를 말산염, 비타민 B 및 담수, 해수 또는 이들의 혼합물을 포함하는 배양액에 주입하는 단계; 상기 광합성 균주를 주입한 배양액을 25~35℃에서 2~4일간 배양하는 단계를 포함하는 갑각류 양식용 미생물 제재의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 바이오 플락 1의 배양액은 당밀 10~50L, 당 1~5 kg, 쌀겨 1~10L 및 담수, 해수 또는 이들의 혼합물 1000L의 혼합물이고,
    상기 바이오 플락 2의 배양액은 말산염 1~20kg, 비타민 B 0.5~5L 및 담수, 해수 또는 이들의 혼합물 1000L의 혼합물인 갑각류 양식용 미생물 제재의 제조방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 갑각류 양식용 미생물 제재를 4~6일 주기로 갑각류 양식장의 사육수에 반복하여 투여하는 미생물 제재 투여단계; 및
    상기 사육수의 수온을 20~35℃로 유지하며 갑각류를 사육하는 갑각류 양식단계를 포함하는 갑각류 생산성 증진 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 미생물 제재 투여단계는 사육수에 대한 미생물 제재의 농도가 사육수 50ton에 대한 미생물 제재 1L를 농도 100%로 할 때 100~140%가 되도록 미생물 제재의 투여량을 조절하는 단계를 더 포함하는 갑각류 생산성 증진 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 미생물 제재 투여단계는 미생물 제재의 투여 전에 사육수의 아질산 농도 1~5ppm, 암모니아 농도 0.01~0.1ppm, pH 6~9 및 화학적 산소 요구량(COD) 3~10ppm 중 하나 이상의 조건을 만족하도록 조절하는 단계를 더 포함하는 갑각류 생산성 증진 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 갑각류 생산성 증진 방법은 상기 미생물 제재가 사육수의 수질을 개선하여 양식되는 갑각류의 면역력을 증진시킴으로써 흰반점 바이러스에 의한 갑각류 폐사율을 감소시키는 방법인 갑각류 생산성 증진 방법.
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