CN112322549B - 一种高效转化维生素d3为其活性形式的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效转化维生素D3为其活性形式的菌株及其应用，本发明属生物技术领域，涉及一株高效转化维生素D3的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H‑1及其应用，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20362。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H‑1能转化维生素D3为25‑OH‑VD3和1α,25‑diOH‑VD3，在底物投料量为1.0g/L的条件下，底物转化率达95％，25‑OH‑VD3浓度达26mg/L，摩尔得率4.90％；1α,25‑diOH‑VD3浓度达23mg/L，摩尔得率4.25％。

Description

一种高效转化维生素D3为其活性形式的菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效转化维生素D3为其活性形式的菌株及其应用，尤其涉及一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1及其高效转化维生素D3为25-OH-VD3和1α,25-diOH-VD3的方法。
背景技术
维生素D3是固醇类衍生物，在世界卫生组织的基本药物目录中，维生素D3是卫生系统中最安全，最有效的药物，其在人体内的主要活性形式为25-OH-VD3和1α,25-diOH-VD3。25-OH-VD3能够抑制细胞增生、刺激细胞分化、抑制肾素合成、刺激巨噬细胞内抑菌肽合成和促进骨骼肌细胞钙离子内流，被用于治疗骨质疏松症、佝偻病、骨软化症等代谢性骨病的治疗，以及血液透析所致的低血钙症，使血清钙水平增高。 25-OH-VD3是获得美国食品药品管理局(FDA)认证的一般公认安全级(GRAS)维生素D3代谢物，直接补充25-OH-VD3，能够缩短维生素D3在机体的代谢过程，加快钙的吸收速度，减轻肝脏的负担，同时避免了因肠道损伤，肝脏、肾脏功能障碍时在吸收利用方面的影响。25-OH-VD3在饲料添加剂方面也有广泛应用，通过调节细胞免疫增强对疾病抵抗力，并能能够改善禽畜肉品质。1α,25-diOH-VD3是比25-OH-VD3活性更高的形式，用于调节血浆钙和磷的稳态，控制多种细胞反应，包括细胞分化和增殖，已经在临床上用于治疗慢性肾功能衰竭，甲状旁腺功能亢进症，骨质疏松症和牛皮癣，生理活性比25-OH-VD3高2～5倍。
活性维生素D3最初由生物组织中提取的，但分离困难、成本高昂且收率极低，严重制约了其应用。目前生产羟基维生素D3的常用方法有化学合成与生物催化法。化学合成法的基本路线是以胆固醇及相关衍生物为原料，通过多步化学反应(需要多步基团保护和脱保护，经光照反应，开环和异构化)获得活性维生素D3，但该过程反应步骤多、转化率低，且分离纯化过程复杂。微生物转化法通过微生物进行，具有生产成本低、条件温和，安全低耗等优点，在未来的活性VD3药物生产领域具有广泛的应用前景。但由于维生素D3是脂溶性化合物，在水相中溶解度极低，造成转化过程中底物投料浓度和转化效率都非常低，这些问题直接成为25-OH-VD3和1α,25-diOH-VD3工业生产中的瓶颈。因此，筛选一株高效转化维生素D3的微生物具有非常重要的意义，目前关于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1用于转化维生素D3同时生成25-OH-VD3和 1α,25-diOH-VD3的研究未见报道。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一株高效转化维生素D3的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1，以及利用该菌株转化维生素D3为25-OH-VD3和1α,25-diOH-VD3的方法，可达到高底物投料浓度、高底物转化率、高产物得率的要求。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明的发明人从土壤样品中分离筛选获得一株巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium) H-1，该菌于2020年9月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.20362。
应用上述微生物转化维生素D3生产25-OH-VD3和1α,25-diOH-VD3的方法，其步骤如下：
(1)制备巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株的菌株种子液：采用保藏号为CGMCC No.20362的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到菌液，将该菌液涂布到LB固体培养基上。挑取LB固体培养基上的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株一环，接种于己灭菌的装有5-20mL种子培养基的100mL锥形瓶中，培养温度为25-40℃，置摇床上以120-220r/min的转速培养12-24h，即得到巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株的菌株种子液。
(2)菌体培养：将步骤(1)中制备好的菌株种子液以5-15％(w/w)的接种量接入发酵培养基，装液量为250mL锥形瓶中装20-60mL发酵培养基，培养温度为25-40℃，在120-220r/min的转速下培养12-24h，得巨大芽孢杆菌H-1菌液。
(3)生物转化：精确称取10-250mg维生素D3溶于250μL乙醇，投入步骤(2) 中的巨大芽孢杆菌H-1菌液，使其终浓度为0.1-5g/L，在转化温度30℃，120-220r/min 的转速下转化24-96h，即得转化液。
进一步的，步骤(1)所述种子培养基的成分及配比为：葡萄糖5-20g/L；胰蛋白胨5-20g/L；酵母提取物5-15g/L；玉米浆5-15g/L；NaCl 5-15g/L；(NH4)2SO4 1-10g/L； KH2PO41-10g/L；MgSO4 1-10g/L；CaCO3 1-10g/L，在115℃高压蒸汽下灭菌7min；
步骤(2)所述的转化培养基的成分及配比为：葡萄糖5-20g/L；胰蛋白胨5-20g/L；酵母提取物5-15g/L；玉米浆5-15g/L；NaCl 5-15g/L；(NH4)2SO4 1-10g/L；KH2PO4 1-10 g/L；MgSO4 1-10g/L；CaCO3 1-10g/L；2-羟丙基-β-环糊精10-100g/L，在115℃高压蒸汽下灭菌7min。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优势：
本发明所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株发现可转化维生素D3生成25-OH-VD3，1α,25-diOH-VD3，并且能达到高区域选择性、高底物转化率要求，是一株极具开发研究价值的生产菌株。
附图说明
图1为实施例1筛选获得的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株菌落形态图。
图2为实施例1筛选获得的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株显微形态图。
图3为实施例3中巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株催化维生素D3生成 25-OH-VD3，1α,25-diOH-VD3的液相色谱图
图4为实施例3中巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株转化维生素D3的过程研究。
图5为LB转化培养基和GPY转化培养基对转化效果的影响对比。
图6为不同底物投料量对转化效果的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1维生素D3羟化菌株的筛选、鉴定以及保存
(1)维生素D3羟化菌株的筛选
本发明从土壤中获取样品，称取5-10g土样于250mL三角瓶中，用无菌水悬浮，于30℃，220r/min下孵育2h。
将1mL悬浮液接种到50mL富集培养基中，并在30℃，220r/min下孵育3天。每 3天将1mL培养物转移到新鲜的富集培养基中，进行三个连续的继代培养。
将菌液梯度稀释后涂布在分离培养基上，30℃静置培养至长出菌落。
作为优选实施方式，在本实施例中，将菌落分别接种到50mL转化培养基，30℃，220r/min条件下培养，生长12-24h后，加入25mg溶于250μL乙醇的维生素D3，继续发酵24-96h，即得转化液。
吸取500μL转化液，用1mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相、烘干并以2mL甲醇复溶，经0.22μm有机膜过滤后，通过高效液相色谱检测目标产物生成。
高效液相色谱检测条件为，色谱柱：安捷伦TC-C18(2)柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测程序：以50-100％乙腈/水(v/v)为流动相进行线性梯度洗脱12min，然后用100％乙腈洗脱13min，在下一次进样前再进行重新平衡5min；柱温：40℃；检测波长：265 nm；进样量：20μL；流速：1mL/min。
作为优选实施方式，在本实施例中，筛选分离过程所用富集培养基的成分及配比为：葡萄糖10g/L；蛋白胨5g/L；FeSO4·7H2O 2mg/L；(NH4)2SO4 0.1g/L；K2HPO4 0.1g/L；CaSO4 50mg/L；MgSO4·7H2O 0.2g/L，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。
作为优选实施方式，在本实施例中，所用分离培养基的成分及配比为：K2HPO4 0.2g/L；(NH4)2SO4 0.2g/L；MgSO4·7H2O 0.4g/L；FeSO4·7H2O 2mg/L；CaSO4 100mg/L； 2-羟丙基-β-环糊精20g/L；VD3 0.1mM；琼脂20g/L，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。
作为优选实施方式，在本实施例中，所用转化培养基的成分及配比为：葡萄糖15g/L；胰蛋白胨15g/L；酵母提取物5g/L；玉米浆7.5g/L；NaCl 7.5g/L；(NH4)2SO4 3g/L；KH2PO4 2g/L；MgSO4 1g/L；CaCO3 1g/L，2-羟丙基-β-环糊精20g/L。在115℃高压蒸汽下灭菌7min。
(2)维生素D3羟化菌株的鉴定
生理生化鉴定：参照伯杰细菌鉴定手册第8版。
该菌株在LB固体培养基培养12h后，筛选获得巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium) H-1菌株，该菌落外观为圆形，边缘平整，初期菌落为半透明，后成乳白色，扁平内凹，生长后期一般带黄色，符合巨大芽孢杆菌菌落特征(图1)。显微镜观察显示，该菌呈杆状，长度达4μm，末端圆，短链排列(图2)。结合菌株16s rNDA(SEQ ID No.1)比对结果，表明该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，命名为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)H-1。
(3)维生素D3羟化菌株的保存
挑取一环巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株接种于LB液体培养基中，30-40℃，220r/min振荡培养12-24h后，取0.8mL的细胞培养液转入装有0.8mL的30％甘油保藏管中，-80℃冷冻保藏。该菌2020年9月4日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.20362。
实施例2巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株转化维生素D3(方案1)
(1)制备巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株转化维生素D3的种子液：
挑取固体LB培养基上的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株转化维生素D3 一环，接种在装有10mL LB种子培养基的100mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以220r/min的转速培养12h至对数期，即制得巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1 菌株转化维生素D3的种子液。
(2)菌体培养：将上述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株的种子液以10％(w/w)的接种量接种在装有已灭菌的50mL LB发酵培养基的250mL锥形瓶中，在 30℃条件下，置于摇床上以220r/min的转速培养，发酵12h，菌体进入对数中后期。
LB种子培养基的成分及配比为：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl 5g/L。在121℃高压蒸汽下灭菌20min。
LB转化培养基的成分及配比为：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl 5g/L；羟丙基β环糊精20g/L。在121℃高压蒸汽下灭菌20min。
(3)生物转化：精确称取25mg维生素D3溶于250μL乙醇，投入步骤(2)中的菌体发酵液，使维生素D3终浓度为0.5g/L，在转化温度30℃，220r/min的转速下转化 96h，即得转化液。
(4)转化液处理及产物检测如实施例1。
实施例3巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株转化维生素D3(方案2)
(1)制备巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株转化维生素D3的种子液：
挑取固体LB培养基上的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株转化维生素D3 一环，接种在装有10mL GPY种子培养基的100mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以220r/min的转速培养12h至对数期，即制得巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1 菌株转化维生素D3的种子液。
(2)菌体培养：将上述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株的种子液以10％(w/w)的接种量接种在装有已灭菌的50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在30℃条件下，置于摇床上以220r/min的转速培养，发酵12h，菌体进入对数中后期。
GPY种子培养基的成分及配比为：葡萄糖15g/L；胰蛋白胨15g/L；酵母提取物5 g/L；玉米浆7.5g/L；NaCl 7.5g/L；(NH4)2SO4 3g/L；KH2PO4 2g/L；MgSO4 1g/L；CaCO3 1g/L。在115℃高压蒸汽下灭菌7min。
GPY转化培养基的成分及配比为：葡萄糖15g/L；胰蛋白胨15g/L；酵母提取物5 g/L；玉米浆7.5g/L；NaCl 7.5g/L；(NH4)2SO4 3g/L；KH2PO4 2g/L；MgSO4 1g/L；CaCO3 1g/L；羟丙基β环糊精20g/L。在115℃高压蒸汽下灭菌7min。
(3)生物转化：精确称取25mg维生素D3溶于250μL乙醇，投入步骤(2)中的菌体发酵液，使维生素D3终浓度为0.5g/L，在转化温度30℃，220r/min的转速下转化 96h，即得转化液。
(4)转化液处理及产物检测如实施例1。
实施例4巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株转化维生素D3(方案3)
(1)制备巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株转化维生素D3的种子液及菌体培养如实施例3。
(2)生物转化：精确称取25mg、50mg、75mg、100mg维生素D3溶于250μL 乙醇，投入步骤(1)中的菌体转化液，使维生素D3终浓度分别为0.5g/L、1.0g/L、1.5 g/L、2.0g/L，在转化温度30℃，220r/min的转速下转化96h，即得转化液。
(3)转化液处理及产物检测如实施例1。
实施例结果分析：
如图1所示，该菌落外观为圆形，边缘平整。初期菌落为半透明，后成乳白色，扁平内凹，生长后期为带黄色，符合巨大芽孢杆菌菌落特征。
如图2所示，该菌呈杆状，长度达4μm，末端圆，短链排列，符合巨大芽孢杆菌菌体形态特征。
如图3所示，其中a为1α,25-diOH-VD3，25-OH-VD3和VD3标准品液相曲线；b 为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1菌株转化液相曲线，两个主要产物保留时间分别与1α,25-diOH-VD3，25-OH-VD3保留时间对应。
如图4所示，在0.5g/L底物投料量下，转化过程中25-OH-VD3浓度于36h达到最高值，为17.6mg/L；1α,25-diOH-VD3浓度于60h达到最高值，为16.2mg/L。
实施例2、3对比了LB与GPY两种种子培养基及转化培养基的优劣，结果如图5 所示，GPY转化培养基较LB转化培养基更适于维生素D3的生物转化，25-OH-VD3产量差异为1.5倍，1α,25-diOH-VD3产量差异达3.9倍。
实施例4对比了不同的底物浓度对产物产量的影响，结果如图6所示，在1g/L的底物浓度下，两种产物的产量均达到最高，为最优投料量。
综上，本发明提供了一株高效转化维生素D3的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium) H-1并提供了其应用。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1能催化维生素D3，同时生成25-OH-VD3和1α,25-diOH-VD3，在底物投料量为0.5-1g/L的条件下，底物转化率达到85-95％，25-OH-VD3产率达到3-5％，1α,25-diOH-VD3产率达到3～4％。尤其是在底物投料量为1.0g/L的条件下，底物转化率达95％，25-OH-VD3浓度达26mg/L，摩尔得率4.90％；1α,25-diOH-VD3浓度达23mg/L，摩尔得率4.25％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种高效转化维生素D3为其活性形式的菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1393
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium H-1)
<400> 1
tgcagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg ttagcggcgg acgggtgagt 60
aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg ggaaaccgaa gctaataccg 120
gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg tttcggctat cacttacaga 180
tgggcccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggca acgatgcata 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360
tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga agaacaagta caagagtaac 420
tgcttgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagaa aagcggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt ttggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa 720
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
ctctagagat agagcgttcc ccttcggggg acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080
tgccagcatt tagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140
gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg 1200
tacaaagggc tgcaagaccg cgaggtcaag ccaatcccat aaaaccattc tcagttcgga 1260
ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380
cacccgaagt cgg 1393

Claims (8)

1.一种巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1，其特征在于：于2020年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20362。
2.一种维生素D3的体外微生物转化方法，其特征在于：使用如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌( Bacillus megaterium)H-1。
3.根据权利要求2所述的维生素D3的体外微生物转化方法，其特征在于：转化维生素D3为25-OH-VD3和1α，25-diOH-VD3。
4.根据权利要求2或3所述的维生素D3的体外微生物转化方法，其特征在于：具体方法为：制备巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H-1的菌株种子液，接入转化培养基培养，得到的菌液中加入维生素D3，经生物转化后得转化液。
5.根据权利要求4所述的维生素D3的体外微生物转化方法，其特征在于：菌株种子液使用的种子培养基成分及配比为：葡萄糖5-20g/L，胰蛋白胨5-20g/L，酵母提取物5-15g/L，玉米浆5-15g/L，NaCl 5-15g/L，(NH4)2SO4 1-10g/L，KH2PO4 1-10g/L，MgSO4 1-10g/L，CaCO31-10g/L；生物转化使用的转化培养基的成分及配比为：葡萄糖5-20g/L，胰蛋白胨5-20g/L，酵母提取物5-15g/L，玉米浆5-15g/L，NaCl 5-15g/L，(NH4)2SO4 1-10g/L，KH2PO4 1-10g/L，MgSO4 1-10g/L，CaCO3 1-10g/L，羟丙基-β-环糊精10-100g/L。
6.根据权利要求4所述的维生素D3的体外微生物转化方法，其特征在于：加入维生素D3的时间节点为菌株在培养基中生长12-24h后。
7.根据权利要求4所述的维生素D3的体外微生物转化方法，其特征在于：维生素D3共10-250mg溶于250μL乙醇后，再投入菌液中。
8.根据权利要求4所述的维生素D3的体外微生物转化方法，其特征在于：投入菌体发酵液中的维生素D3的终浓度为0.2-5g/L。
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