CN101914433A - 发酵与扩张床原位吸附耦合的乳酸生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵与分离耦合的乳酸生产装置和利用扩张床原位吸附实现在线分离的乳酸发酵工艺，本发明将扩张床与发酵罐相偶联，利用扩张床的方法实现了乳酸发酵的在线分离，解除了乳酸的反馈抑制，提高了乳酸发酵的产率和转化率，同时解决了以往使用固定床吸附乳酸时，菌体堵塞床体的问题，允许未经处理的发酵液直接进入层析柱。由于实现了发酵、分离的同步，大大减少了以往工艺中的下游提取和分离费用。

Description

发酵与扩张床原位吸附耦合的乳酸生产工艺

技术领域

本发明属于生物技术领域，公开了一种乳酸生产的新工艺。具体的说是采用发酵方法生产乳酸；发酵过程中，采用扩张床分离乳酸的工艺与发酵过程耦合，实现乳酸的在线分离。

背景技术

乳酸是一种重要的多用途有机酸，广泛用于食品、医药、化工、制革、纺织、环保和农业生产等领域。乳酸的衍生物-聚乳酸(PLA)，可以用来生产可生物降解纤维、可生物降解塑料以及可生物降解医用材料等，目前引起了越来越多学者的关注。

乳酸生产可分为化学合成法和微生物发酵方法。其中化学合成方法环境污染严重，原料价格较贵；而微生物发酵法生产乳酸原料来源广泛，生产成本低、产品光学纯度高、安全性高，所以成为生产乳酸的重要方法。

自然界中可产生乳酸的微生物很多，但目前应用发酵法生产L-乳酸常用的微生物仅有两大类，一类为乳酸细菌(Lactic acid bacteria)；另一类为根霉(Rhizopus)。

目前，国内外多采用根霉中的米根霉(Rhizopus oryzae)进行L-乳酸的发酵。米根霉营养要求低，在发酵过程中对低pH环境有较高的耐受性，并且产物为高光学纯度的L-乳酸。但是，根霉的乳酸产率和转化率比乳酸细菌低，并且产物除了乳酸外，还有富马酸、琥珀酸、甘油和乙醇等大量的副产物，使乳酸的提取和精制变得困难。

基于上述原因，近年来人们逐渐将目光转向同型发酵的乳酸细菌。用于乳酸生产的菌属：主要有乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptoccoccus)和芽胞杆菌属(Bacillus)以及最近报道的肠球菌属(Enterococcus)。近年来，已经用于生产的主要是乳杆菌。通过菌种选育和培养物质及培养条件的控制，发酵生产的L-乳酸可以达到高的光学纯度。并且乳杆菌的厌氧发酵或兼性厌氧发酵使可以大规模降低能耗，有利于连续发酵，减少乳酸的生产成本。同型发酵的乳杆菌的实际转化率大多在90％以上。另外，乳杆菌生长速率较高，在很短的时间形成优势菌群，不易污染杂菌。从国际乳酸生产研究发展上看，应用乳杆菌进行L-乳酸生产已成为趋势。尤其是鼠李糖乳杆菌(Lb.rhamnosus)生产L-乳酸，转化率高，产品光学纯度高，成为研究者关注的热点。

乳酸发酵是一个典型的产物抑制性发酵过程，大量乳酸的积累严重抑制了发酵进程和乳酸菌的生长。乳酸发酵最适pH值为5.5-6.0，pH值小于5.0时发酵被抑制，乳酸产率仅约为1.6％。乳酸发酵过程中随着乳酸的不断产生，发酵液的pH值不断降低，使乳酸菌的生长和产酸受到抑制，乳酸产率降低。如果不及时将产物分离或中和，发酵将无法继续进行下去。

传统的发酵方法是添加碳酸钙、氢氧化钠、氨水中和产生的乳酸，以维持最适pH值。由于乳酸钙溶解度大，约有30％乳酸钙残留在结晶母液中，不能析出。此外过高的乳酸盐对乳酸菌的代谢也有抑制作用，在发酵液中造成乳酸菌活性下降，而使发酵周期延长。发酵与分离耦合可以有效地解决这一问题。目前常用的发酵与分离耦合方法有：电渗析(EDF)法、萃取法和离子交换层析法。电渗析法有很多优点：(1)不用中和剂就可以控制pH值；(2)降低产物抑制；(3)浓缩产物；(4)简化后提取工艺。但若不组合精密过滤装置，乳酸菌细胞会逐渐附着到阴离子膜上，造成乳酸菌细胞被杀死，发酵液中活细胞减少；另外还会导致渗析膜电阻增大，电渗析效率下降。因此，在乳酸的电渗析法连续生产中，乳酸菌对膜的吸附成为限制因素。萃取法提取发酵具有能耗低，溶剂选择性高和无细菌污染等优点。研究者对乙醇、丁醇的提取发酵进行了广泛的研究，十二烷醇、油醇是常用的提取剂。但是目前萃取的方法还是停留在研究阶段，而且反萃问题尚未得到很好的解决。

从工业化生产的角度来看，离子交换树脂法以选择性高、交换容量大、操作简便、易于自动化控制等优点具有较强的竞争力。但是目前用来进行乳酸吸附的层析柱都是固定床层析柱，如：乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产乳酸(CN200310106657.8)，可是在进入层析柱之前仍需要先经过固液分离处理，否则发酵液带着渗漏的菌体进入固定床层析柱就很容易发生堵塞，无法实现原位分离。然而利用扩张床层析柱与发酵相耦合则可以克服固定床的缺点，实现在线分离乳酸，解除抑制。

本发明使用的扩张床吸附(Expanded bed adsorption.EBA)技术是20世纪90年代发展起来的新型分离纯化技术。不同于固定床和流化床，扩张床中介质处于稳定分级的流化状态，一方面介质在向上液流的影响下适度扩张，增大了介质之间的空隙，使得固体小颗粒(如细胞、细胞碎片等)能直接通过床层，另一方面稳定分级的床层结构限制了介质的运动，使其稳定在一定的区域，所以分离效果可与固定床层析相当，这两方面的因素共同决定了扩张床的特色：能够实现直接从含有细胞的培养液或含有细胞碎片的匀浆液中提取目标产物。流化床吸附可以直接处理含固体颗粒的进料，但分离效率低，不得不通过循环进样来获得改进；固定床层析分离效率虽高，但进料中的固体颗粒往往会引起床层的堵塞，必须在层析操作之前加上一系列的预处理过程。扩张床吸附技术作为一个新的单元操作，综合了流化床和固定床的优点，同时克服了流化床和固定床自身的一些缺陷，既可以直接处理含固体颗粒的进料，又具有与固定床相当的分离效率。与固定床使用的层析柱相比，最大的不同之处在于两个分布器。下分布器既要保证流体分布的均匀，使流体以平推流的形式流过床层，又要确保料液中固体颗粒悬浮物能顺利通过分布器，不造成阻塞。另外，分布器的设计还必须考虑到剪应力的影响，使剪应力控制在最小范围内，以防止活性产品的失活。而上分布器一般要求可以上下移动，以适应于不同的扩张床高度，分布器内可安装一层网隔，目的是防止介质颗粒冲出柱子，同时保证进料中的固体小颗粒可以顺利通过。Amersham Biosciences公司最先推出商业化的扩张床柱，命名为Streamline。

扩张床吸附技术集过滤、浓缩和初步纯化于一步完成，减少了操作步骤，缩短了操作时间，能提高收率和降低成本。其特点是既能像移动床一样处理含悬浮颗粒的液体，又能像固定床一样，混返程度低，分离效率高。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵与分离耦合的乳酸生产装置和利用扩张床吸附实现在线分离的乳酸发酵工艺，以解除乳酸的反馈抑制问题，提高乳酸产率和转化率，克服现有工艺的缺陷。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的发酵与分离耦合的乳酸生产装置，包括微生物发酵部分和分离部分，发酵部分由发酵罐构成，分离部分由至少二个扩张床层析柱构成。发酵罐底部出料口与扩张床层析柱底部开口通过管路连接，在连接发酵罐底部出料口与扩张床层析柱底部开口的管路上设置有传输泵，扩张床层析柱底部开口处设置有截止阀；扩张床层析柱底部开口还通过管路与洗脱液储罐和再生液储罐连接，在连接扩张床层析柱底部开口与洗脱液储罐和再生液储罐的管路上设置有传输泵，洗脱液储罐和再生液储罐的开口处设置有截止阀；扩张床层析柱顶部开口通过四通阀与发酵罐顶部进料口和乳酸储罐相连。在连接扩张床层析柱底部开口与发酵罐底部出料口和洗脱液储罐及再生液储罐的管路上设置有用以调节通路的四通阀门；发酵罐的顶部进料口与高位补料罐连接。

由于扩张床的介质有具体的限制，所需的吸附剂必须是符合扩张床流体性质的，具有一定粒径分布的树脂，例如：大孔吸附树脂、弱碱性阴离子交换树脂或强碱性阴离子交换树脂。如D301弱碱性阴离子离子交换树脂。

本发明提供的在线分离乳酸的发酵生产方法，其特征在于：微生物发酵和乳酸分离同时进行，实现乳酸的在线分离，包括以下步骤：

1)发酵罐接种：按常规方法准备培养基后，将乳酸菌接种到发酵罐中，进行发酵；

2)扩张床层析柱吸附：当发酵罐中的乳酸积累使发酵罐中pH低于乳酸菌发酵的耐受值后，调节与扩张床层析柱相连的阀门和传输泵，使得含有乳酸、残糖和乳酸菌菌体的发酵液直接进入到第一个扩张床层析柱中，其中乳酸被吸附介质分离，菌体、糖类及其他营养元素则回流入发酵罐中，此时发酵罐中pH回升，传输泵停止工作；当pH再次低于乳酸菌耐受值时，再次启动传输泵，如此循环；

3)扩张床层析柱更换：当第一个扩张床层析柱中吸附介质饱和后，调节阀门和传输泵，将第二扩张床层析柱与发酵罐相连，进行吸附乳酸；当第二层析柱吸附饱和后，可以再使用第三层析柱，依此类推；

4)扩张床层析柱再生：当扩张床层析柱中介质吸附饱和后，使用洗脱液、再生液依次对该扩张床层析柱进行洗脱和再生，当再生液经过扩张床层析柱后pH达到10.0以上时，再生完全，该扩张床层析柱进入待用状态，需要时再将发酵罐与该层析柱连通；乳酸被洗脱至产物储罐；

上述方法中发酵罐中的温度保持在30-60℃，pH保持在5.0～7.4；所述的洗脱和再生的温度是10-100℃，所述的洗脱液是无机酸HCl、H₂SO₄或H₃PO₄；所述的再生液为无机碱NaOH或KOH。

本发明利用的扩张床既能像移动床一样处理含悬浮颗粒的液体，又能像固定床一样，混返程度低，分离效率高的特性。避免了以往固定床与发酵罐直接相连，使层析柱堵塞的问题，省略了发酵罐和层析柱之间的固液分离装置，实现了层析柱与反应器的直接偶联。既可以原位吸附产物乳酸，又不会造成堵塞。

本发明首次利用扩张床的方法实现了乳酸发酵的原位分离，将扩张床与发酵相耦合，解除了乳酸的反馈抑制，提高了乳酸发酵的产率和转化率。同时解决了以往使用固定床吸附乳酸时，菌体堵塞床体的问题，省去了固定床与发酵罐之间的膜分离设备。由于允许未经处理的发酵液直接进入层析柱，实现了发酵、分离的同步，大大减少了以往工艺中的下游提取、分离费用。

附图说明：

图1为本发明发酵与扩张床原位吸附耦合的乳酸生产装置实施例图，图中数字标识所示部份为：

1：高位补料罐；

2：发酵罐；

3：一号传输泵

4：一号四通阀门

5：一号扩张床层析柱

6：二号扩张床层析柱

7：一号截止阀

8：二号截止阀

9：二号四通阀门

10：二号传输泵

11：三号截止阀

12：洗脱液储罐

13：四号截止阀

14：再生液储罐

15：乳酸储罐

图中虚线部分表示可以按需要添加的扩张床和截止阀。

具体实施方式

实施例1

本发明的装置包括：高位补料罐、发酵罐、传输泵、四通阀门、扩张床层析柱、洗脱液储罐、再生液储罐、截止阀、乳酸储罐。如附图1所示。

本装置按需要可有两个或两个以上的扩张床层析柱，其顶部通过四通阀门与乳酸储液罐和发酵罐循环液进口相连；底部通过四通阀门与洗脱液储罐、再生液储罐以及发酵罐循环液出口相连；

所述的发酵罐带有搅拌装置、补料罐、电极，底部分别有发酵循环液的进口、进气口和出料口。

本发明是利用扩张床吸附、原位提取乳酸发酵分离的工艺：

发酵：发酵罐中的菌种能够在较高糖浓度下进行发酵，糖浓度为20g/L-200g/L之间。调节pH在5.0-7.4，115℃下灭菌30min。在无菌条件下进行接种，接种量为1％-10％，开启搅拌，使发酵温度保持在30-50℃。按照需要用酶膜生物传感分析仪随时监测发酵液中糖的含量，当糖的含量降低到2％时，可按需要从高位补料罐向发酵罐中补充浓糖液，直至发酵罐中的糖浓度达到10％-20％为止。

扩张床层析柱吸附：发酵过程中pH逐渐降低，当发酵液中的pH降到5.0时，打开扩张床层析柱底部的截止阀，调节一号四通阀门4和二号四通阀门9，使得扩张床层析柱与发酵罐2相连，通过一号传输泵3实现发酵液在发酵罐与扩张床之间的循环，经过扩张床层析柱除去发酵产生的乳酸的发酵液返回到发酵罐中；当pH恢复到6.5后，关闭一号传输泵3和截止阀，发酵继续进行。

扩张床层析柱更换：发酵产生的乳酸经过一号扩张床层析柱5吸附，当回流的发酵液pH为5.0时，认为一号扩张床层析柱5吸附饱和，对一号扩张床层析柱进行洗脱、再生，再生完成后进入待用状态；同时进行扩张床层析柱的更换，将与二号扩张床层析柱6相连的二号截止门8打开，并调节一号四通阀门4和二号四通阀门9，使得二号扩张床层析柱6与发酵罐2相连，循环液通过二号扩张床层析柱6。等到二号层析柱6饱和后，重复上一步操作，对其进行洗脱和再生，二号层析柱进入待用状态，反复循环。当使用多个层析柱时，此方法进行类推。

扩张床层析柱再生：当一号扩张床层析柱5吸附饱和后，对一号扩张床层析柱5的再生；打开一号截止阀7、三号截止阀11、四号截止阀13，调节一号四通阀门4、二号四通阀门9，通过管路使得洗脱液储罐、再生液储罐和乳酸储罐与一号层析柱连通。通过调节二号传输泵10，使洗脱液储罐12、再生液储罐14中的洗脱液和再生液分别对一号扩张床层析柱5进行洗脱和再生，其中洗脱液是无机酸(HCl，H₂SO₄，H₃PO₄)，再生液为无机碱(NaOH，KOH)，他们的浓度范围分别是0.5wt％-40wt％，将洗脱的乳酸存放于乳酸储罐中；再生完成后，关闭一号截止阀7、三号截止阀11、四号截止阀13和二号传输泵10，一号扩张床层析柱5进入待用状态；二号扩张床层析柱6吸附饱和后，重复上述步骤。当使用多个层析柱时，此方法进行类推。将洗脱的粗乳酸经过脱色、浓缩、除杂后得到高纯度的乳酸。经过再生后的层析柱继续投入使用，其中扩张床层析柱经过10次吸附、洗脱、再生后，其解吸率不低于原来的90％。

实施例2

参见图1。本发明发酵与扩张床原位吸附耦合的乳酸生产装置包括1个发酵罐，两个并联的扩张床层析柱，两个传输泵，4个截止阀，2个四通阀门，高位补料罐，洗脱液储罐，再生液储罐和乳酸储罐。

发酵罐2与一号扩张床层析柱5和二号扩张床层析柱6通过管路连接，一号扩张床层析柱5和二号扩张床层析柱6的底部开口分别连接有截止阀7、8，并通过二号四通阀9与发酵罐2的底部出料口和洗脱液储罐12及再生液储罐14相连；一号扩张床层析柱5和二号扩张床层析柱6的顶部开口通过一号四通阀4与发酵罐2的顶部进料口和乳酸储罐15相连。

在发酵罐2与一号、二号扩张床层析柱5、6的连接管路中，安装有传输泵3；在洗脱液储罐12、再生液储罐14与一号、二号扩张床层析柱5、6的连接管路中安装有传输泵10；洗脱液储罐12和再生液储罐14的出口处分别设置有截止阀11、13。

高位补料罐1通过管路与发酵罐2的一个进料口相连。

利用扩张床吸附、原位提取乳酸发酵分离的工艺如前文所述。

发酵所选的微生物是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。培养基的配制：种子培养基的配方(单位：g/L)蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，K₂HPO₄2，柠檬酸铵2，乙酸钠5，葡萄糖20，吐温801mL，MgSO₄·7H₂O 0.58，MnSO₄·4H₂O 0.25，蒸馏水1000mL，调节pH值为6.0-7.0，121℃灭菌30min；发酵培养基配方(单位：g/L)，葡萄糖150，MgSO₄·7H₂O 0.2，酵母粉15，K₂HPO₄0.3，KH₂PO₄0.3，MnSO₄0.03，FeSO₄·7H₂O 0.03，调节pH值为6.0-7.0，121℃灭菌30min。

在无菌条件下接种，接种量为5-10％(v/v)。开启搅拌，发酵罐搅拌桨转速为100-150rpm，在37-45℃条件下进行发酵。

在发酵过程中，乳酸不断积累，当pH下降到5.0以下时，开启传输泵，调节相关四通阀门，打开相关截止阀，扩张床中的介质不断吸附乳酸，并中和发酵液，当pH大于5.0时，关闭传输泵。

发酵液中的乳酸经过一号扩张床层析柱吸附后，用pH计检测循环液的pH值，当pH值小于5.0时，则认为该扩张床层析柱已经吸附饱和；在20-45℃下对扩张床进行洗脱和再生，再生完成后一号扩张床进入待用状态，洗脱的粗乳酸存放在乳酸储罐中；与此同时，将二号扩张床与发酵罐连接，利用二号扩张床对发酵产生的乳酸进行吸附，当二号扩张床吸附饱和后，进行洗脱、再生；同时将一号扩张床与发酵罐连接，进行吸附乳酸，如此循环。

按照需要，可以进行补料。利用酶膜生物传感器对发酵罐中的糖含量进行检测，当发酵液中的糖含量低于20g/L时，可以从高位补料罐进行补料；当发酵液中含糖量达到100-150g/L时，停止补料。

考察发酵耦合扩张床层析柱原位分离发酵的乳酸产量、补料不原位分离发酵的乳酸产量以及未补料未原位分离发酵的乳酸产量。实验结果如表1所示。

表1不同发酵方式比较

从实验结果可以看出，未补料、未原位分离时乳酸产量很低，仅为30.6g/L，这说明乳酸的对发酵的抑制作用相当明显；当采用半连续发酵时，乳酸产量显著提高，但是产量还是偏低；当采用扩张床原位分离时，抑制被解除，达到了半连续发酵产量的2倍。

实施例3

采用上述的扩张床系统。进行扩张床层析柱耦合原位分离批式发酵。根据培养基中初糖的含量，发酵在48h内结束。结果如表2所示。

表2原位分离批式发酵结果

实施例3

扩张床层析柱填充柱树脂选用的类型如表3所示，树脂先用去离子水浸泡24小时，然后经过3次“1mol/L HCl、水、1mol/L NaOH、水”预处理，树脂处理为-OH型，最后用无菌水冲洗床层至中性，即准备完成。吸附饱和后，使用10wt％-40wt％H₂SO₄作为解吸剂洗脱。然后再用1mol/L NaOH或KOH进行再生。经过1次“吸附、洗脱、再生”循环后，树脂的吸附性能及解析率如表3所示。

表3

从上表的结果可以看出，本发明分离工艺好。多数树脂的交换容量高，能够一次性吸附大量的乳酸。而且经过一次吸附、洗脱后，解析率较高。

实施例4

扩张床层析柱填充柱选用的类型如表4所示，树脂先用去离子水浸泡24小时，然后经过3次“1mol/L HCl、水、1mol/L NaOH、水”预处理，树脂处理为-OH型，最后用无菌水冲洗床层至中性，即准备完成。吸附饱和后，使用10wt％-40wt％H₂SO₄作为解吸剂洗脱。然后再用1mol/L NaOH或KOH进行再生。经过10次“吸附、洗脱、再生”循环后，树脂的吸附性能及解析率如表4所示。

表4

从上表的结果可以看出，本发明连续分离工艺稳定。树脂的稳定性较高，再生10次后，吸附性能仍然能够达到一次吸附、洗脱处理的90％，保持较高水平。

Claims (10)

1.一种发酵与分离耦合的乳酸生产装置，包括微生物发酵部分和分离部分，发酵部分由发酵罐构成，其特征在于分离部分由至少二个扩张床层析柱构成。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，发酵罐底部出料口与扩张床层析柱底部开口通过管路连接，在连接发酵罐底部出料口与扩张床层析柱底部开口的管路上设置有传输泵；扩张床层析柱底部开口处设置有截止阀；扩张床层析柱底部开口还通过管路与洗脱液储罐和再生液储罐连接，在连接扩张床层析柱底部开口与洗脱液储罐和再生液储罐的管路上设置有传输泵，洗脱液储罐和再生液储罐的开口处设置有截止阀；扩张床层析柱顶部开口通过四通阀与发酵罐顶部进料口和乳酸储罐相连。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，在连接扩张床层析柱底部开口与发酵罐底部出料口和洗脱液储罐及再生液储罐的管路上设置有用以调节通路的四通阀门。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的装置，其特征在于，发酵罐的顶部进料口与高位补料罐连接。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其特征在于，扩张床层析柱中的吸附介质是大孔吸附树脂、弱碱性阴离子离子交换树脂或强碱性阴离子交换树脂。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其特征在于，扩张床层析柱中的吸附介质是D301弱碱性阴离子离子交换树脂。

7.一种在线分离乳酸的发酵生产方法，其特征在于：微生物发酵和乳酸分离同时进行，实现乳酸在线分离，包括以下步骤： 

1)发酵罐接种：按常规方法准备培养基后，将乳酸菌接种到发酵罐中，进行发酵；

2)扩张床层析柱吸附：当发酵罐中的乳酸积累使发酵罐中pH低于乳酸菌发酵的耐受值后，调节与扩张床层析柱相连的阀门和传输泵，使得含有乳酸、残糖和乳酸菌菌体的发酵液直接进入到第一个扩张床层析柱中，其中乳酸被吸附介质分离，菌体、糖类及其他营养元素则回流入发酵罐中，此时发酵罐中pH回升，传输泵停止工作；当pH再次低于乳酸菌耐受值时，再次启动传输泵，如此循环；

3)扩张床层析柱更换：当第一个扩张床层析柱中吸附介质饱和后，调节阀门和传输泵，将第二扩张床层析柱与发酵罐相连，进行吸附乳酸；当第二层析柱吸附饱和后，可以再使用第三层析柱，依此类推；

4)扩张床层析柱再生：当扩张床层析柱中介质吸附饱和后，使用洗脱液、再生液依次对该扩张床层析柱进行洗脱和再生，当再生液经过扩张床层析柱后pH达到10.0以上时，再生完全，该扩张床层析柱进入待用状态，需要时再将发酵罐与该层析柱连通；乳酸被洗脱至产物储罐。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，发酵罐中的温度保持在30～60℃，pH保持在5.0～7.4。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述的洗脱和再生的温度是10～100℃，所述的洗脱液是无机酸HCl、H₂SO₄或H₃PO₄。

10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述的再生液为无机碱NaOH或KOH。