CN110607329A - 一种发酵生产丙酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种发酵生产丙酸的方法，以富含乳酸的发酵废液为丙酸发酵培养基，通过固定化装置、发酵罐和膜分离系统相结合的方法，实现半连续式二次发酵生产丙酸，具体包括以下步骤：（1）获得第一次发酵废液作为丙酸发酵培养基；（2）将产丙酸菌液固定化；（3）发酵环节；（4）发酵液膜分离系统过滤；（5）发酵‑过滤循环交替。本发明一方面变废为宝极大地节省了废液处理成本和原料成本；另一方面，经优化的半连续式发酵工艺契合了工业化生产的需求，从原来7至10天一个批次的发酵培养周期缩短至平均60h左右，膜分离系统总和处理量达到148L/min及以上，提高了丙酸的生产效率。

Description

一种发酵生产丙酸的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，特别是涉及一种发酵生产丙酸的方法。
背景技术
丙酸是一种三碳羧酸，能够抑制真菌的生长，作为一种防腐剂与防霉剂，广泛应用于食品、饲料、医药、香料等多种领域，市场前景开阔。新型发酵法生产丙酸，可直接用作食品、饲料添加剂，与传统化学合成法相比绿色环保，受到消费者的青睐。
但现今发酵法生产丙酸的技术仍有一些不足，如有相关文献提及一种外置式植物纤维床反应器与膜分离连用，实现丙酸半连续发酵的方法。其生产过程中需填充氮气，控制成本高；固定化材质甘蔗渣难以稳定重复利用；膜分离效率较低，约6h处理4.5L料液；外源添加发酵培养基，以葡萄糖作为碳源，导致成本增加。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种发酵生产丙酸的方法，以乳酸发酵菌发酵得到的富含乳酸的发酵废液为丙酸发酵培养基基，通过固定化装置、发酵罐和膜分离系统相结合进行发酵-过滤循环交替，实现半连续式二次发酵生产丙酸。
具体技术方案包括以下步骤：
（1）选取发酵生产乳酸的菌株，进行第一次发酵，发酵结束后通过陶瓷膜过滤，得到澄清含有乳酸和氮源的废液，经蒸汽灭菌处理后用作丙酸发酵培养基；
（2）选取发酵生产丙酸的菌株，进行第二次发酵种子培养，得到种子液，将种子液接种到已添加步骤（1）所述的发酵培养基的固定化装置中进行培养，并完成种子液固定化；
（3）固定化装置中种子液培养固定化好后，发酵罐中填充步骤（1）所述发酵培养基，开启泵（1），发酵液在固定化装置与发酵罐之间循环流动，调整发酵罐内PH，控制固定化装置的温度，发酵罐内取样测定乳酸浓度为零时停止；
（4）发酵结束后，开启泵（2），发酵液流入膜分离系统的中空纤维膜组件，将固形物截留在组件内，澄清的丙酸滤液从膜组件上端流出收集；再加入新鲜发酵培养基，反向冲洗中空纤维膜的表面，将截留的固形物洗涤下来，回到发酵罐；
（5）上述步骤（4）结束后，立即进入步骤（3），进行批次循环，直至发酵效率明显下降时，终止发酵。
所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（1）中第一次发酵菌株包括植物乳杆菌、德式乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸链球菌、乳酸乳球菌、菊糖芽孢乳杆菌、嗜盐四联球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和两岐双歧杆菌。
所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（1）中第一次发酵培养基的成分包括蔗糖1.0%-10.0%，玉米浆1.0%-5.0%，酵母浸出粉0.1%-2.5%，大豆分离蛋白0.1%-2.5%，大豆脱脂蛋白0.1%-2.5%，碳酸氢二钠0.1%-2.5%，硫酸镁0.1%-2.5%；发酵培养条件为厌氧培养。
所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（2）中用于生产丙酸的菌株包括费氏丙酸菌、产丙酸丙酸杆菌、玉米丙酸杆菌、詹氏丙酸杆菌、薛氏丙酸杆菌和反刍月形单胞菌。
所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（2）中种子培养基成分包括酵母抽提物1.0g/L-50.0g/L，胰蛋白胨大豆肉汤1.0g/L-50.0g/L，乳酸钠1.0g/L-50.0g/L。
所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（2）中培养得到的种子液OD600值为3，种子接种量为1%。
所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（2）中固定化装置中填充有孔径50-500微米的微孔陶瓷环、陶瓷粒或陶瓷柱，固定化培养条件为温度28℃-42℃，时间48h-72h。
所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（3）中20%氢氧化钠调节至PH6.0-7.5，循环发酵条件：固定化装置温度28℃-42℃，循环流动流速1L/min-30L/min，发酵罐搅拌速度0-50rpm，温度28℃-42℃，发酵时间48-72h。
所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（4）中膜分离系统由一个或多个并联单元组成，膜分离系统中的中空纤维膜为聚偏氟乙烯PVDF。
本发明一方面，变废为宝极大地节省了废液处理成本和原料成本；另一方面，经优化的半连续式发酵工艺契合了工业化生产的需求，从原来7至10天一个批次的发酵培养周期缩短至平均60h左右，膜分离系统总和处理量达到148L/min及以上，大大提高了丙酸的生产效率。
附图说明
图1半连续式二次发酵法生产丙酸装置图。
具体实施方式
为了清晰表达本发明的技术优点，下面结合具体实施方案进行阐述。
实施例1
（1）选取乳酸链球菌，进行第一次发酵，过程中补加葡萄糖来提升乳酸链球菌素产量，发酵结束后通过陶瓷膜过滤，得到澄清的含有乳酸和氮源的废液，其pH为6.5，乳酸含量为53g/L，经蒸汽灭菌处理后用作丙酸发酵培养基。
其中乳酸链球菌发酵培养基成分为：蔗糖2.0%，玉米浆2.3%，酵母浸出粉：0.43%，大豆分离蛋白0.2%，大豆脱脂蛋白0.2%，磷酸氢二钠0.3%，硫酸镁0.15%，发酵条件为厌氧发酵。
（2）选取产丙酸丙酸杆菌，进行第二次发酵种子培养，培养至种子液OD600值为3时，得到种子液，接种量1%接种到已添加步骤（1）所述的发酵培养基的填充孔径50微米微孔陶瓷粒的固定化装置中进行培养，温度37℃下培养60h，完成种子液固定化。
其中产丙酸丙酸杆菌种子培养基成分为：10 g/L酵母抽提物，10 g/L胰蛋白胨大豆肉汤培养基，10 g/L乳酸钠。固定化装置如图1所示，该装置体积1000L，有保温夹套，填充满孔径50微米微孔陶瓷粒后还能添加发酵培养基820L。
（3）如图1所示，固定化装置中种子液培养固定化好之后，发酵罐中填充步骤（1）所述发酵培养基，开启泵（1），流速为12 L/min，按箭头方向在固定化装置与发酵罐之间循环流动，20%氢氧化钠调节发酵罐内PH至6.5，控制固定化装置的温度32℃，发酵罐取样测定乳酸浓度为零时停止。其中发酵罐条件为发酵罐体积5000L，搅拌速度20rpm，温度32℃，发酵时间48-72h。
（4）发酵结束后，开启泵（2），发酵液按实线箭头流入膜分离系统的中空纤维膜组件，将固形物截留在组件内，澄清的丙酸滤液从膜组件上端流出收集，其丙酸含量为35g/L-45g/L，浓缩后可直接进行喷雾干燥，也可用于进一步的丙酸盐分离提纯，该膜组件处理完5000L发酵液的时间约为30min。再加入新鲜发酵培养基，反向冲洗中空纤维膜的表面，将截留的固形物洗涤下来，回到发酵罐，整个过程持续约30min。
如图1所示，膜分离系统的中空纤维膜组件采用聚偏氟乙烯PVDF为膜材料，该装置由7个并联单元组成，图1将其简化为一个，总和处理量达到160L/min。
（5）上述步骤（4）结束后，立即进入步骤（3），进行批次循环，直至发酵效率明显下降时，大约需要15-18个批次之后，终止发酵。
（6）固定化材料再生及膜组件维护方法，每个批次中空纤维膜过滤后，采用HCL调节纯净水的PH值至2，浸泡膜组件，以此维持膜组件的过滤效率，并避免菌膜的形成；发酵终止后，采用3%的氢氧化钠溶液浸泡固定化材质微孔陶瓷粒，再用水冲刷，即可实现固定化材质的再生。
实施例2
（1）选取保加利亚乳杆菌，进行第一次发酵，发酵结束后通过陶瓷膜过滤，得到澄清的含有乳酸和氮源的废液，经蒸汽灭菌处理后用作丙酸发酵培养基。
其中保加利亚乳杆菌发酵培养基成分为：蔗糖5.0%，玉米浆2.4%，酵母浸出粉：1.6%，大豆分离蛋白1.3%，大豆脱脂蛋白2.0%，磷酸氢二钠1.8%，硫酸镁0.95%，发酵条件为厌氧发酵。
（2）选取费氏丙酸菌，进行第二次发酵种子培养，培养至种子液OD600值为3时，得到种子液，接种量1%接种到已添加步骤（1）所述的发酵培养基的填充孔径400微米陶瓷柱的固定化装置中进行培养，温度28℃下培养49h，完成种子液固定化。
其中费氏丙酸菌种子培养基成分为：20 g/L酵母抽提物，20 g/L胰蛋白胨大豆肉汤培养基，20 g/L乳酸钠。固定化装置如图1所示，该装置体积1000L，有保温夹套，填充满微孔陶瓷柱后还能添加发酵培养基820L。
（3）如图1所示，固定化装置中种子液培养固定化好之后，发酵罐中填充步骤（1）所述发酵培养基，开启泵（1），流速为4 L/min，按箭头方向在固定化装置与发酵罐之间循环流动，20%氢氧化钠调节发酵罐内PH至6.0，控制固定化装置的温度28℃，发酵罐取样测定乳酸浓度为零时停止。其中发酵罐条件为发酵罐体积5000L，搅拌速度10rpm，温度28℃，发酵时间70h。
（4）发酵结束后，开启泵（2），发酵液按实线箭头流入膜分离系统的中空纤维膜组件，将固形物截留在组件内，澄清的丙酸滤液从膜组件上端流出收集，再加入新鲜发酵培养基，反向冲洗中空纤维膜的表面，将截留的固形物洗涤下来，回到发酵罐。
如图1所示，膜分离系统的中空纤维膜组件采用聚偏氟乙烯PVDF为膜材料，该装置由7个并联单元组成，图1将其简化为一个，总和处理量达到160L/min。
（5）上述步骤（4）结束后，立即进入步骤（3），进行批次循环，直至发酵效率明显下降时，大约需要15-18个批次之后，终止发酵。
（6）固定化材料再生及膜组件维护方法，每个批次中空纤维膜过滤后，采用HCL调节纯净水的PH值至2，浸泡膜组件，以此维持膜组件的过滤效率，并避免菌膜的形成；发酵终止后，采用3%的氢氧化钠溶液浸泡固定化材质微孔陶瓷柱，再用水冲刷，即可实现固定化材质的再生。
实施例3
（1）选取德式乳杆菌，进行第一次发酵，发酵结束后通过陶瓷膜过滤，得到澄清的含有乳酸和氮源的废液，经蒸汽灭菌处理后用作丙酸发酵培养基。
其中德式乳杆菌发酵培养基成分为：蔗糖8.0%，玉米浆5.0%，酵母浸出粉：2.3%，大豆分离蛋白2.5%，大豆脱脂蛋白2.5%，磷酸氢二钠2.4%，硫酸镁2.0%，发酵条件为厌氧发酵。
（2）选取玉米丙酸杆菌，进行第二次发酵种子培养，培养至种子液OD600值为3时，得到种子液，接种量1%接种到已添加步骤（1）所述的发酵培养基的填充孔径200微米陶瓷环的固定化装置中进行培养，温度42℃下培养70h，完成种子液固定化。
其中玉米丙酸杆菌种子培养基成分为：40g/L酵母抽提物，40 g/L胰蛋白胨大豆肉汤培养基，40 g/L乳酸钠。固定化装置如图1所示，该装置体积1000L，有保温夹套，填充满微孔陶瓷环后还能添加发酵培养基820L。
（3）如图1所示，固定化装置中种子液培养固定化好之后，发酵罐中填充步骤（1）所述发酵培养基，开启泵（1），流速为30 L/min，按箭头方向在固定化装置与发酵罐之间循环流动，20%氢氧化钠调节发酵罐内PH至7.0，控制固定化装置的温度42℃，发酵罐取样测定乳酸浓度为零时停止。其中发酵罐条件为发酵罐体积5000L，搅拌速度40rpm，温度42℃，发酵时间48h。
（4）发酵结束后，开启泵（2），发酵液按实线箭头流入膜分离系统的中空纤维膜组件，将固形物截留在组件内，澄清的丙酸滤液从膜组件上端流出收集。再加入新鲜发酵培养基，反向冲洗中空纤维膜的表面，将截留的固形物洗涤下来，回到发酵罐。
如图1所示，膜分离系统的中空纤维膜组件采用聚偏氟乙烯PVDF为膜材料，该装置由8个并联单元组成，图1将其简化为一个，总和处理量达到148L/min。
（5）上述步骤（4）结束后，立即进入步骤（3），进行批次循环，直至发酵效率明显下降时，大约需要15-18个批次之后，终止发酵。
（6）固定化材料再生及膜组件维护方法，每个批次中空纤维膜过滤后，采用HCL调节纯净水的PH值至2，浸泡膜组件，以此维持膜组件的过滤效率，并避免菌膜的形成；发酵终止后，采用3%的氢氧化钠溶液浸泡固定化材质微孔陶瓷环，再用水冲刷，即可实现固定化材质的再生。
以上所述仅是本发明的具体应用的三个实例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实例做任何简单修改、等同变化与修饰，均仍然属于本发明的技术方案范围之内。

Claims (10)

1.一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于以乳酸发酵菌发酵得到的富含乳酸的发酵废液为丙酸发酵培养基，通过固定化装置、发酵罐和膜分离系统相结合进行发酵-过滤循环交替，实现半连续式二次发酵生产丙酸。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）选取发酵生产乳酸的菌株，进行第一次发酵，发酵结束后通过陶瓷膜过滤，得到澄清含有乳酸和氮源的废液，经蒸汽灭菌处理后用作丙酸发酵培养基；
（2）选取发酵生产丙酸的菌株，进行第二次发酵种子培养，得到种子液，将种子液接种到已添加步骤（1）所述的发酵培养基的固定化装置中进行培养，并完成种子液固定化；
（3）固定化装置中种子液培养固定化好后，发酵罐中填充步骤（1）所述发酵培养基，开启泵（1），发酵液在固定化装置与发酵罐之间循环流动，调整发酵罐内PH，控制固定化装置的温度，发酵罐内取样测定乳酸浓度为零时停止；
（4）发酵结束后，开启泵（2），发酵液流入膜分离系统的中空纤维膜组件，将固形物截留在组件内，澄清的丙酸滤液从膜组件上端流出收集；再加入新鲜发酵培养基，反向冲洗中空纤维膜的表面，将截留的固形物洗涤下来，回到发酵罐；
（5）上述步骤（4）结束后，立即进入步骤（3），进行批次循环，直至发酵效率明显下降时，终止发酵。
3.根据权利要求2所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（1）中第一次发酵菌株包括植物乳杆菌、德式乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸链球菌、乳酸乳球菌、菊糖芽孢乳杆菌、嗜盐四联球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和两岐双歧杆菌。
4.根据权利要求2所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（1）中第一次发酵培养基的成分包括蔗糖1.0%-10.0%，玉米浆1.0%-5.0%，酵母浸出粉0.1%-2.5%，大豆分离蛋白0.1%-2.5%，大豆脱脂蛋白0.1%-2.5%，碳酸氢二钠0.1%-2.5%，硫酸镁0.1%-2.5%；发酵培养条件为厌氧培养。
5.根据权利要求2所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（2）中用于生产丙酸的菌株包括费氏丙酸菌、产丙酸丙酸杆菌、玉米丙酸杆菌、詹氏丙酸杆菌、薛氏丙酸杆菌和反刍月形单胞菌。
6.根据权利要求2所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（2）中种子培养基成分包括酵母抽提物1.0g/L-50.0g/L，胰蛋白胨大豆肉汤1.0g/L-50.0g/L，乳酸钠1.0g/L-50.0g/L。
7.根据权利要求2所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（2）中培养得到的种子液OD600值为3，种子接种量为1%。
8.根据权利要求2所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（2）中固定化装置中填充有孔径50-500微米的微孔陶瓷环、陶瓷粒或陶瓷柱，固定化培养条件为温度28℃-42℃，时间48h-72h。
9.根据权利要求2所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（3）中20%氢氧化钠调节至PH6.0-7.5，循环发酵条件：固定化装置温度28℃-42℃，循环流动流速1L/min-30L/min，发酵罐搅拌速度0-50rpm，温度28℃-42℃，发酵时间48-72h。
10.根据权利要求2所述的一种发酵生产丙酸的方法，其特征在于所述步骤（4）中膜分离系统由一个或多个并联单元组成，膜分离系统中的中空纤维膜为聚偏氟乙烯PVDF。
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