CN100500857C

CN100500857C - 采用无机膜实现微生物原位分离发酵的方法

Info

Publication number: CN100500857C
Application number: CNB2006100153784A
Authority: CN
Inventors: 路福平; 杜连祥; 李涛; 史文玉; 刘逸寒
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: TIANJIN XINXING VETERINARY PHARMACEUTICAL FACTORY
Priority date: 2006-08-21
Filing date: 2006-08-21
Publication date: 2009-06-17
Anticipated expiration: 2026-08-21
Also published as: CN1908176A

Abstract

采用无机膜实现微生物原位分离发酵的方法，属于微生物菌体高密度发酵领域，涉及无机膜分离技术与微生物发酵耦连实现原位分离发酵。它解决了分批补料发酵不能将抑制菌体生长的目标产物或代谢副产物及时分离出去、很难达到很高的菌体浓度和目标产物产量的问题。本发明引入主要由发酵罐，无机膜组件，色谱柱、中空纤维膜组件或萃取装置，补料罐，储液罐和蠕动泵组成的原位分离发酵反应器，将发酵过程中产生的对微生物菌体有严重抑制作用的目标产物或代谢副产物及时从发酵体系中分离出去，有效解除代谢产物对菌体生长的抑制作用，使菌体快速生长，在原位分离发酵中，提高了菌体浓度和目标产物产量，实现了高密度发酵。

Description

采用无机膜实现微生物原位分离发酵的方法

技术领域

本发明是一种新型原位分离发酵技术，属于微生物高密度发酵领域；特别涉及采用无机膜实现微生物原位分离发酵的方法。

背景技术

传统的发酵过程是分批培养过程，菌体生长到一定的程度就停止繁殖，分批培养过程中的生长抑制是由于以下两个方面引起的：(1)基质抑制现象：高浓度的基质有时会对细胞产生抑制作用。高密度发酵的生物量可达60～150g/l，需要投入2～5倍于生物量的基质，然而，高浓度营养对大多数微生物生长不利。按米氏动力学曲线，当营养浓度增加到一定量时，生长显示饱和型动力学曲线，进一步增加底物浓度，就可能发生一种基质抑制区，表现为延滞期的延长，比生长速率降低，细胞得率下降等。(2)产物抑制：如果细胞的代谢产物对细胞有抑制作用，随着代谢产物的积累，细胞的比生长速率将逐渐下降。

针对传统发酵的弊端，目前工厂普遍采用的是补料分批发酵，这种方法一方面可以调节发酵过程中营养物质的浓度，使其适合菌体生长，延长菌体生长的对数期，以提高产物产量；另一方面，还可以减轻由于起始糖浓度过高而发生酵解所产生的副产物对菌体生长带来的毒害作用，所以这种培养方式以广泛应用于多种微生物的高密度培养中。但是分批补料发酵由于不能将抑制菌体生长的目标产物或代谢副产物及时分离出去，因而对于那些发酵代谢产物对菌体有严重抑制作用的菌种来说很难通过分批补料发酵达到很高的菌体浓度和目标产物产量。

采用膜分离技术可以对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、浓缩、提纯及净化，目前已用于发酵结束后产物的分离提取，而在微生物发酵中及时将抑制菌体生长的目标产物或代谢副产物原位分离出去、提高目标产物产量却是当务之急。

发明内容

要解决的技术问题：

本发明的目的在于提供一种利用无机膜分离技术将发酵过程中产生的对微生物菌体有严重抑制作用的目标产物或代谢副产物及时从发酵体系中分离出去，从而有效解除了菌体生长的抑制作用，使菌体快速生长达到很高的浓度和提高目标产物产量的原位分离发酵方法。

技术方案：

分离膜及膜组件包括无机膜和有机膜两种。有机膜不耐高温，不适于灭菌，无机膜与有机膜相比，它具有耐高温高压、机械强度高，耐酸碱性强，易清洗等优点。这些优点为其与发酵罐耦连将抑制菌体生长的目标产物或代谢副产物及时从发酵体系中分离出去而实现原位分离发酵奠定了基础。

本发明是提供一种采用原位分离技术实现原位分离发酵的新型发酵装置和发酵方法。

采用无机膜实现微生物原位分离发酵的方法，是将无机膜分离技术与微生物发酵耦连，通过检测、控制发酵罐中限制菌体快速生长的代谢产物的浓度、进行原位分离发酵；具体做法是在发酵过程中引入无机膜分离装置，构建原位分离发酵反应器，在对数生长中期或后期当发酵罐中菌体的代谢产物达到抑制菌体生长的浓度时，开启这个分离装置，将发酵液通入第一组无机膜组件4，将发酵液中的代谢产物分离出去后，得到浓缩的发酵液、再经膜组件的出口回到发酵罐3，过滤后含有代谢产物的培养基即滤过液经膜组件的夹套出口流到储液灌5由蠕动泵2打入色谱柱、中空纤维膜组件或萃取装置7，对目标代谢产物清除，余下的滤过液再经过第二组无机膜组件8进行除菌，最后返回发酵罐，继续发酵；待发酵正常进行时关闭无机膜分离装置，当发酵罐中抑制菌体的代谢产物不再生成、菌体不再生长时，发酵结束。

为了实施本发明方法我们设计使用了原位分离发酵反应器，其主要由发酵罐3，无机膜组件4、8，色谱柱、中空纤维膜组件或萃取装置7，补料罐1，储液罐5、6，蠕动泵2组成，其中，无机膜组件包括两组，第一组无机膜组件4用于过滤发酵液中对菌体生长不利的代谢产物，第二组无机膜组件8，用于除菌，它们都是由膜管和夹套组成的；整个反应器的连接方式是，采用管路将补料罐1依次与蠕动泵2，发酵罐3，蠕动泵2，第一组无机膜组件4，储液罐5，蠕动泵2，色谱柱(中空纤维膜组件或萃取装置)7，储液罐6，蠕动泵2和第二组无机膜组件8相连。

需要说明的是：

原位分离发酵反应器中，过滤和除菌的第一组无机膜组件4和第二组无机膜组件8采用无机陶瓷膜或不锈钢膜，其膜孔径小于0.2μm。

原位分离发酵反应器中，根据所要除去代谢产物的种类选择相应的色谱柱(或中空纤维膜组件或萃取装置)

采用本发明无机膜分离技术与微生物发酵耦连实现高密度发酵的工艺过程为：

(1)种子培养过程为：菌种经活化后，接到种子培养基中进行种子培养。

(2)发酵培养过程为：将配好的发酵培养基经灭菌冷却后，按照合适的接种量将种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，整个培养过程每隔一段时间取样，测定菌体浓度、碳源浓度，抑制菌体生长的代谢产物的浓度，目的产物的产量。

(3)分批发酵期：控制发酵温度和通气量等参数，发酵初期由于碳、氮源、无机盐组分丰富和少量的抑制菌体的代谢产物，菌体快速生长进入对数生长期。

(4)原位分离发酵期：对数生长中期，菌体生长代谢旺盛，产生了大量抑制菌体生长的代谢的产物，此时开动蠕动泵将发酵液通入第一组无机膜组件，过滤后的发酵液返回发酵罐，滤过液经色谱柱(或中空纤维膜组件或萃取装置)将抑制菌体的代谢产物除去后，再通入第二组无机膜组件，除菌后返回到发酵罐中。

(5)当菌体不再生长，进入平稳期后，直至发酵结束。

有益效果：

本发明提供一种利用无机膜分离技术将发酵过程中产生的对微生物菌体有严重抑制作用的目标产物或代谢副产物及时从发酵体系中分离出去，从而有效解除了菌体生长的抑制作用，使菌体快速生长达到很高的浓度和提高目标产物产量的原位分离发酵方法。

采用本发明提高了菌体的生长速率，并提高了菌体浓度，达到提高目标产物产量的目的。实现高密度培养，提高了产量。

附图说明

图1：为本发明原位分离发酵反应器的示意图。

具体实施方式：

实施例1：P.shermanii产维生素B₁₂原位分离发酵

P.shermanii深层发酵过程中的主要初级代谢产物丙酸对菌体生长有严重的抑制作用，而维生素B₁₂为P.shermanii的胞内次级代谢产物，因而及时的将丙酸从发酵体系中除去，解除丙酸对菌体的抑制作用，实现高密度培养将可以大大提高了维生素B₁₂的产量。

原位分离发酵反应器，主要由发酵罐3，无机膜组件4、8，色谱柱7，补料罐1，储液罐5、6，蠕动泵2组成，其中，无机膜组件包括两组，第一组无机膜组件4，用于过滤发酵液中对菌体生长不利的代谢产物，第二组无机膜组件8，用于除菌，它们都是由膜管和夹套组成的；整个反应器的连接方式是，采用管路将补料罐1依次与蠕动泵2，发酵罐3，蠕动泵2，第一组无机膜组件4，储液罐5，蠕动泵2，色谱柱7，储液罐6，蠕动泵2和第二组无机膜组件8相连。

在对数生长期中期当发酵罐中菌体的代谢产物丙酸达到抑制菌体生长的浓度时，开启这个分离装置，将发酵液通入第一组无机膜组件4，将发酵液中的代谢产物分离出去后，得到浓缩的发酵液、再经膜组件的出口回到发酵罐3，过滤后含有代谢产物丙酸的培养基即滤过液经膜组件的夹套出口流到储液灌5，由蠕动泵2打入色谱柱7，对目标代谢产物清除，余下的滤过液再经过第二组无机膜组件8进行除菌，最后返回发酵罐，继续发酵；待发酵正常进行时关闭无机膜分离装置，当发酵罐中抑制菌体的代谢产物不再生成、菌体不再生长时，发酵结束。其中实验采用了7L发酵罐3，购自上海高机公司，第一组无机膜组件4和第二组无机膜组件8采用无机陶瓷膜组件，购自安徽世杰膜工程有限公司，孔径0.2μm。阴离子交换树脂201x7购自南开大学化工厂。

具体做法是：

(1)种子培养基：葡萄糖35g，玉米浆20g(干物)，硫酸铵5g，磷酸二氢钾4g，氯化钴0.005g，溶于000mL水中，调pH6.8-7.0后加碳酸钙2g。

发酵培养基：葡萄糖55g，玉米浆35g(干物)，硫酸铵5g，磷酸二氢钾8g，氯化钴0.01g，溶于1000mL水中，调pH6.8-7.0。发酵中，残糖降至25g/L时，加入0.01g/L前体5，6二甲基苯并咪唑。

(1)种子前培养

取生长好的固体种子管，加入10mL生理盐水，刮动穿刺层，制备菌悬液后接入准备好的液体种子培养基内，于30±1℃静置培养48h

(2)种子活化培养

将前培养的种子以10％的接种量接到新鲜液体种子培养基内，于30±1℃静置培养48h。

(4)发酵前准备

首先将发酵罐和补料罐进行空罐灭菌，无机膜组件及其与发酵罐相连的管路高压灭菌。然后将配好的新鲜发酵培养基装入发酵罐，实罐灭菌后将管路连接好。

(5)接种

在火焰圈的保护下，以10％的接种量接种到7L发酵罐中，装液量为5L，培养温度30℃。

(6)分批发酵阶段

发酵前期采用静止分批发酵，控制好发酵温度30℃，每隔4h取样，测定菌体的干重，残余葡萄糖含量，丙酸含量，并计算菌体的比生长速率。

(7)原位分离发酵阶段

菌体经过延滞期后迅速生长，丙酸含量升高，当发酵液中的丙酸含量达到10g/L时，开动蠕动泵将发酵液通入第一组无机陶瓷膜组件，滤过液经阴离子交换树脂柱将丙酸等代谢产物吸附后，再通入第二组无机陶瓷膜组件，过滤除菌后通入发酵罐；每隔2h测定丙酸含量、菌体干重、残余葡萄糖含量，并计算菌体比生长速率；当发酵罐中的丙酸含量低于5g/L，菌体迅速生长时，停止蠕动泵，进行分批发酵。同时每隔2h测定丙酸含量。当菌体的生长再次受到抑制，即丙酸含量达到10g/L时，重复上面的操作。当发酵液中残糖降至25g/L时加入0.01g/L前体5，6二甲基苯并咪唑。

结果表明，与分批发酵相比菌体浓度大大增加，菌体干重由13.5g/L提高到35.99g/L，提高了1.67倍，维生素B₁₂的产量由现有分批发酵的33.5mg/L增加到63.1mg/L，提高了0.88倍，维生素B₁₂的产量明显提高。

实施例2：

凝结芽孢杆菌Bacilluscogulans TQ33的原位分离培养

凝结芽孢杆菌发酵过程中产生的乳酸，对菌体的生长有强烈的抑制作用，因而及时将乳酸从发酵液中分离出去，将可以大大提高菌体和芽孢的浓度。实验采用的7L发酵罐购自上海高机公司，无机陶瓷膜组件购自安徽世杰膜工程有限公司，孔径0.2μm。阴离子交换树脂D354购杭州争光树脂有限公司。

1：培养基

(1)种子培养基(g/L)

蛋白胨10.0，酵母膏10.0，葡萄糖60.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，CaCO₃ 10.0。pH7.2-7.4。

(2)发酵培养基(g/L)

蛋白胨10.0，酵母膏10.0，葡萄糖6.0，MgSO₄·7H₂O 1.0，K₂HPO₄ 2.0，MnSO₄ 50mg/L pH 7.0。

(3)GYP培养基(g/L)

蛋白胨5，酵母膏10，葡萄糖10，牛肉膏2，盐溶液(1mL盐溶液中含有：MgSO₄·7H₂O 40mg，MnSO₄ 2mg，FeSO₄·7H₂O 2mg，NaCl 2mg。)5mL，吐温80溶液(50mg/mL水溶液)10mL，CaCO₃ 5g，琼脂20g。pH6.8。

2：培养过程

(1)0～12h，为延滞期，采用分批培养。

(2)12～18h，为对数生长前期，乳酸积累较少，采用补料分批培养。流加葡萄糖与酵母膏混合液[m(葡萄糖)∶m(酵母膏)＝6∶1]，控制葡萄糖质量浓度在3.0～6.0g/L，同时，流加2mol/L的NaOH溶液以维持pH约7.0。

(3)18～24h，为对数生长后期，乳酸等代谢产物已积累较多，当发酵罐中的乳酸含量达到5g/L，此时开动蠕动泵将发酵液通入第一组无机陶瓷膜组件，滤过液经阴离子交换树脂将乳酸等代谢产物吸附后，再通入第二组无机陶瓷膜组件，过滤除菌后通入发酵罐；每隔2h测定乳酸酸含量、菌体干重、残余葡萄糖含量，并计算菌体比生长速率；当发酵罐中的乳酸含量低于5g/L，菌体迅速生长时，停止蠕动泵，进行分批发酵。同时每隔2h测定乳酸含量。当菌体的生长再次受到抑制时，重复上面的操作。

(4)24～48h，为稳定期，采用分批培养。

3：结果

通过原位分离培养，菌体浓度达到了1.8¹⁰cfu/mL的高密度。24h后采用分批培养，芽孢迅速形成。由于菌体密度高，自溶较严重。48h发酵结束时，总菌浓度为1.6×10¹⁰cfu/mL，芽孢浓度为1.2×10¹⁰cfu/mL。

其它同实施例1。

实施例3：

裂褶菌产胞外多糖原位分离发酵

裂褶菌胞外多糖是一种水溶性的β-D-葡聚糖，因其具有好的水溶性和β-(1-6)分支的β—(1-3)-D葡萄糖的独特的活性结构，在调节免疫功能，抗肿瘤，抗辐射等方面有显著的疗效。裂褶菌胞外多糖分子量40kD左右.发酵液中裂褶菌胞外多糖的积累增加发酵液的粘度，不利于菌体的生长，因而及时将多糖分离出去，可以有利于提高胞外多糖的产量。

实验采用的7L发酵罐购自上海高机公司，无机不锈钢膜组件购自上海凯能高科技工程有限公司，孔径0.2μm。大孔吸附树脂AB-8购自南开大学化工厂。

1：培养基

(1)斜面种子培养基：PDA培养基(酵母浸膏粉含量5g/L).

(2)种子液体培养基：葡萄糖35g，酵母浸膏粉3g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，自来水配制定容至1L，除酵母浸膏粉外其余均为分析纯，pH自然。

(3)发酵培养基：葡萄糖45g，酵母浸膏粉3g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，自来水配制定容至1L，除酵母浸膏粉外其余均为分析纯，pH自然。

2：发酵过程

(1)0-16h分批发酵

以10％接种量接种到7L发酵罐，培养温度27℃，pH自然，初始通气量100L/h，搅拌转速200r/min，初期菌体菌体开始增殖，多糖开始分泌。

(2)16-160h原位分离发酵

菌体经过延滞期后迅速生长，多糖含量迅速增加，多糖造成发酵液粘度上升，当发酵液中溶解氧低于20％时，开动蠕动泵将发酵液通入第一组无机不锈钢膜组件，滤过液经对裂褶菌胞外多糖有特异吸附功能的大孔吸附树脂柱将多糖吸附后，再通入第二组无机不锈钢膜组件，过滤除菌后通入发酵罐，并补充损失的营养成分。

(3)发酵液中的胞外多糖不再增加，菌体不再生长时发酵结束。

发酵结束胞外粗多糖的得率达到6.4g/L，比分批发酵的2.7g/L有较大的提高。

其它同实施例1。

实施例4：裂褶菌产胞外多糖原位分离发酵

裂褶菌胞外多糖是一种水溶性的β-D-葡聚糖，因其具有好的水溶性和β-(1-6)分支的β—(1-3)-D葡萄糖的独特的活性结构，在调节免疫功能，抗肿瘤，抗辐射等方面有显著的疗效。裂褶菌胞外多糖分子量40kD左右。发酵液中裂褶菌胞外多糖的积累增加发酵液的粘度，降低了发酵液的溶氧，不利于菌体的生长，因而及时将多糖分离出去，可以有利于提高胞外多糖的产量。实验采用的7L发酵罐购自上海高机公司，无机不锈钢膜组件购自上海凯能高科技工程有限公司，孔径0.2μm。中空纤维膜组件7(截留分子量小于40kD)购自天津膜天膜工程有限公司。

1：培养基

(1)斜面种子培养基：PDA培养基(酵母浸膏粉含量5g/L).

(2)种子液体培养基：葡萄糖35g，酵母浸膏粉3g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，自来水配制定容至1L，除酵母浸膏粉外其余均为分析纯，pH自然。

(3)发酵培养基：葡萄糖45g，酵母浸膏粉3g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，

自来水配制定容至1L，除酵母浸膏粉外其余均为分析纯，pH自然。

2：发酵过程

(1)0-16h分批发酵

(2)16-160h原位分离发酵

菌体经过延滞期后迅速生长，多糖含量迅速增加，多糖造成发酵液粘度上升，溶解氧降低，当发酵液中溶解氧低于20％时，开动蠕动泵。将发酵液通入第一组无机不锈钢膜组件，滤过液经截留分子量小于40kD的中空纤维膜组件后，浓缩液用于多糖的分离，滤过液再通入第二组无机不锈钢膜组件，过滤除菌后通入发酵罐。

(3)当发酵液中的胞外多糖不再增加，菌体不再生长时发酵结束。

其它同实施例1。

实施例5：丁醇原位分离发酵

今年来，石油资源紧缺越来越明显，以及由于化石燃料的大量消耗向大气中排放的CO₂的积累加剧，因此可再生生物能源生物柴油成为研究热点，但是生物柴油存在着点火性能差，有黑烟产生等缺点，如果在其中添加丁醇，就能改善点火性能和不产生黑烟，显著的改善作为燃料的性能。从这些视点出发，近年来重新审视作为古老的工业技术丙酮丁醇发酵在世界各国日趋活跃。

丙酮丁醇发酵的终产物抑制水平极强，发酵液中丁醇的浓度达到3g/L时，就已经出现抑制作用。如果丁醇浓度超过此浓度时，发酵速率急剧下降，因此需要及时将丁醇从发酵液中分离出去。实验采用的7L发酵罐购自上海高机公司，无机不锈钢膜组件购自上海凯能高科技工程有限公司，孔径0.2μm。具体的发酵过程：

(1)分批发酵阶段，实时检测发酵液中丁醇的浓度。

(2)原位分离发酵阶段，菌体经过延滞期后迅速生长，丁醇含量升高，当发酵液中丁醇的浓度超过3g/L时，开动蠕动泵2将发酵液通入第一组无机不锈钢膜组件4，滤过液经吸过萃取装置7，其中的生物柴油将丁醇萃取出去，水相的培养液再通入第二组无机不锈钢膜组件8，过滤除菌后通入发酵罐3；每隔2h测定发酵罐中发酵液中丁醇的含量、菌体的干重、残余葡萄糖含量，并计算菌体的比生长速率；当发酵罐中的丁醇含量低于3g/L，菌体迅速生长时，停止真空泵，进行分批发酵。当发酵液中丁醇的浓度超过3g/L时，菌体生长再次受到抑制时，重复上面的操作。

(3)当发酵液中丁醇的含量不再增加，菌体不再生长时，发酵结束。

发酵结束，丁醇的含量达到70g/L，较分批发酵的30g/L有较大的提高。

其它同实施例1。

Claims

1.采用无机膜实现微生物原位分离发酵的方法，其特征在于将无机膜分离技术与微生物发酵耦连，通过检测、控制发酵罐中限制菌体快速生长的代谢产物的浓度、进行原位分离发酵；具体做法是在发酵过程中引入无机膜分离装置，构建原位分离发酵反应器，在对数生长中期或后期当发酵罐中菌体的代谢产物达到抑制菌体生长的浓度时，开启这个分离装置，将发酵液通入第一组无机膜组件(4)，将发酵液中的代谢产物分离出去后，得到浓缩的发酵液、再经膜组件的出口固到发酵罐(3)，过滤后含有代谢产物的培养基即滤过液经膜组件的夹套出口流到储液灌(5)由蠕动泵(2)打入色谱柱、中空纤维膜组件或萃取装置(7)，对目标代谢产物清除，余下的滤过液再经过第二组无机膜组件(8)进行过滤除菌，最后返回发酵罐，继续发酵；待发酵正常进行时关闭无机膜分离装置，当发酵罐中抑制菌体的代谢产物不再生成、菌体不再生长时，发酵结束。

2.实施权利要求1的方法所采用的原位分离发酵反应器，其特征在于主要由发酵罐(3)，无机膜组件(4、8)，色谱柱、中空纤维膜组件或萃取装置(7)，补料罐(1)，储液罐(5、6)，蠕动泵(2)组成，其中，无机膜组件包括两组，第一组无机膜组件(4)，用于过滤发酵液中对菌体生长不利的代谢产物，第二组无机膜组件(8)，用于除菌，它们都是由膜管和夹套组成的；整个反应器的连接方式是，采用管路将补料罐(1)依次与蠕动泵(2)，发酵罐(3)，蠕动泵(2)，第一组无机膜组件(4)，储液罐(5)，蠕动泵(2)，色谱柱、中空纤维膜组件或萃取装置(7)，储液罐(6)，蠕动泵(2)和第二组无机膜组件(8)相连。

3.根据权利要求2所述的实施权利要求1的方法所采用的原位分离发酵反应器，其特征在于过滤和除菌的第一组无机膜组件(4)和第二组无机膜组件(8)采用无机陶瓷膜或不锈钢膜，其膜孔径小于0.2μm。

4.根据权利要求2所述的实施权利要求1的方法所采用的原位分离发酵反应器，其特征在于根据所要除去代谢产物的种类选择相应的色谱柱、中空纤维膜组件或萃取装置。