CN110331091A - 利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统和方法，系统包括：通过管道依次连接的空气压缩机、反应器、层析柱和洗脱装置；反应器包括发酵瓶、对发酵瓶中物质进行加热的加热装置和对发酵瓶中物质进行搅拌的搅拌装置；在反应器内和层析柱相连通的管道上设置有第一蠕动泵和第一管路开关，管道底部还设置有过滤纱布；层析柱下端设置有第五管路开关和第六管路开关；洗脱装置包括洗脱瓶一和洗脱瓶二等。本发明将树脂吸附的异位分离技术用于桑黄发酵产桑黄素过程中，为桑黄发酵产桑黄素以及桑黄素的分离提供了一种新思路，此操作不仅可以提升桑黄素的产量，还能简化后续分离工艺，降低成本，具有很强的实用性。
Description
技术领域
本发明属于食药用菌活性成分提取技术领域，具体涉及一种利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统和方法。
背景技术
桑黄又名桑耳、胡孙眼、梅树菌，是一种名贵的多年生大型食药用菌，属担子菌亚门(Basidiomycota)、层菌纲(Hymenomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)、针层孔菌属(Phelliunus)，它主要寄生于桑树、桦树、杨树等阔叶树的树干上，有“森林黄金”的美称。据目前研究表明，桑黄中所含有各种化学物质不下百种，并且这些化学物质大多数都有药理活性，能够治疗多种疾病，有良好的应用和开发前景。
桑黄素属于多酚类化合物，此类化合物可以作为天然色素，而且具有很好的抗氧化、清除自由基、抗肿瘤和降血糖的药用作用，具有很高的利用价值。该物质存在于植物或微生物中，但从这些材料中进行提取时，产生的桑黄素对机体本身也存在反馈抑制作用，而且当桑黄素浓度过大时，也无法排除可以导致机体过早衰亡的情况。目前对于机体合成桑黄素的代谢通路还没有明确，采用分子生物学手段无法解决这一难题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统和方法，将树脂吸附的异位分离技术用于桑黄发酵生产桑黄素过程中，为桑黄发酵生产桑黄素以及桑黄素的分离提供了一种新思路。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统，包括：通过管道依次连接的空气压缩机、反应器、层析柱和洗脱装置；
反应器包括发酵瓶、对发酵瓶中物质进行加热的加热装置和对发酵瓶中物质进行搅拌的搅拌装置；在反应器内和层析柱相连通的管道上设置有第一蠕动泵和第一管路开关，管道底部还设置有过滤纱布；层析柱下端设置有第五管路开关和第六管路开关；
洗脱装置包括洗脱瓶一和洗脱瓶二，洗脱瓶一通过三通管分别与层析柱和洗脱瓶二相连；三通管上通向洗脱瓶一方向设置有第三管路开关；三通管上通向洗脱瓶二方向设置有第四管路开关。
进一步地，加热装置包括放置于发酵瓶内的热电偶、包覆在发酵瓶外壁上的加热夹套以及与热电偶连接的加热控制器。
进一步地，在空气压缩机和反应器相连通的管道上设置有空气流量计。
进一步地，在空气压缩机和反应器相连通的管道上设置有0.2μm空气过滤器。
进一步地，三通管上通向洗脱瓶一方向设置有0.2μm空气过滤器；三通管上通向洗脱瓶二方向设置有0.2μm空气过滤器。
进一步地，洗脱瓶一和洗脱瓶二上设置有与外界相通的管道，管道上设置有0.45μm空气过滤器。
采用上述系统生产桑黄素的方法，包括以下步骤：
(1)发酵培养：向反应器中加入液体培养基，将桑黄种子液按体积百分比为8-12％的接种量接种到反应器中进行发酵，发酵条件为26-28℃，160-180r/min，通气量为0.5-0.8vvm；
(2)树脂吸附：当发酵至第6-7天时，将发酵液通过第一管路开关和第一蠕动泵，以0.5-1.5mL/min的流速泵入装有ADS-17大孔树脂的层析柱中，吸附时间为22-26h，然后第一管路开关和第一蠕动泵，打开第二管路开关、第二蠕动泵、第三管路开关和第六管路开关，用超纯水就会对树脂进行冲洗，洗出残余发酵液，然后关闭第三管路开关和第六管路开关，打开第四管路开关和第五管路开关，用体积浓度为65-75％的乙醇溶液就会对树脂进行洗脱至洗脱后的液体为无色，循环上述洗脱过程至发酵第9天，结束发酵；其中，采用体积浓度为70％的乙醇溶液进行洗脱时的流速为3-5mL/min；
(3)合并洗脱后的液体，除去乙醇，然后经真空冷冻干燥，制得桑黄素。
进一步地，步骤(1)中液体培养基由以下组分组成：葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、蛋白胨2g、酵母粉2g和去离子水1L。
进一步地，步骤(1)中接种量为10％，发酵温度为发酵条件为28℃，180r/min，通气量为0.66vvm。
进一步地，步骤(2)中当发酵至第7天时开始树脂吸附过程。
进一步地，步骤(2)中发酵液泵入层析柱中的流速为1mL/min；乙醇溶液的体积浓度为70％，洗脱流速为5mL/min。
本发明提供的利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统和方法，具有以下有益效果：
本发明将树脂吸附的异位分离技术用于桑黄发酵产桑黄素过程中，为桑黄发酵产桑黄素以及桑黄素的分离提供了一种新思路，此操作不仅可以提升桑黄素的产量，还能简化后续分离工艺，降低成本，具有很强的实用性。
附图说明
图1为桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统；其中，1为空气压缩机，2为层析柱，3为发酵瓶，4为热电偶，5为加热夹套，6为加热控制器，7为磁力搅拌器，8为洗脱瓶一，9为洗脱瓶二，10为第一蠕动泵，11为第一管路开关，12为第二管路开关，13为第二蠕动泵，14为第三管路开关，15为第四管路开关，16为第五管路开关，17为第六管路开关，18为0.45μm空气过滤器，19为0.2μm空气过滤器，20为过滤纱布，21为空气流量计。
图2为发酵滤液与桑黄素标准液紫外图谱。
图3为桑黄素标准曲线图。
图4为桑黄菌体发酵过程的生长曲线图。
图5为采用本发明系统对桑黄进行发酵后菌丝的宏观图。
图6为采用本发明系统对桑黄进行发酵后菌丝的微观显微图。
具体实施方式
实施例1
一种利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统，如图1所示，包括：通过管道依次连接的空气压缩机1、反应器、层析柱2和洗脱装置。
为了测定空气进入反应器中的含量，在空气压缩机1和反应器相连通的管道上设置了空气流量计21；为了使进入反应器内的空气不受污染，在空气压缩机1和反应器相连通的管道上还设置了0.2μm空气过滤器。
上述反应器包括发酵瓶3、对发酵瓶3中物质进行加热的加热装置和对发酵瓶3中物质进行搅拌的搅拌装置；加热装置包括放置于发酵瓶内的热电偶4、包覆在发酵瓶3外壁上的加热夹套5以及与热电偶4连接的加热控制器6；搅拌装置为磁力搅拌器7，发酵瓶3放置于磁力搅拌器7上。
为了使得将反应器内的物质输送到层析柱2中，在反应器内和层析柱2相连通的管道上设置有第一蠕动泵10和第一管路开关11，管道底部还设置有过滤纱布20。
上述洗脱装置包括洗脱瓶一8和洗脱瓶二9，洗脱瓶一8通过三通管分别与层析柱2和洗脱瓶二9相连；三通管上通向洗脱瓶一8方向设置有第三管路开关14和0.2μm空气过滤器19；三通管上通向洗脱瓶二9方向设置有第四管路开关15和0.2μm空气过滤器19。
反应瓶3、洗脱瓶一8和洗脱瓶二9并非完全密封，还与外界相通，因此其上还设置有管道，管道上设置有0.45μm空气过滤器18。
在吸附过程中，层析柱2下端设置有第五管路开关16和第六管路开关17，层析柱2下面还放置有用于接收上柱液或解析液的容器。
采用上述系统生产桑黄素的方法，包括以下步骤：
(1)种子液的制备：取生长良好的桑黄平板，用灭菌后的的打孔器，打取直径为0.5cm生长一致的菌饼5块，加入到含有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，恒温28℃，转速180r/min，培养7天，然后用高速匀浆机将菌丝球打碎，制得种子液；
其中，桑黄购于中国农业科学研究院菌种保藏中心，编号为ATCC36121；
液体培养基由以下组分组成：葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、蛋白胨2g、酵母粉2g和去离子水1L；
(2)发酵培养：将种子液按体积百分比为10％的接种量接种到发酵瓶3中，两个发酵瓶3装液量均为1.5L，然后采用加热控制器20控制热电偶4的温度为28℃，将磁力搅拌器调制转速为180r/min(2档)，通过空气流量计调节空气压缩机1向发酵瓶3输送的压缩空气通气量为0.66vvm，在此条件下对种子液进行培养，培养期间反应器后面的部件均不工作，培养7天后，打开第一管路开关11和第一蠕动泵9，使发酵液以流速为1mL/min从发酵瓶3中进入装有30g ADS-17大孔树脂的层析柱2中，ADS-17大孔树脂对发酵液进行吸附，吸附24h后，关闭第一管路开关11和第一蠕动泵9，打开第二管路开关12、第二蠕动泵13、第三管路开关14和第六管路开关17，洗脱瓶一8中的超纯水就会对树脂进行冲洗，洗出残余发酵液，冲洗后的液体会通过第六管路开关17回到发酵瓶3中，然后关闭第三管路开关14和第六管路开关17，打开第四管路开关15和第五管路开关16，洗脱瓶二9中装的体积浓度为70％的乙醇溶液就会对树脂进行洗脱，流速为5mL/min，直至洗脱后的液体为无色，洗脱后的液体(解析液)通过第五管路开关16流入层析柱2下面的容器(如烧杯)中；如此循环直至发酵时间为9天时，结束；只有当发酵时间为7-9天时便可对发酵液中的桑黄素进行分离，才能富集最大量的桑黄素，在第7天分离效果最佳；
(3)合并解析液，将解析液置于旋转蒸发仪上，除去乙醇，然后进行真空冷冻干燥，制得桑黄素纯品。
上述提取方法获得的桑黄素纯品的核磁共振波谱分析数据如表1所示，化合物碳原子编号见分子式：
表1核磁共振波谱数据
为了明确桑黄在生物反应器中的生长情况，在空气压缩机左侧还设置了一个反应器，在相同条件下对桑黄进行发酵，此处作为空白对照组，上述方法为实验组，并对发酵过程做如下检测：
1、对空白对照组中发酵过程菌丝重量(DCW)、桑黄素含量(Phelligridin LA)、pH值、残糖(Residual sugar)和乳酸(Lactic acid)进行测定，制作生长曲线。
(1)菌丝重量的测定方法为：取发酵液，用滤纸除去发酵液中的菌丝球，仅留菌丝，将菌丝在60℃烘干至恒重，称量菌丝重量。
(2)发酵液中桑黄素含量的测定方法如下：
由于桑黄素的化学结构上具有不饱和的共轭结构，在紫外区有较强的吸收，因此桑黄素含量的测定可以直接采用紫外吸收法测定。具体过程为：称取纯化的桑黄素20mg，用70％乙醇溶液溶解并定容于50mL容量瓶中，作为标准液。吸取桑黄素标准液200μL加入70％乙醇1.8mL混匀，扫描300nm-600nm的光谱，并记录最大吸收波长，然后准确吸取发酵滤液200μL，同上方法测量其紫外光谱，比较发酵滤液紫外吸收图谱与桑黄素标准液紫外吸收图谱，如果图谱的最大吸收波长相似，则可以将桑黄素标准液的最大紫外吸收波长作为发酵液中桑黄素测量最佳的波长。
标线制作：准确吸取桑黄素(LA)溶液0、20、50、100、200、300μL，置于石英比色皿中，加入70％乙醇至2.0mL，混匀，在最大吸收波长处测其吸光度，以桑黄素的实际浓度(X)对吸光度(Y)线性回归，得其回归方程。
发酵滤液中桑黄素测量：取发酵滤液100μL，加入1.9mL 70％乙醇测量其在最佳吸收波长处的吸光度，按回归方程计算发酵液中的桑黄素含量。
发酵滤液和桑黄素标准液的全波长扫描结果见图2。由图2可知，发酵滤液在300-600nm之间的紫外吸收图谱与桑黄素纯品相似，发酵液的最大吸收为373nm，桑黄素纯品的最大吸收为365nm，因此可以选择365nm作为发酵液中桑黄素测定的波长。
以吸光度对桑黄素纯品浓度作标准曲线，结果见图3。由图3可知经线性回归得到吸光度与发酵液桑黄素浓度之间的方程为y＝111.67x-1.4097，R2＝0.999，测得发酵液在365nm下的紫外吸光度，带入方程可得发酵液中的桑黄素含量。
(3)pH值用梅特勒pH计进行测量。
(4)残糖和乳酸测定方法为：取发酵液100μL稀释100倍后，取25μL样品液加入到生物传感分析仪，分别测量其葡萄糖和乳酸的含量，记录含量。
根据上述测定方法制作的生长曲线如图4所示，由图4可知，在0-24h，桑黄菌处于生长适应期，菌丝重量和桑黄素含量并无明显变化，发酵液残糖、乳酸和pH基本不变。从第24-216h，桑黄菌体开始快速生长，菌丝和桑黄素含量快速增加，残糖和乳酸快速下降，但pH有下降趋势，变化不大。从216-288h，残糖跌为0，营养物质耗尽，菌丝开始自溶，菌丝量开始减少，由于菌丝自溶导致胞内的桑黄素也被释放到发酵液中，桑黄素含量继续增加，有机酸和铵态氮导致pH下降。发酵过程中发酵液颜色变化明显，由混浊、浅黄色(24h之前)→稍清浅黄色→澄清、棕黄色黄色(126h)→浑浊、棕褐色(288h)。综合菌丝生长以及胞外黄酮产量考虑，桑黄菌在自制反应器的发酵的最佳周期为216h。从图4还可以看出桑黄菌的生长曲线为S曲线，残糖为反S曲线，桑黄素LA随桑黄菌菌丝生长一起增加，当菌丝生长达到最大后，桑黄素还在继续增加，说明桑黄菌菌丝生长和桑黄素的生产为部分生长偶联型。因此开始分离桑黄菌发酵液中桑黄素LA的时间为第7天。
此外，比较最终发酵结束后菌丝干重和桑黄素含量可知，实验组与对照组的菌丝干重相差不大，说明过柱后对菌丝的生长不会产生较大影响，而实验组桑黄素含量却比对照组高2.14倍，说明大孔树脂分离发酵液后的桑黄素后，解除了桑黄素对桑黄菌体的反馈抑制作用，使得桑黄菌体继续朝着产桑黄素方向进行。
2、在实施例1发酵过程中，取不同时间段的发酵液，测定发酵液中菌丝重量和桑黄素含量，并对实验组桑黄素做不同时间的分离操作。
通过测定菌丝重量和发酵液中桑黄素含量可知，不同时间分离桑黄素后，实验组中的菌丝重量与对照组相差不大，说明桑黄素对菌体生长没有明显的抑制作用。当发酵液中桑黄素浓度在0.83mg/mL内时，桑黄素产量会有所增加，但当发酵液中桑黄素浓度大于1.67mg/mL之后，桑黄菌体合成桑黄素的速度受到抑制，当发酵液中桑黄素浓度大于3.35mg/mL之后，桑黄菌体合成桑黄素的能力完全被抑制。由此可知，当桑黄发酵至第7天时可以分离桑黄素，这与上述生长曲线与代谢产物的关系中的结果一致。因此，确定本发明开始分离桑黄菌发酵液中桑黄素LA的时间为第7天。
3、将采用本发明系统发酵桑黄素与采用发酵罐对桑黄素进行发酵进行对比，比较发酵结束后的菌丝形态，其本发明菌丝宏观菌丝图见图5，微观显微图见图6。
由图5和图6可知，采用本发明系统发酵桑黄素得到的菌丝团与采用发酵罐得到的菌丝团不同，这是由于本发明反应器中采用磁力搅拌器进行搅拌，该旋转力与发酵罐中的搅拌桨相比，前者剪切力明显小得多。采用本发明系统发酵桑黄素得到的菌丝为絮状菌丝，将其作为菌种发酵非常方便，不需要对菌丝进行打碎，因此对其进行分批发酵时非常方便。
Claims (10)
1.一种利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统，其特征在于，包括：通过管道依次连接的空气压缩机、反应器、层析柱和洗脱装置；
反应器包括发酵瓶、对发酵瓶中物质进行加热的加热装置和对发酵瓶中物质进行搅拌的搅拌装置；在反应器内和层析柱相连通的管道上设置有第一蠕动泵和第一管路开关，管道底部还设置有过滤纱布；层析柱下端设置有第五管路开关和第六管路开关；
洗脱装置包括洗脱瓶一和洗脱瓶二，洗脱瓶一通过三通管分别与层析柱和洗脱瓶二相连；三通管上通向洗脱瓶一方向设置有第三管路开关；三通管上通向洗脱瓶二方向设置有第四管路开关。
2.根据权利要求1所述的利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统，其特征在于，加热装置包括放置于发酵瓶内的热电偶、包覆在发酵瓶外壁上的加热夹套以及与热电偶连接的加热控制器。
3.根据权利要求1所述的利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统，其特征在于，在空气压缩机和反应器相连通的管道上设置有空气流量计。
4.根据权利要求1所述的利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统，其特征在于，在空气压缩机和反应器相连通的管道上设置有0.2μm空气过滤器。
5.根据权利要求1所述的利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统，其特征在于，三通管上通向洗脱瓶一方向设置有0.2μm空气过滤器；三通管上通向洗脱瓶二方向设置有0.2μm空气过滤器。
6.根据权利要求1所述的利用桑黄发酵与树脂分离耦合生产桑黄素的系统，其特征在于，洗脱瓶一和洗脱瓶二上设置有与外界相通的管道，管道上设置有0.45μm空气过滤器。
7.采用权利要求1-6任一项所述的系统生产桑黄素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发酵培养：向反应器中加入液体培养基，将桑黄种子液按体积百分比为8-12％的接种量接种到反应器中进行发酵，发酵条件为26-28℃，160-180r/min，通气量为0.5-0.8vvm；
(2)树脂吸附：当发酵至第6-7天时，将发酵液通过第一管路开关和第一蠕动泵，以0.5-1.5mL/min的流速泵入装有ADS-17大孔树脂的层析柱中，吸附时间为22-26h，然后第一管路开关和第一蠕动泵，打开第二管路开关、第二蠕动泵、第三管路开关和第六管路开关，用超纯水就会对树脂进行冲洗，洗出残余发酵液，然后关闭第三管路开关和第六管路开关，打开第四管路开关和第五管路开关，用体积浓度为65-75％的乙醇溶液就会对树脂进行洗脱至洗脱后的液体为无色，循环上述洗脱过程至发酵第9天，结束发酵；其中，采用体积浓度为70％的乙醇溶液进行洗脱时的流速为3-5mL/min；
(3)合并洗脱后的液体，除去乙醇，然后经真空冷冻干燥，制得桑黄素。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中液体培养基由以下组分组成：葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、蛋白胨2g、酵母粉2g和去离子水1L。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中接种量为10％，发酵温度为发酵条件为28℃，180r/min，通气量为0.66vvm。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中当发酵至第7天时开始树脂吸附过程，发酵液泵入层析柱中的流速为1mL/min；乙醇溶液的体积浓度为70％，洗脱流速为5mL/min。
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